Abstract
Forstå mekanismene som molekylære motorer koordinere sine aktiviteter for å transportere vesikulær last innen nevroner krever kvantitativ analyse av motor / laste foreninger på enkelt vesikkel nivå. Målet med denne protokollen er å bruke kvantitative fluorescens mikros å korrelere ("kart") posisjonen og retningen på bevegelsen av levende lasten til sammensetning og relative mengder av motorer i forbindelse med samme last. "Cargo mapping" består av levende avbildning av fluorescensmerkede last beveger seg i axoner dyrket på microfluidic enheter, etterfulgt av kjemisk fiksering under opptak av levende bevegelse, og påfølgende immunfluorescens (IF) farging av nøyaktig samme aksonale regioner med antistoffer mot motorer. Colocalization mellom laster og tilhørende motorer vurderes ved å tildele underpiksel posisjonskoordinater til motor og laste kanaler, ved å montere Gaussian funksjoner til diffraksjon-liMited punkt spredt funksjoner som representerer individuelle fluorescerende punktkilder. Faste laste- og motor bildene blir deretter lagt til plott av last bevegelse, for å "kartlegge" dem til sine spores baner. Styrken i denne protokollen er kombinasjonen av levende og IF data for å spille inn både transport av vesikulær last i levende celler og for å bestemme motorene knyttet til disse eksakt samme blemmer. Denne teknikken seirer tidligere utfordringer som bruker biokjemiske metoder for å bestemme den gjennomsnittlige motor sammensetning av renset heterogene bulk vesikkel populasjoner, da disse metodene ikke avsløre komposisjoner på enkelt bevegelige laster. Videre kan denne protokollen kan tilpasses for analyse av andre transport og / eller smugler baner i andre celletyper for å korrelere bevegelsen av individuelle intracellulære strukturer med deres proteinsammensetning. Begrensninger av denne protokollen er relativt lav gjennomstrømming på grunn av lave transfeksjonseffektiviteter av kultivertprimære nevroner og et begrenset synsfelt tilgjengelig for bildebehandling med høy oppløsning. Fremtidige anvendelser kan inkludere metoder for å øke antallet av neuroner som uttrykker fluorescensmerkede last.
Introduction
Intracellulær transport er kritisk i alle celletyper for levering av proteiner, membraner, organeller, og signalmolekyler til forskjellige cellulære domener 1. Nerveceller er svært spesialiserte celler med lange, polariserte anslag som kritisk avhengige av intracellulær transport av essensielle laster for deres langdistanse levering til ulike aksonale mikroområder. Denne transporten er mediert av kinesins og dyneins - to store familier av molekylære motor proteiner - som binder seg til last og spore langs polariserte mikrotubuli i anterograd og retrograd retninger, henholdsvis. Mens retrograd bevegelse er hovedsakelig mediert av dynein, er bevegelse i antero retning tilrettelagt av en stor, funksjonelt mangfoldig familie av kinesin motorer. Følgelig kunne antero transport av aksonale last være mediert av ulike familiemedlemmer av kinesin super 1-5. Selv om noen laster flytte vedvarende i begge retninger, mOST last flytte toveis og reversere ofte på vei til sitt endelige reisemål 1,5-13. Videre har det blitt vist at motorer motsette retnings førsteamanuensis samtidig til last, å reise spørsmålet om hvordan regulert bevegelse av last koordineres av motsatt polaritet motorer 5-7. Sammen, er transport av aksonale last en felles prosess som er regulert av sammensetningen av motorer og deres spesifikke biokjemiske aktiviteter, som igjen er avhengig av ulike adaptere og regulatoriske bindingspartnere 14.
For å trofast beskrive mekanismen av aksonal transport for en spesifikk last og for å avdekke den underliggende reguleringen av at transport, er det viktig å bestemme sammensetningen av motor proteiner og deres regulatoriske bindingspartnere forbundet med enkeltlaster under sin levende transport. Andre metoder, for eksempel biokjemiske metoder, gi anslag for gjennomsnittlig MOTeller komposisjoner på rensede heterogene vesikkel populasjoner, men disse anslagene ikke avsløre hvilken type eller mengder av motorer knyttet til enkelt bevegelige blemmer. Også, rekonstitusjon av vesikkel transport langs forhåndsmonterte mikrotubuli in vitro aktiverte måling av mengden av en type motor på et enkelt nivå 15 vesikkel. Imidlertid har disse forsøk ikke direkte relateres mengden av motorer med transport egenskapene til disse vesikler, og målte transport i fravær av cellereguleringsfaktorer.
En protokoll som er presentert her, som bestemmer motor sammensetning (type og relativ mengde av motorer) av individuelle bevegelige vesikler fra immunfluorescens (IF) som måler data endogent uttrykt motor proteiner, og relaterer disse parametere til transport av levende nøyaktig samme vesikler i nevroner 16. Denne metoden innebærer presis kartlegging av IF-to-live last bevegelse data. Dette oppnås ved å growing hippocampus muse nevroner i microfluidic enheter å følge etablerte protokoller 17-19. Disse enhetene tillater for identifisering og korrelasjon ("mapping") av axoner og single bevegelige last i faste og levende lys mikros modaliteter (figur 1). Dyrkede nerveceller blir tilført med fluoresceinmerket last proteiner som transport avbildes ved høy romlig og tidsmessig oppløsning for å få detaljert bevegelse informasjon som er plottet i kymographs. I løpet av bildebehandling, er nevroner løst med paraformaldehyde, og deretter farget med antistoffer mot endogene motor proteiner. Faste laste- og motor bildene er lagt over levende bevegelse kymographs til "kart" (colocalize) dem til live last bevegelse baner 16. Å korrelere live bevegelse av last med foreningen av motor proteiner, er colocalization analysert ved hjelp av en skreddersydde MATLAB programvarepakke kalt "Motor colocalization "16,20. Fluorescensmerkede last og motorer generere diffraksjon-begrenset punctate funksjoner som kan delvis overlapper. Å løse posisjonen overlapp puncta, programvaren først tilpasser automatisk Gaussian funksjoner til hvert punktspredefunksjonen, som representerer individuelle fluorescerende puncta, for å fastslå nøyaktig XY sub-piksel posisjonskoordinater og intensitet amplituder 21-23. Stillingene av motorer og last er deretter sammenlignet med hverandre for å bestemme colocalization 16,20. Derfor er denne fremgangsmåte tildeler mer presist colocalization mellom fluorescerende puncta i forhold til andre fremgangsmåter for 24.
Styrken av denne metoden er muligheten til å vurdere colocalization av individuelle motorer med last i fikserte celler, hvor det levende bevegelsesbaner (f.eks, den retning i hvilken de var i bevegelse ved tidspunktet for fiksering) har vært recorded. Med denne metoden, ble kinesins og dyneins funnet å knytte samtidig til vesikler som bærer den normale prionproteinet (PrP C -cellular), en neuronally beriket last som beveger seg i begge retninger eller blir stående stille i axoner 16. Denne analysen tillot utformingen av en fungerende modell for regulering av PrP C vesikkel bevegelse der antero (kinesin) og retrograd (dynein) motorer koordinere sine aktiviteter for å flytte vesikler i begge retninger, eller for å holde seg i ro mens knyttet til lasten . En annen styrken av denne metoden er dens potensial bred anvendelse for å karakterisere colocalization / forening av mange fluorescensmerkede last som beveger seg i praktisk talt en hvilken som helst celletype, med ethvert annet protein (er) av interesse. Således kunne live / fast korrelasjon potensielt tillate påvisning av transiente protein-interaksjoner last, kan så mange individuelle fluorescensmerket bevegelige partikler bli analysert i løpet av en ønsket period tid. Gitt den brede anvendelighet og den type spørsmål som denne metoden kan adresse, vil denne protokollen være av interesse for et bredt publikum av cellebiologer, inkludert de som studerer menneskehandel og transport i nevroner eller i andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført etter godkjente protokoller og i henhold til institusjonelle retningslinjer for human behandling av forsøksdyr. Nyfødte mus ble avlivet ved halshogging.
1. Utarbeidelse av microfluidic Enheter for Cell Culture
- Forbered polydimetylsiloksan (PDMS) microfluidic enheter for vekst av hippocampus nevroner som beskrevet av Harris og kollegaer 17-19. Nedenfor er noen endringer som ble tilpasset lasten kartlegging protokollen.
MERK: microfluidic enheter er også kommersielt tilgjengelig (Materials List), og dermed tilgang til et produksjonsanlegg er ikke nødvendig. - Forbered No. 1½ dekkglass (24 x 40 mm) ved å vaske dem tre ganger med aceton, etterfulgt av tre vasker med 100% etanol og tre vasker av vann. Oppbevar Dekk i vann ved 4 ° C før bruk. Disse behandlingene bidra til at Dekk er rene for rusk som kan forstyrre plating av cells, forurensning, og overlevelse.
MERK: Aceton og etanol er brannfarlig og farlig ved ved hudkontakt (irritament), ved øyenkontakt (irriterende), ved svelging, ved innånding. Fjern i samsvar med myndighetenes forskrifter. - Når du er klar til å bruke, plassere en cover glass i en 60 mm cellekultur fatet per microfluidic enhet, og la det lufttørke avdekket i 45 min inne i en biosikkerhet kabinett for å unngå forurensning.
- Etter enheter er kuttet ut fra mestere og slag har blitt kuttet for å skape reservoarene (figur 1A, B), legg dem med microfluidic kanaler side-opp inne i en biosikkerhet skap utstyrt med en UV-lampe i 45 min for sterilisering.
MERK: Leaving enheter under UV-behandling i mer enn 2 timer kan påvirke integriteten til PDMS. - Monter enhetene ved å plassere én enhet på hver dekkglass inne i 60 mm plastcellekultur parabolen slik at microfluidic kanaler med ansiktet ned. Påfør lett trykk til toppen of enheten (unngå å berøre microchannels) for å gi et ikke-permanent forsegling av enheten til dekkglasset. Dekke hver 60 mm cellekultur med lokk.
- Ved hjelp av en mikropipette, hydrat enhetene ved tilsetning av cellekulturkvalitet vann til de to øverste microfluidic reservoarer (1 og 2 i figur 1A), slik at vann kan strømme gjennom. Fjerne vann med en mikropipette og tilsett 1 mg / ml poly-L-lysin i mikrofluidreservoaret 1 (200 pl) og 2 (100 ul). Volumforskjellen vil tillate for poly-L-lysin for å strømme gjennom mikrokanaler (figur 1A, B).
- For å sikre at enhetene inne i 60 mm cellekultur retter ikke velte inne i en 37 ° C inkubator, plasserer tre 60 mm cellekultur retter som inneholder enhetene inn i en 150 mm plast cellekultur tallerken og dekk fatet med lokk. Inkuber O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Vanligvis mer enn 90% av kanalene er brukbare per enhet og gjøreinneholder ingen luftbobler eller fysisk blokkering.
- På neste dag, erstatte poly-L-lysin med vann og la apparatet i inkubator i minst 1 time. Gjenta denne vasking tre ganger. Fjerne vann og tilsett Neurobasal-A vekstmedium (inneholder 2% B-27 supplement og 500 mikrometer Glutamax) til hver enhet. La O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- På neste dag, plate hippokampale celler som beskrevet nedenfor.
2. Plating av Mouse hippocampus Primary nevroner i microfluidic Devices
MERK: Utarbeidelse av dyrkede hippocampus nevroner fra nyfødte rotter har tidligere blitt publisert i Jove 25. Nedenfor er noen endringer som ble tilpasset plate mus hippocampus nevroner i microfluidic enheter, og som var optimal for transfections.
- Før musehjerne disseksjon, pre-varm Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum(FBS; uten antibiotika), Blanding A (125 mg DL-cystein, 125 mg bovint serumalbumin (BSA) og 3,125 g av D-glukose i 500 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS), filter sterilisere gjennom et 0,22 um filter) og deoksyribonuklease I-løsning (DNase I: 50 mg DNase, og 0,5 ml av en 1,2 M MgSO4-løsning i 100 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) filtersteriliser gjennom et 0,22 um filter) i et 37 ° C vannbad.
- Pre-varm Neurobasal-A vekstmedium inne i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 for å ekvilibrere pH.
- Dissekere hippocampi 1-3 dager gamle nyfødte mus i henhold til etablerte protokoller 26. Hold Hippocampi i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml disseksjon buffer (HBSS inneholdende 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glukose, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin), på is. Sett opp til 4 hippocampi per 15 ml konisk tube.
- Utfør de resterende protokoll er under steriles inne i en biosikkerhet kabinett.
- Fortynn 45 enheter av papain i 5 ml Blanding A, vortex, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C inntil papain pulver er oppløst. Tilsett 1 ml DNase-løsning. Filtrer blandingen gjennom et 0,22 um sprøytefilter-enhet.
- Nøye aspirer HBSS 'fra 15 ml koniske rør som inneholder hippocampi. Tilsett 10 ml kald (4 ° C) HBSS til hippocampi og la dem synke til bunnen av røret. Nøye aspirer HBSS fra 15 ml konisk tube.
- Tilsett 1 ml papain / DNase I til å blande opptil 4 hippocampi og inkuberes i 20-30 minutter ved 37 ° C. Vipp konisk rør hvert 5 min å bade hippocampi med mix. Alternativt kan plassere hippocampi i et 37 ° C vannbad rister med forsiktig risting (-100 opm).
- Aspirer papain / DNase I blandes og vaskes to ganger med hippocampi forvarmet DMEM (37 ° C) inneholdende 10% FBS.
- Etter andre vask, tilsett 2 ml forvarmet DMEM inneholder 10% FBS til hippocampi og manuelt triturate hippocampi ved pipetteringopp og ned ~ 10-12 ganger ved hjelp av en 1 ml pipette å distansere nevroner.
- La pulveret sedimentere i ~ 1 min, da dette vil tillate at ikke-neuroner dissosiert til å slå seg ned til bunnen av det koniske rør. Overfør supernatanten inneholdende neuroner dissosiert i et nytt 15 ml konisk rør unngå overføring av større vev som har lagt seg på bunnen av røret.
- Spin cellene ved 1000 xg i 2 min og fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre cellen pellet. Suspender cellene i 80 mL Neurobasal-A vekstmedium ved å pipettere forsiktig.
- Fjern medium fra mikrofluidreservoaret 1 og 1 '. Anvende 20 ul celler (~ 275 000) til mikrofluidreservoar 1, og tillate dem å strømme gjennom. Plassere enheten i 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 20 min.
- Se under mikroskop for å sikre at celler som har klebet til dekkglasset. Legg Neurobasal-A vekstmedium til toppen av alle reservoarer. Retur enhet med cellene til en 37 ° C inkubator med 5% CO
- Sjekk enheter hver ~ 2-3 dager og topp av reservoarer med Neurobasal-A inneholder 2% B-27 supplement (uten Glutamax) for å unngå fordampning. Nerveceller begynner å utvide sine aksoner gjennom microfluidic kanaler ~ 2-3 dager etter plating. Lagt nevroner transfeksjonen vanligvis 7-10 dager etter plating.
3. Transfeksjon av hippocampus nevroner Dyrket i mikrofluid Device
- Per enhet, fremstille en blanding av 1,2 ul Lipofektamin 2000 i 30 pl Neurobasal-A, og en blanding av 0,5 ug plasmid-fusjons fluorescerende last i 30 pl Neurobasal-A og inkuber i 5 minutter ved RT. Legg Lipofectamine blanding til DNA-blandingen og inkuberes i 20 min ved RT. Legg 60 mL av Neurobasal-A inneholdende 4% B-27 supplement til DNA / Lipofectamine mikse og blande ved å flikke røret.
- Fjern alle medier fra mikrofluidreservoaret 2 og 2 'og nøye fylle opp brønner med Neurobasal-A som inneholder 2% B-27 supplement uten å søle over middels into de andre seksjonene.
- Ta ut mediet fra mikrofluidreservoaret 1 og 1 '. Legg 120 mL av DNA / Lipofectamine bland til mikrofluidreservoaret 1 og la det flyte. Returnere enheten til 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 3-4 timer.
- Fjern alle medier fra mikrofluidreservoaret 1 og 1 'og erstatte med Neurobasal-A inneholder 2% B-27 supplement for 24 timer (eller til den er klar til bildet). Vanligvis er 5-7 aksoner som vokser gjennom microchannels transfektert under disse forholdene, som representerer ca 1-3% transfeksjonseffektivitet forenlig med effektivitet publisert for hippocampus dyrkede celler 26.
4. "Cargo mapping" Analyser
- Levende Imaging av last bevegelse
- Utfør bildebehandling på en omvendt epifluorescence lysmikroskop utstyrt med en 37 ° C inkubator og et CO 2 kontrollkammeret.
- Monter dekkglass med hippocampus nevroner dyrket i en microfluidic enhet på objektbordet. For å unngå neuronal død, arbeide raskt for å opprettholde prøvene ved mikroskop for ikke lenger enn 1 time.
- Ved hjelp av et objektiv med høy oppløsning (100X), finner aksoner av transfekterte celler som strekker seg gjennom kanaler av microfluidic kamre og registrere antall av kanalene som i det transfekterte axon ble funnet. Tell antall kanaler som bruker en hånd tally teller.
- For optimalt opptak av levende bevegelse og påfølgende colocalization analyse, velger aksoner som vokser forholdsvis flatt gjennom kanalene, slik at de fleste avbildning av vesiklene kan utføres i fokus.
- Fjern mesteparten av mediet fra reservoarene 2 og 2 'med en 1 ml plastoverføring pipette. For å lette påfølgende justering av faste bilder med bevegelsesbaner på kymographs, justere den høyre kanten av microchannels med synsfeltet under avbildning (figur 1B, C).
- For å lette fixing av prøvene under bildebehandling, opptre live bildebehandling med to personer. Alternativt, hvis sanntidsavbildning er utført av en enkelt person, kan du bruke et mikroskop system utstyrt med korreksjon av drifting.
- Begynn bildebehandling levende last bevegelse med time-lapse spesifikasjoner spesifikke for transport dynamikken i lasten blir analysert (mikroskop spesifikasjoner og innstillinger for bildebehandling YFP-PrP C er spesifisert i legenden om figur 2 og Materials List).
- Etter tilstrekkelig levende bevegelsesdata er samlet inn, har en person fylle opp reservoarene to og to 'med forvarmet 4% paraformaldehyde i PBS inneholdende 0,04 g / ml sukrose å fikse cellene. Unngå å ta på microfluidic enhet, da dette vil forstyrre fokus på det levende bildebehandling. Har den andre personen justere fokus mens fiksativ er lagt til. Fiksering er vellykket når umiddelbar stopp av bevegelsen er observert. Legg fiksativ til reservoar 1 og 1 'etterpå.
MERK: Midlertidig photobleaChing av lasten fluorescens kan også observeres, men fluorescensen vedvarer etter IF farging for motor proteiner er fullført (neste trinn).
MERK: Paraformaldehyde er skadelig ved innånding, hudkontakt og svelging. Irriterer øynene, luftveiene og huden. Fjern i samsvar med myndighetenes forskrifter.
- IF farging av motor proteiner for colocalization analyse
NB: For kvantifisering av relative nivåer av motorproteiner (som bestemt av antistoff-farging), tilknyttet til individuelle bevegelige last, validere og titrere antistoffer for å sikre at antistoff-antigen-binding er mettet. Dette gjøres ved å bestemme spesifisiteten av antistoffet ved hjelp av neuroner hvori proteinet av interesse er enten banket ut eller slått ned, og ved å utføre analysen med økende IF antistoffkonsentrasjoner. For negative kontroller, blir nevroner farges med sekundære antistoffer i fravær av primære antistoffer. Mer detaljertbeskrivelse av antistoff validering kan finnes i Encalada et al. 16, og Szpankowski et al., 20.- Fjern dekkglass med hippocampus nevroner dyrket i microfluidic enhet fra mikroskop scenen. Du må ikke koble microfluidic enheten fra dekkglass, som microchannels må forbli intakt for å sammenligne med de levende og faste bilder. Utfør følgende trinn i en luftfuktighet kammer.
- For å sikre at strømmen av oppløsninger inn i mikrokanaler, å opprettholde en buffervolumforskjell mellom reservoarene 1, 1 'og 2, 2' på minst 30 pl. i alle etterfølgende trinn. For eksempel legge 100 ul medievolumet til mikrofluidreservoaret 2, 2 ', og 70 mikroliter medievolumet til mikrofluidreservoaret 1, 1'.
- Fjern fiksativ fra kamrene i mikrofluid enheten og vaske cellene tre ganger med PBS og ventet 10 minutter mellom hver vask.
- Permeabilisere cellene ved tilsetning av 0,1% Triton X-100 Diluted i PBS i 5 min til alle reservoarer.
- Ta løsningen fra alle reservoarer og vask med PBS. Gjenta vasking tre ganger venter 10 min mellom hver vask.
- Ta løsningen fra alle reservoarer og anvende blokkeringsbuffer inneholdende 10% Normal Esel serum og 3% protease-fri og immunoglobulin G (IgG) -fri BSA i PBS og inkuberes i minst 30 minutter ved romtemperatur.
- Spin primære antistoff lagerløsning ved 20.000 xg i 5 minutter for å fjerne bunnfall. Fortynn antistoff til en egnet konsentrasjon i blokkeringsbuffer. Bytt ut blokkeringsbuffer fra microfluidic enhet med antistoff løsning. Prøvene inkuberes i 2 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C.
- Ta løsningen fra alle reservoarer og vask tre ganger med PBS, og ventet 10 minutter mellom hver vask.
- Spin sekundært antistoff lagerløsning ved 20.000 xg i 5 minutter for å fjerne bunnfall. Fortynn antistoff til en egnet konsentrasjon i blokkeringsbuffer. Bytt PBS med sekundært antistoff løsning. InkuberPrøvene i 1 time ved RT.
- Ta løsningen fra alle reservoarer og vask tre ganger med PBS, og ventet 10 minutter mellom hver vask.
- Erstatt med PBS ~ 10-20 ul monteringsmedium ved direkte å pipettere monteringsmedium inn i åpningen av kanalene som forbinder reservoarene. La mediamonterings tørke i ~ 20 minutter - 1 time ved RT.
- Oppbevar enheter ved 4 ° C beskyttet mot lys for å unngå fotobleking og bilde axoner i løpet av to dager (maks en uke) av flekker.
- Etter fargingen er fullført, monteres sammen med dekkglass hippocampale neuroner dyrket i mikrofluid enhet på objektbordet. Finn den regionen i transfektert axon avbildes i trinn 4.1.1-4.1.7.
- Erverve Z-stack bilder (300 nm trinn) for hver av de tre kanaler: last, motor 1, motor 2, ved hjelp av et objektiv med høy oppløsning (f.eks, en høy numerisk apertur olje eller vann objektiv).
MERK: Kjøp av Z-stabler er viktig som axoner ofte ikke vokser helt flati mikrokanaler og derfor ikke alle fluorescerende puncta er i samme fokalplan.
- Cargo Mapping
- Generere en kymograph av last bevegelse ved hjelp av bildeanalyse programvare. Den ImageJ plugin utviklet av Rietdorf og Seitz (EMBL) anbefales for å generere kymographs (for nedlasting se Materialer List).
MERK: ImageJ er et offentlig domene, Java-baserte bildebehandlingsprogram utviklet ved National Institutes of Health 27,28 (for nedlasting se Materials List). - Plasser de faste bilder av den fluorescerende last (generert i trinn 4.2.14) manuelt ved over dem på plasseringen av baner i kymograph på det punktet av fiksering (figur 2A, B), ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig tegne grafer program (Materialer List). Manuelt justere ved først å overlagre den faste laste bilde på kymograph og manuelt velge lasten puncta som svarer til en bestemt bane påden kymograph. For beste justerings resultat, bruk Z skive som er i beste fokus for lasten kartlagt. Z flere skiver kan benyttes.
- For hvert bilde i Z-stabelen (last, motor 1 og motoren 2; generert i trinn 4.2.14) bestemme X- og Y- koordinater, og intensitets amplituder for hver fluorescerende puncta ved hjelp av en etablert algoritme for å passe til 2D Gaussians punktspredefunksjonen som representerer hver punktkilde i hver av de tre kanalene 16,20,21 (figur 2D).
MERK: For å oppnå XY koordinater, en tilpasset bygget MATLAB programvarepakke kalt "Motor colocalization" ble utviklet 16,20, som inkorporerer en Gaussian passende algoritme utviklet av Jaqaman, Danuser og kolleger 21-23. Programvarepakken og detaljerte instruksjoner for bruken kan fås på forespørsel. - For hver av de individuelt last puncta som ble kartlagt på de mobile eller stasjonære baner på kymograph velge tHan xy-koordinater og intensitets amplituder fra resultatene av "Motor colocalization" -programmet (disse laster er individuelt merket i figur 2B). Bruk flere Z-stack bilder ervervet i trinn 4.2.14) for å kartlegge flere laster som er funnet på forskjellige brenn flyene.
- Sammenlign de enkelte XY-koordinatene for den tilordnede lasten til de som er oppnådd for hver av de motoriske kanaler i det tilsvarende Z skive (figur 2D). Bestemme og velge de motoriske XY-koordinatene som er innen en radius på 300 nm av lasten. For last og motorer som har signal i samme fokusplan, bruk "Motor colocalization" programvarepakke for å bestemme puncta som ligger innenfor en 300 nm radius.
- Generere en kymograph av last bevegelse ved hjelp av bildeanalyse programvare. Den ImageJ plugin utviklet av Rietdorf og Seitz (EMBL) anbefales for å generere kymographs (for nedlasting se Materialer List).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en oversikt over den mikrofluid enhet som brukes til å vokse hippocampus nevroner (figur 1A, B). Neuroner blir sådd ut i reservoaret 1. Størrelsen av mikrokanaler hindrer diffusjon av cellelegemene (Soma) inn i kammeret aksonal mens lengden av kanalene hindrer dendrittiske fremspring fra krysset hele veien til den aksonal rommet. Etter ~ 2-3 dager i kultur, begynner nevronene utvide sine aksoner tvers microchannels inn i aksonal rommet (figur 1B, C). Transfekterte aksoner som uttrykker normale prion protein merket med gul fluorescerende protein (YFP PrP-C), kan identifiseres ved fluorescens mikroskopi (figur 1C). Uttrykk av fluorescensmerkede proteiner ved hjelp plasmid transfeksjon bør sjekkes for riktig subcellulære lokalisering og funksjon som overuttrykk kan introdusere eksperimentelle gjenstander på grunn av endrede protein conformations. Dermed colocalization eksperimenter bør være komplettert med både biokjemiske ko-presipitering studier, samt med IF farging for endogent uttrykte proteiner. Oppførselen til YFP-PrP C brukes her ble testet tidligere 16. Ekspresjon av YFP-PrP C i transient transfekterte neuroblastom-celler (N2A) var lav, noe som tyder på at transient transfeksjon ikke resulterer i sterkt overuttrykt YFP PrP-C-nivåer 16. Videre IF av N2a celler transfektert med YFP-PrP C ved hjelp av antistoffer mot PrP C indikerte at YFP-PrP C svært colocalized med endogen PrP C, noe som tyder på at både transfektert og endogen PrP C oppførte seg på samme måte. Å konstatere at PrP C forbundet med motorer, ble vesikkel immunoisolations utført 16.
For optimal last kartleggingsstudier, blir den høyre kanten av microchannels linje med synsfelt under live og faste imaging for å avbilde det samme område av axon (angitt med rødt rektangel i figur 1B, C). Figur 2 og Figur 3 viser representative resultater for lasten kartlegging analyser av neuroner transient transfektert med YFP-PrP C. Blemmer bærer YFP-PrP C blir transportert i pattedyr aksoner av medlemmer av kinesin-1 familie og dynein Heavy Chain 1 (DYNC1H1) 16, ble derfor YFP-PrP C vesikler kartlagt til kinesin-en underenhet kinesin Lys Chain 1 (KLC1) og å DYNC1H1 motorer. YFP-PrP C vesikkel bevegelsen ble fotografert og plottet i en kymograph (Figur 2A). I kymographs, er antero og retrograd bevegelse av YFP-PrP C vesikler representert ved baner med negative og positive bakker, henholdsvis, og stasjonære vesikler er avbildet av vertikale baner. Ved fiksering, stoppet all bevegelse indikert ved fravær av diagonale linjer i kymograph(Figur 2A). IF signal om molekylære motorer og last i anleggs, permeabiliserte axoner er punctate 16 (figur 2B, C). Målet med "last mapping", er å fastslå om puncta i lastekanal (figur 2B) colocalize med motor puncta (figur 2C) i de to andre kanaler. For å gjøre dette, ble fluorescerende bilder av faste YFP-PrP C blemmer, og IF bilder av tilsvarende KLC1 og DYNC1H1 knyttet til vesicular puncta justert til kymograph (figur 2B, C). Gaussian funksjoner ble montert på punkt spredt funksjoner av fluorescerende punktkilder i alle tre kanaler for å kartlegge de nøyaktige XY posisjoner av motorer til laste baner innhentet av levende avbildning (figur 2D). Endogent uttrykt KLC1 og DYNC1H1 motorer vises som punktformet flekk og colocalized ulikt med YFP-PrP C vesikler (figur 2D). Colocalization ble definert ved nærværet av PrP-YFP C og motor puncta innenfor en avstand på 300 nm og kvantifisert ved nivået av colocalization av den gaussiske XY-koordinatsystem posisjoner mellom den YFP-PrP C, og hver av de KLC1 og DYNC1H1 puncta (figur 3A ). Denne avstanden ble valgt basert på optikk, diffraksjon grensen av lys, og den relevante fysiske størrelsen på last og motor subenheter. Den relative mengde av KLC1 og DYNC1H1 forbundet med YFP PrP-C-vesikler ble oppnådd fra de Gaussiske amplituder, som representerer intensitetene av hver puncta (figur 3B). Disse dataene kan bli ytterligere analysert som ønsket. For eksempel intensiteter av motorer colocalizing med YFP-PrP C puncta mellom styre (villtype - WT) neuroner og de som mangler andre kinesin-1-underenheter (KIF5C - / - neuroner i figur 3A, er KIF5C et medlem av kinesin-1 familie), kan sammenlignes for å bestemme om fravær av KIF5C forstyrrer sammenslutning av KLC1 og / eller DYNC1H1 til YFP-PrP C vesikler (KLC1 og DYNC1H1 intensiteter var uendret i våre eksperimenter 16). Videre kan KLC1 og DYNC1H1 intensiteter plottes å granske mulige sammenhenger mellom relative motor beløp og retningen på bevegelsen (Figur 3B). For eksempel YFP-PrP C vesikler som beveger seg og / eller stasjonær assosiert med både KLC1 og / eller DYNC1H1 (Figur 3B).
Figur 1. Hippokampale nerveceller dyrket i microfluidic enheter. (A) Bilde av en mikrofluid enhet. Konturene av reservoarene er visualisert med røde og blå fargestoffer. Nummerering refererer til antall microfluidic reservoarer som brukes i hele protokollen. (B) diagram av en mikrofluidteknisk enhet. Tallene tilsvarer reservoarer jegn som media og nevroner er lagt til. Transfekterte nevroner er vist i grønt. Red rektangel og røde stiplede piler indikerer regionen anbefales for live og faste fluorescens bildebehandling. (C) Bilde av to axoner transfektert med YFP-PrP C vokser gjennom en enkelt microchannel (en microchannel og kanten på enheten er skissert av stiplede hvite linjer) . Individuelt bevegelige YFP-PrP C vesikler kan skilles som lysere puncta. Scale bar er 10 mikrometer. Figuren er tilpasset fra:.. Encalada et al 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. "Cargo mapping" å relatere YFP-PrP C vesikkeltransport medrelative mengder av kinesin og dynein motorer. Wide-feltet fluorescens bilder av levende bevegelse og av faste last ble tatt på en invertert mikroskop utstyrt med en motorisert scene og et CCD-kamera og en 100X / 1.4 NA olje objektiv. (A) Kymograph av YFP -PrP C vesikkel bevegelse av aksoner som er vist i figur 1C. Levende bevegelse ble notert for en total tid som varierer fra 30 til 60 sekunder ved 100 ms eksponering (10 Hz). Celler ble løst etter tenkelig last bevegelse i minst 15 sek. Prikket linje angir tidspunktet for fiksering under live imaging. Red boksen viser regionen vesikler uthevet i (B, C) og forstørret i (D). Pilspisser peker på tre vesikler vist i (D) tilsvarende stasjonær (blå), retrograd (rød), og anterograd (grønn) baner. ( B) Bilde av faste YFP-PrP C vesikler justert til tilsvarende kymograph. Tallene angir ienkelt- YFP-PrP C vesikler som ble kartlagt til identifiserbare puncta på kymograph. Antero vesikler er grønne, retrograd er røde, og stasjonære de er blå. (C) Fast IF bilder av KLC1 og DYNC1H1 puncta tilsvarer samme region vist i (B). Skala bar (AC) er 10 mikrometer. (D) Forstørrelse av fast IF-signalene fra hver av de tre kanaler med 2D Gaussisk funksjonsoppgaver. Blå prikker representerer lokale intensitet maxima piksler, røde prikkene representerer Gaussian passer, og rosa prikker er overlappingen mellom de to. Pilspisser viser eksempler på YFP-PrP C vesikler som vises i (A), og deres differensial colocalization med KLC1 og DYNC1H1 motor proteiner. Scale bar er to mikrometer. Figuren er tilpasset fra:.. Encalada et al 16 Klikk her for å se en større versjon av th er figur.
Figur 3. Kvantitative analyser av "cargo mapping" av YFP-PrP C blemmer. (A) Kvantifisering av colocalization mellom YFP-PrP C blemmer, KLC1 og DYNC1H1 i WT og KIF5C knockout nevroner (KIF5C - / -). Totalt antall puncta analysert var N WT = 887 KIF5C og N - / -. = 1629 16 tall inni stolpene representerer antall blærer pr kategori. Vist er gjennomsnitt ± SEM. Ikke-parametrisk permutasjon t test ble benyttet for sammenligning mellom genotypene 29. (B) Korrelasjon av relativ motor sammensetning og retningen på bevegelsen i WT neuroner av data analysert i (A). Figuren er tilpasset fra: Encalada et al 16...jove.com / filer / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her muliggjør korrelasjon av retningen på bevegelsen av individuelle fluorescerende mikrotubul-baserte bevegelige laste partikler med den relative type og mengde av tilhørende motor proteiner i levende neuroner. Tidligere ble den totale motor sammensetningen av aksonale vesikulær last analysert på heterogene populasjoner av biokjemisk renset vesikler og organeller 9,15. Imidlertid, har vært å karakterisere motorsammensetning for en enkelt type last inne i cellene utfordrende på grunn av vanskeligheten med rensing av homogene populasjoner vesikkel. Videre, mens målinger av motor stall-krefter gitt estimater for aktive motoriske tall i Drosophila embryoer, var det uklart om retningen på bevegelsen korrelert til motorer blir stabilt bundet til last, eller til den raske forening / dissosiasjon av aktive motorer til / fra laste 12. Derfor "cargo mapping" protokoll descriseng her ble utviklet for ytterligere å undersøke korrelasjonen mellom type og relative antall motorer forbundet til individuelt å bevege lasten i levende neuroner.
Å kunne innhente data fra "last mapping" det er avgjørende for 1) å utføre avbildning av last bevegelse og faste IF på et høyt tidsmessig og romlig oppløsning, 2) sikre umiddelbar festing av prøven i løpet av bildebehandling, 3) juster regionen av interesse for levende og faste bilder og kart fast last og motorer til bevegelses kymographs for de samme bildene, og 4) presist bestemme XY koordinater av last og motor fluorescerende puncta for å bestemme mengden av colocalization mellom last og motor proteiner.
Selv om denne protokollen er unikt egnet til å analysere transportegenskaper i jevnt organiserte aksoner av nerveceller dyrket i microfluidic enheter, kan det tilpasses et bredt spekter av problemstillinger. For eksempel denne Applicasjon kunne brukes til å karakterisere foreningen av vesikler med sine adaptere involvert i endo / eksocytose (f.eks, smuglerforsøk i fibroblaster), eller veksten av mikrotubuli merket med microtubule + tips bindende proteiner. For disse, kan microfluidic enheter erstattes av rutenett dekkglass for å lette lokalisering av fotografert cellene nødvendige for correlative levende og faste imaging studier. Denne protokollen kan også brukes til å karakterisere cellulære hendelser hvor en parameterendringer i tid avhengig av den spesifikke cellulære miljø. For eksempel kan utgivelsen av en fluoresceinmerket viral protein fra individuelle endosomal strukturer inn i cytoplasma være korrelert med uttrykket og / eller sammenslutning av endosomal proteiner.
En mulig begrensning av denne protokollen er at kartlegging av høy tetthet last kan være vanskelig. Men tildelingen av Gaussian funksjoner omgår dette problemet i stor grad ved å tillateforskjellsbehandling av stillinger mellom fluorescerende puncta på sub-piksel nivå. Videre er kartleggingen av motorene for å aksonale last med lav gjennomstrømning: for tiden, kan bli gjort for kartlegging 2 axoner per mikrofluid enhet, gitt den lave hastighet på transfeksjon av neuroner og den begrensede synsfelt ved bruk av høy forstørrelse som er nødvendig for høy- Resolution Imaging med våre kamera. Fremtidig utvikling av denne fremgangsmåte kan omfatte bruken av lentivirale systemer for å transdusere neuroner med høyere effektivitet, isolering av nerveceller fra transgene mus som uttrykker fluorescensmerket kodede proteiner eller merking av organeller med små fluorescerende fargestoffer som for eksempel Lysotracker eller Mitotracker, som alle vil øke antall axoner merket med fluorescerende markører. Videre blir størrelsen av den innspilte området begrenset av forstørrelsen, pikselstørrelsen og størrelsen av bildeelement matrise av kameraet benyttes for avbildning. Pågående utbygginger innen avbildningsteknikker vil gi rom for større områdes skal bli avbildet i fremtiden, og dermed øke mengden av data oppnådd pr eksperimentell tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
