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Medicine

पेशी Dystrophy रोगियों से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी: मूत्र ली गई कोशिकाओं के कुशल एकीकरण मुक्त Reprogramming

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52032
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

Abstract

Dystrophic कार्डियोमायोपैथी पेशी dystrophy के खराब समझ परिणाम है। पेशी dystrophy के साथ रोगियों से प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) पैदा करने के लिए इन विट्रो रोग मॉडल प्रणाली के लिए एक अमूल्य सेलुलर स्रोत है और दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगी व्युत्पन्न मूत्र कोशिकाओं dystrophic कार्डियोमायोपैथी 1 मॉडल के क्रम में प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में सफल reprogramming में इस्तेमाल किया गया है। वेक्टर प्रणालियों को एकीकृत करने की सुरक्षा चिंताओं को संबोधित करते हुए हम यामानाका के पारगमन पेशी dystrophy के साथ रोगियों से एकत्र मूत्र कोशिकाओं में कारकों के लिए एक गैर समेकित करने सेंडाइ वायरस वेक्टर का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल पूरी तरह से 2-3 सप्ताह के भीतर क्लोन reprogrammed उत्पन्न करता है। pluripotent कोशिकाओं बीतने-13 के द्वारा वेक्टर से मुक्त हैं। ये dystrophic IPSCs cardiomyocytes में भेदभाव और रोग तंत्र या दवा स्क्रीनिंग के लिए अध्ययन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

कार्डियोमायोपैथी डचेन और बेकर पेशी dystrophy (एमडी) के साथ रोगियों में मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण है। एक्स-लिंक्ड डिस्ट्रोफ़िन जीन में परिवर्तन एक में होते हैं हालांकि: 3500 पुरुष जन्म, बहुत कम प्रगतिशील हृदय की मांसपेशी क्षति के लिए अग्रणी आणविक और सेलुलर घटनाओं के बारे में जाना जाता है। पेशी dystrophy रोगियों से ली गई मानव प्रेरित स्टेम सेल अंतर्निहित रोग तंत्र का अध्ययन करने और दवा 1,2 स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में उभरा है।

त्वचा बायोप्सी या रक्त के नमूनों के प्रत्याशित असुविधा अध्ययन भागीदारी के लिए सहमति देने के लिए युवा रोगियों और / या उनके अभिभावकों विरत हो सकता है। मूत्र के नमूने reprogramming के तरीकों को सुधारने योग्य हैं कि दैहिक कोशिकाओं के एक गैर इनवेसिव स्रोत हैं। हमने हाल ही में पेशी dystrophy रोगियों से एकत्र मूत्र कोशिकाओं सुसंस्कृत हो सकता है कि दिखाया गया है और कुशलता से यामानाका कारकों के साथ रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर IPSCs (में reprogrammed किया हैOct3 / 4, Sox2, Klf4, और सी-Myc; OSKM) 1। रेट्रोवायरल जीन डिलीवरी का नुकसान मेजबान गुणसूत्रों में reprogramming जीनों के यादृच्छिक एकीकरण है। इस सीमा को पार करने के लिए, हम मूत्र सेल reprogramming के लिए गैर समेकित करने सेंडाइ वायरस का इस्तेमाल किया है।

इस प्रोटोकॉल फिर आगे के अध्ययन के लिए cardiomyocytes या अन्य प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है जो पेशी dystrophy रोगियों से अलग मूत्र कोशिकाओं के सेंडाइ वायरस reprogramming के विवरण देता है। इस प्रोटोकॉल भी अन्य रोगी विशिष्ट रोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: मरीजों और / या उनके अभिभावकों अध्ययन अनुमोदित एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड में भाग लेने के लिए सूचित सहमति दे देनी चाहिए।

1. बफ़र और मीडिया तैयारी

  1. वाशिंग बफर:, वाशिंग बफर के 100 मिलीलीटर की तैयारी फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 99 मिलीलीटर 100x कलम / strep समाधान (स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 यू / एमएल पेनिसिलिन 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
  2. मूत्र पूर्वपुस्र्ष सेल (UPC) मध्यम:, UPC मध्यम तैयार केरेटिनकोशिकाएं सीरम मुक्त (KSF) मध्यम + पूर्वपुस्र्ष सेल के माध्यम से बराबर मात्रा मिश्रण करने के लिए।
    1. KSF मध्यम: epidermal वृद्धि कारक के 5 एनजी / एमएल (EGF), गोजातीय पिट्यूटरी निकालने की 50 एनजी / एमएल (BPE), हैजा विष के 30 एनजी / एमएल, और कलम / strep समाधान (100 यू जोड़ने, keratinocyte मध्यम तैयार करने के लिए / मिलीलीटर पेनिसिलिन 500 मिलीलीटर KSF मध्यम करने के लिए, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन)।
    2. पूर्वज सेल मध्यम: FBS के, 0.4 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / hydrocortisone, 0.1 हाम-F12 के मीडिया के एक चौथाई के साथ DMEM के तीन तिमाहियों में जोड़ें और 10% के साथ पूरकएनएम हैजा विष, 5 एनजी / एमएल इंसुलिन, 1.8 एक्स 10 -4 एम एडिनाइन, / एमएल transferrin, 2 एक्स 10 -9 एम triiodo thyronine, 10 एनजी / एमएल EGF, और कलम / strep समाधान 5 माइक्रोग्राम प्रति।
  3. Hes मध्यम: 20% को-सीरम रिप्लेसमेंट (कश्मीर एसआर), 1x सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल glutamine, 100 माइक्रोन β-mercaptoethanol, 20 एनजी / एमएल bFGF और कलम / strep जोड़ें 400 मिलीलीटर DMEM / F12 के माध्यम।

2. मूत्र का नमूना संग्रह

  1. मूत्र की एक पर्याप्त राशि (~ 30-40 मिलीलीटर) एकत्र किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मूत्र संग्रह करने के लिए 30 मिनट पूर्व तरल पदार्थ पीने के लिए मरीजों के निर्देश।
  2. मरीजों और / या उनके अभिभावकों निम्न आइटम युक्त मूत्र संग्रह किट दे दो: (1) बाँझ या साफ पकड़ मूत्र का नमूना प्राप्त करने के तरीके के बारे में लिखित निर्देश, (2) नम विरोधी बैक्टीरियल toilettes, और (3) एक 100 मिलीलीटर बाँझ नमूना संग्रह कप। नमूना एकत्र करने के लिए मरीजों के निर्देश।
  3. तुरंत बर्फ पर मूत्र के नमूने जगह है और प्रयोगशाला के लिए स्थानांतरणएक कूलर में इतिहास। तुरंत सेल अलगाव के लिए मूत्र की प्रक्रिया। एक देरी अपरिहार्य है, तो सेल व्यवहार्यता का कम से कम नुकसान के साथ अप करने के लिए 4 घंटे के लिए बर्फ पर नमूना दुकान।

3. अलगाव और मूत्र कोशिकाओं के विस्तार

नोट: एक BSL2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत निम्न चरणों का पालन।

  1. बाँझ pipettes का उपयोग करना, हस्तांतरण मूत्र के नमूने 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब बाँझ करने के लिए। आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 × छ पर अपकेंद्रित्र।
  2. ट्यूब में 1 मिलीलीटर छोड़ने सतह पर तैरनेवाला Aspirate; सेल गोली परेशान नहीं सावधान रहना होगा।
  3. Resuspend धोने बफर के 7 मिलीलीटर में एकाधिक ट्यूब से छर्रों गठबंधन और आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 × छ पर centrifugation दोहराने और।
  4. ध्यान से सेल गोली और सतह पर तैरनेवाला के ~ 0.2-0.5 मिलीलीटर छोड़ रहा है, सतह पर तैरनेवाला aspirate। मूत्र पूर्वपुस्र्ष सेल (UPC) मध्यम के 2-3 मिलीलीटर में Resuspend और एक संयुक्त राष्ट्र के 4-6 कुओं में निलंबन हस्तांतरणलेपित 24 अच्छी तरह से थाली।
  5. 72 घंटे के बाद, अच्छी तरह से प्रति ताजा UPC माध्यम की 0.5 मिलीलीटर के साथ संस्कृति के पूरक हैं और हर 2-3 दिनों के बाद मध्यम बदल जाते हैं। थाली को देते नहीं है कि एरिथ्रोसाइट्स और स्क्वैमस कोशिकाओं मध्यम परिवर्तन के साथ हटा दिया जाएगा।
  6. 4-6 दिनों के बाद संस्कृति मॉनिटर।
    नोट: लघु 2-4 सेल कालोनियों प्रकट करने के लिए शुरू कर देंगे। प्रकोष्ठों गोल या प्रकार मैं या गुर्दे की उपकला (आरई) कोशिकाओं को क्रमश: 3 के प्रकार द्वितीय का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो लम्बी किया जाएगा।
  7. कोशिकाओं दिखाई देते हैं, एक बार वे एक तेजी से विस्तार के चरण से गुजरना होगा के बाद से हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें।
  8. कोशिकाओं 80-90% संगम, चढ़ाना के बाद चारों ओर 9-15 दिनों तक पहुँचते हैं, आगे के विस्तार के लिए 24 अच्छी तरह से थाली के 2-4 कुओं पर कोशिकाओं (15,000-18,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) को अलग कर देना और पारित होने के। सेल बीतने 1 (P1) के रूप में इस निशान।
  9. प्रवाह cytometric विश्लेषण के माध्यम से वंश विनिर्देशों के लिए मूत्र कोशिकाओं विशेषताएँ, immunohistochemराजनैतिक धुंधला या रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के माध्यम से (आरटी पीसीआर)।
  10. लंबी अवधि के cryostorage के लिए (DMEM के 10% सीरम और 10% DMSO के साथ पूरक) पृथक मूत्र कोशिकाओं (धारा 4) reprogram या मध्यम ठंड में उन्हें नीचे फ्रीज।

सेंडाइ वायरस का उपयोग 4. मूत्र सेल Reprogramming

नोट: Transfecting एजेंटों में हेर-फेर करते हुए उचित हैंडलिंग और पीपीई (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण) के उपयोग की सिफारिश की है। एक BSL2 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत निम्न चरणों का पालन। एजेंट और / या ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं transfecting के उचित निपटान पर्यावरण और स्वास्थ्य के खतरों के जोखिम से बचने के लिए सिफारिश की है। नीचे विस्तृत रूप में मूत्र सेल reprogramming के लिए निर्माता की फीडर पर निर्भर प्रोटोकॉल को संशोधनों के साथ एक सेंडाइ Reprogramming किट का उपयोग करें।

  1. सेंडाइ वायरस का उपयोग कर उच्च क्षमता reprogramming सुनिश्चित करने के लिए उपयोग में तेजी से कर रहे हैं कि मूत्र कोशिकाओं के 1-5 मार्गमें ly विभाजित। कोशिकाओं में अच्छी तरह से दोहराने या वृद्ध होनेवाला नहीं हो जाते, तो वे कुशलता से reprogram नहीं होगा, के रूप में उन्हें त्यागें।
  2. बीज एक 6 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में अच्छी तरह से प्रति 60,000 कोशिकाओं। मार्क दिवस -2 के रूप में इस। सेल बोने घनत्व समायोजित (5 एक्स 4-09 अक्टूबर 10 x 4 कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति) दिन शून्य से 80-90% संगम तक पहुँचने के लिए जरूरत के रूप में।
  3. 0 दिन (कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 48 घंटा) पर, चार OSKM कारकों में से प्रत्येक से युक्त सेंडाइ reprogramming के वैक्टर (सेव) तैयार करते हैं। पूर्व गर्म UPC माध्यम से 1 मिलीलीटर वैक्टर में से प्रत्येक में जोड़ें। Reprogramming के मूत्र कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है जो 1-1.5 के MOI (5-7.5 एक्स 10 5 CIU), का प्रयोग करें। मध्यम Aspirate और धीरे धीरे मूत्र कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर UPC + सेव जोड़ें। पारगमन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में दूसरे को अच्छी तरह से उपयोग करें।
  4. 1 दिन, ताजा UPC माध्यम के साथ UPC + सेव मध्यम बदलें। कुछ कोशिका मृत्यु के कारण वायरल cytotoxicity करने के लिए 24 घंटे के बाद देखा जाता है।
  5. Reprogrammed clon की क्षमता पर निर्भर करता हैई संरचनाओं और कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान, दिन 6 या 7 तक दैनिक मध्यम बदलते रहते हैं।
  6. पूर्व transduced कोशिकाओं (दिन में 5 या 6), mitomycin-सी (3 घंटा 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 0.1 पर 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी, के घनत्व में इलाज-MEFs चढ़ाना द्वारा MEF फीडर प्लेटें तैयार की हदबंदी करने के लिए एक दिन % जिलेटिन 100 मिमी 2 संस्कृति व्यंजन लेपित।
  7. अगले दिन (दिन 6 या 7), 0.25% trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग कर देना UPC मध्यम और प्लेट 5 एक्स 10 4 में कोशिकाओं resuspend - 2 x 10 5 कोशिकाओं / 100 मिमी 2 MEF फीडर थाली।
  8. अगले दिन, वह मध्यम करने के लिए स्विच और मध्यम हर दिन बदल जाते हैं। बदल कोशिकाओं की निगरानी के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का पालन।
    नोट: कोशिकाओं विशेषता cobblestone आकारिकी और cytoplasmic अनुपात करने के लिए उच्च नाभिक होने (12-18 दिनों के बाद पारगमन) के साथ प्रतिरूप समुच्चय के रूप में।
  9. दो से तीन सप्ताह के भीतर पारगमन के बाद, कालोनियों लेने और clon के लिए नई प्लेटों के लिए स्थानांतरणअल विस्तार।
  10. 37 पर 1 घंटे के लिए टीआरए-1-81 एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा IPSC क्लोन के चयन के लिए जीना सेल धुंधला सम्पन्न डिग्री सेल्सियस सीओ में सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ काउंटर धुंधला द्वारा 2 इनक्यूबेटर का पालन किया।
  11. करने के लिए एक 26 जी 1 आधा इंच सुई का प्रयोग छोटे बराबर आकार के टुकड़ों में बड़ा टीआरए-1-81 सकारात्मक IPSC क्लोन (क्लोन प्रति 4-6 टुकड़े) पार हैच।
  12. उठाओ और स्थानांतरण Matrigel के प्रत्येक अच्छी तरह से (10 माइक्रोग्राम प्रति / 2 सेमी) में एकाधिक क्लोन से 10-20 पार रची टुकड़े hes माध्यम के साथ 24 अच्छी तरह से थाली लिपटे एक बाँझ पिपेट की नोक का प्रयोग करें।
    नोट: एक ही कुएं में व्यक्तिगत रूप से चढ़ाया एक एकल क्लोन से मोहरे विस्तार या pluripotency बनाए रखने के लिए नहीं है।
  13. Reprogrammed क्लोन Matrigel सतह से जुड़े होते हैं के बाद IPSC मध्यम करने के लिए hes से 24-48 घंटा बदलें।
  14. Matrigel लेपित प्लेटें, मैन्युअल scra पर रखरखाव के दौरानपीई बंद पूरी तरह से reprogrammed और pluripotent dystrophic IPSC (एमडी-IPSC) क्लोन के लिए समृद्ध करने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग कर किसी भी विभेदित कोशिकाओं या contaminating MEF फीडर कोशिकाओं।
  15. व्यक्तिगत क्लोन ~ 100 माइक्रोन आकार तक पहुँच चुके हैं, के बाद तीन मिनट के लिए 0.48 मिमी EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) समाधान के साथ अलग कर और IPSC माध्यम में निलंबित एमडी-IPSCs के छोटे सेल समुच्चय चढ़ाना द्वारा क्लोन का विस्तार (5 माइक्रोन Y27632, रो Kinase के साथ पूरक अवरोध करनेवाला ) ताजा Matrigel (10 माइक्रोग्राम प्रति / 2 सेमी पर) 12 अच्छी तरह से थाली में लिपटे। दैनिक IPSC मध्यम बदलें।
  16. प्रत्येक क्लोन के पूर्ण reprogramming के OSKM जीन और pluripotency मार्कर (Oct3 / 4 और टीआरए-1-81) का immunohistochemical धुंधला के दोनों जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। Pluripotency क्षमता का एक कठोर मूल्यांकन पूरी तरह से reprogrammed IPSC लाइनों तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकते हैं पुष्टि करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। इस embryoid शरीर (ईबी) के गठन और भेदभाव परख या एक आतंकवाद से या तो पूरा किया जा सकता हैatoma गठन परख।

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Representative Results

(क्रमशः 97.37%, 97.09%, और 97.3%; चित्रा 1 ए और 1 बी) मानव मूत्र से पृथक अधिकांश पूर्वज कोशिकाओं CD44, CD73, और CD146 के रूप में uroepithelial पूर्वज और pericyte मार्करों के लिए सकारात्मक रहे हैं। इन कोशिकाओं को भी इस तरह के अल्फा-चिकनी पेशी actin और vimentin (चित्रा 1 बी) के रूप में अन्य mesenchymal मार्करों व्यक्त किया। आरटी पीसीआर विश्लेषण cytokeratin-7 के कमजोर अभिव्यक्ति है कि वहाँ में संस्कृतियों में कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी का सबूत देता है (सी-7) और Uroplakin (उत्तर प्रदेश) -Ia और -IIIa, uroepithelial वंश के मार्कर (चित्रा 1C)।

reprogramming के चरणों 2A चित्रा में योजनाबद्ध द्वारा संक्षेप हैं। प्रतिनिधि छवियाँ प्रोटोकॉल (चित्रा 2B) भर में अलग अलग समय बिंदुओं के दौरान कोशिकाओं की आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है। मूत्र कोशिकाओं लम्बी से, प्रकार द्वितीय कोशिकाओं एक cobblestone पैटर्न में (0 दिन) (4 दिन) reprogramming के दौरान बदलना। बीY 12 दिन, ठेठ pluripotent क्लोन (IPSC) देखा और फीडर मुक्त शर्तों के तहत उनके pluripotent आकृति विज्ञान (IPSC-p2) बनाए रखने में सक्षम हैं। टीआरए-1-81 के लिए लाइव सेल धुंधला reprogrammed क्लोन (चित्रा -2) को पहचानती है।

वेक्टर और transgene मुक्त pluripotent क्लोन की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए, आरटी पीसीआर सेव वायरल जीनोम के खिलाफ प्राइमरों और exogenous OSKM कारकों में से प्रत्येक का उपयोग किया जाता है। अंतर्जात reprogramming के कारकों में से अप-विनियमन भी इस कदम पर इस बात की पुष्टि की जा सकती है। बहिर्जात जीन की अभिव्यक्ति नहीं रह बीतने-13 ने पता लगाया है, लेकिन अंतर्जात कारकों की अप-विनियमन (चित्रा 3A) में देखा जाता है। Immunofluorescent धुंधला IPSCs पर pluripotency मार्कर अभिव्यक्ति की पुष्टि करता है (Oct3 / 4 और टीआरए-1-81; 3B चित्रा)। मूत्र कोशिकाओं में देखा अंतर्जात reprogramming के जीन की अभिव्यक्ति अन्य दैहिक सेल के सूत्रों की तुलना में, उच्च क्षमता 1 पर reprogram करने के लिए इन कोशिकाओं को जन्म दे सकती है। एक्सप्रेशंसडिस्ट्रोफ़िन जीन और प्रोटीन की सायन immunofluorescence धुंधला द्वारा सत्यापित किया जाता है, पश्चिमी धब्बा (पश्चिम बंगाल) और आरटी पीसीआर (चित्रा -3 सी-ई) का विश्लेषण करती है। डिस्ट्रोफ़िन के लिए जंगली प्रकार UCs और IPSCs की Immunofluorescent धुंधला IPSCs में स्पष्ट परमाणु स्थानीयकरण 11 दिखाना है, लेकिन बहुत कुछ UCs सकारात्मक (चित्रा -3 सी) व्यक्त की है। कोशिकाओं में डिस्ट्रोफ़िन अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए, डिस्ट्रोफ़िन के लिए immunoblot विश्लेषण dystrophic IPSCs डिस्ट्रोफ़िन जीन अभिव्यक्ति की कमी है, जबकि सर्वव्यापक डिस्ट्रोफ़िन isoform (Dp71) से undetectable Dp71 अभिव्यक्ति (चित्रा 3 डी), जंगली प्रकार IPSCs में उत्पादित प्रमुख isoform गया है कि पता चला। डिस्ट्रोफ़िन की एक्सॉन विलोपन म्यूटेशन नष्ट कर दिया एक्सॉनों flanking विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग dystrophic IPSCs में पुष्टि की जा सकती है। जंगली प्रकार IPSCs डिस्ट्रोफ़िन प्रतिलेख प्रवर्धन (3E चित्रा) का प्रदर्शन, जबकि कोई पीसीआर प्रवर्धन dystrophic IPSCs में पता चला है।

"हमेशा" =>-पृष्ठ के भीतर चित्रा 1
पृथक मूत्र कोशिकाओं (UCS) चित्रा 1. विशेषता uroepithelial पूर्वज, mesenchymal और चिकनी पेशी प्रजातियों से पता चलता है। (ए) के फ्लो UCs की cytometric विश्लेषण uroepithelial और pericyte मार्कर CD44, CD73 और CD146 के खिलाफ संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ जांच की। CD44, αSMA और vimentin साथ UCs (बी) Immunofluorescent धुंधला। अल्फा-चिकनी पेशी actin (αSMA) के जीन की अभिव्यक्ति सकारात्मक नियंत्रण के बराबर है, जबकि सकारात्मक नियंत्रण के नमूने की तुलना में (सी) UCs के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल सी.के.-7 और ऊपर आइए और ऊपर IIIa के कमजोर अभिव्यक्ति दिखा। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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यूसी चित्रा 2. Reprogramming IPSCs उत्पन्न करने के लिए। Reprogramming के समय के (ए) योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (बी) दिवस 0 (सेव पारगमन), 4 दिन (रूपात्मक संक्रमण), 12 दिन में सेव पारगमन के दौरान UCs के विभिन्न morphologies का प्रतिनिधित्व छवियाँ, (pluripotent क्लोन MEFs पर उभरते) और फीडर से मुक्त शर्तों के तहत विशेषता IPSC क्लोन (IPSC Matrigel पर -P2)। (सी) टीआरए-1-81 दिवस पर 17 pluripotent कालोनियों की पहचान करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
वायरल जीनोम और Transgene फ्री IPSCs चित्रा 3. जनरेशन। (ए)अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति भर बनी रहती है, जबकि जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण बीतने 2 (IPSC-p2) और पारित होने के 13 (IPSC-P13) से उनके लापता होने पर सेव जीनोम और OSKM transgenes की मौजूदगी से पता चलता है। UCs और उसके एवज में IPSCs में Oct3 / 4 और टीआरए-1-81 धुंधला की तुलना (बी) के चरण विपरीत छवियों और immunofluorescence। (सी) डिस्ट्रोफ़िन जंगली प्रकार UCs, और (डी) विशिष्ट डिस्ट्रोफ़िन isoform (Dp71) पश्चिम बंगाल से इसकी पुष्टि की जा सकती है की तुलना में जंगली प्रकार IPSCs में इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने पता लगाया है। (ई) आर टी पीसीआर विश्लेषण जंगली प्रकार UCs और IPSCs की तुलना में dystrophic IPSCs में विशिष्ट डिस्ट्रोफ़िन एक्सॉन हटाए जाने की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पंचायती राज की तालिका 1. सूचीमेर दृश्यों।

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Discussion

IPSCs का उपयोग कर हृदय रोगों मॉडलिंग आनुवंशिक योगदान 4-6 समझने के लिए एक साझा दृष्टिकोण होता जा रहा है। रोगियों से सेल के नमूने प्राप्त करने के कुछ अप्रत्याशित कठिनाइयों, विशेष रूप से युवा बच्चों, इस तरह के एक मूत्र संग्रह के रूप में एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण के विकल्प की पेशकश करने से बचा जा सकता है। इस युवा रोगी जनसंख्या में, यह reprogramming के लिए पर्याप्त मूत्र कोशिकाओं उपज के लिए पर्याप्त मूत्र की मात्रा एकत्र करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। तरल पदार्थ मूत्र संग्रह करने से पहले 30 मिनट के लिए पीने के लिए युवा रोगियों कोचिंग मूत्र सेल अलगाव की सफलता में सुधार। हालांकि, दोहराने मूत्र संग्रह इस आबादी में आवश्यक हो सकता है। हम संयुक्त और पेशी dystrophy के साथ रोगियों से UCs के अलगाव और संस्कृति का अनुकूलन करने के क्रम में दो अलग अलग प्रोटोकॉल 3,7 ढाल लिया है।

प्रेरित स्टेम सेल पेशी dystrophy Patien से त्वचा fibroblasts या मूत्र कोशिकाओं से या तो उत्पन्न किया गया हैटीएस 1,2। हालांकि, दोनों reprogramming के प्रोटोकॉल दैहिक कोशिकाओं में reprogramming के कारकों को पेश करने lentiviruses पर भरोसा किया। Transgene के बेतरतीब ढंग से मेजबान जीनोम में एकीकृत करता है और (8 में समीक्षा) transgene पुनर्सक्रियन या उत्परिवर्तजनन या तो कारण बनता है तो यह एकीकृत करने के वायरस वितरण पद्धति समस्याग्रस्त किया जा सकता है। इसलिए, हम एक गैर समेकित करने के तरीके से नौ में मूत्र कोशिकाओं में OSKM ट्रांसजीन transduce को सेंडाइ वायरस का उपयोग करके इन तकनीकों पर सुधार।

UCs reprogram करने के लिए सेंडाइ वायरस का उपयोग कर इस विधि में एक उच्च पारगमन क्षमता 9,10 के साथ एक गैर समेकित करने के दृष्टिकोण का लाभ प्रदान करता है। पेशी dystrophy रोगियों से एकत्र मूत्र कोशिकाओं 2-3 सप्ताह के बाद पारगमन के भीतर reprogrammed रहे हैं। ये reprogramming कैनेटीक्स lentiviral पारगमन एक का उपयोग कर यूसी reprogramming के लिए तुलना कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल मूत्र सेल reprogramming के लिए फीडर से मुक्त विधि की स्थापना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, हो सकता हैपेशी dystrophy रोगियों से अलग मूत्र कोशिकाओं के सेंडाइ वायरस पारगमन का उपयोग कर एक कारगर तरीका आईएनजी। वर्णित इस विधि को पूरी तरह से पारित होने के दो पर फीडर मुक्त परिस्थितियों को हस्तांतरण करने से पहले pluripotent एमडी क्लोन स्थापित करने के क्रम में एक फीडर परत के रूप में MEFs पर निर्भर करता है।

डिस्ट्रोफ़िन प्रोटीन की Dp71 isoform के परमाणु वितरण लंबे समय से अलग भ्रूण चरण सेल मॉडल 11,12 में स्थापित किया गया है। जल्दी पूर्वज / भ्रूण चरण कोशिकाओं के परमाणु मैट्रिक्स अंश में Dp71 के इस सर्वव्यापी अभिव्यक्ति परमाणु वास्तुकला और सेल चक्र विनियमन 12 में उनकी भूमिका का पता चलता है। हमारे reprogrammed जंगली प्रकार IPSCs Dp71 व्यक्त; हालांकि, dystrophic IPSCs में अपनी अनुपस्थिति reprogramming या dystrophic कोशिकाओं के pluripotent संभावित को बाधित नहीं करता है। अंत में, dystrophic जीन म्यूटेशन reprogrammed IPSCs में संरक्षित कर रहे हैं; यह एक कुशल उपकरण बनाने dystrophic कार्डियोमायोपैथी मॉडल करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
4 Oz. Specimen Cup with Lid STL Medical Supply M9AMSAS340 For Urine Sample Collection
15 ml BD-Falcon Tubes Fisher Scientific 352097
50 ml BD-Falcon Tubes Fisher Scientific 352098
Round Glass Coverslips Fisher Scientific 12-545-81
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A1378-001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Pen-Strep w/o Glutamine  Life Technologies 15140-122 Warm in 37 °C water bath before use
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093 Warm in 37 °C water bath before use
B-27 Supplement w/Insulin (50x) Life Technologies 17504-044 Warm in 37 °C water bath before use
B-27 Supplement w/o Insulin (50x) Life Technologies 0050129SA Warm in 37 °C water bath before use
DMEM/F12 (1:1) Life Technologies 11330-032 Warm in 37 °C water bath before use
Versene, 1:5,000 Life Technologies 15040066 Warm in 37 °C water bath before use
bFGF (10 µg) Life Technologies 13256-029 Warm in 37 °C water bath before use
Cell Counter Cartridges Life Technologies C10228
Knockout Serum (500 ml Bottle) Life Technologies 10828-028 Warm in 37 °C water bath before use
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies 12648-010
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid Life Technologies 17005-042 Warm in 37 °C water bath before use
DMEM, High Glucose, Glutamax Life Technologies 10566-016 Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F-12 Nutrient Mix  Life Technologies 11765-054 Warm in 37 °C water bath before use
EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form Life Technologies PHG0311L Warm in 37 °C water bath before use
Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln Life Technologies 12585-014 Warm in 37 °C water bath before use
TeSR-E8 Stem Cell Technologies 5940 Warm in 37 °C water bath before use
ROCK Inhibitor (Y-27632) Selleck S1049 Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel BD Biosciences 354277 hESC Qualified Matrix, LVED Free
RNeasy Mini Kit  Qiagen 74104
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) Thermo-Scientific K1081
FBS-Qualified Sigma Aldrich F6178 Warm in 37 °C water bath before use
Adenine Bioreagent Sigma Aldrich A2786-5G Warm in 37 °C water bath before use
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma Aldrich C8052-.5MG Warm in 37 °C water bath before use
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1G Warm in 37 °C water bath before use
Holo-transferrin from human Sigma Aldrich T0665-50MG Warm in 37 °C water bath before use
3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma Aldrich T6397-100MG Warm in 37 °C water bath before use
DAPI  Santa Cruz Biotechnology SC-3598
Fluoromount Aquous mounting medium Sigma Aldrich F4680
16% Paraformaldehyde Alfa-Aesar 43368
Antibodies
Mouse anti CD44 - labeled with FITC  BD Biosciences 560977
Mouse anti CD146 - labeled with PE BD Biosciences 561013
Mouse anti CD73 - labeled with PE BD Biosciences 561014
Mouse anti-α-smooth muscle actin Sigma Aldrich A2547
Mouse anti-Vimentin Abcam ab8978-100
Mouse Anti - TRA-1-81 Life Technologies 411100
Rabbit anti Oct 3/4 Santa Cruz Biotechnology SC-9081
Mouse Anti Dystrophin Leica Biosystems NCL-DYSB

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References

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चिकित्सा अंक 95 कोशिका जीव विज्ञान स्टेम मूत्र ली गई कोशिकाओं (UCS) मैरीलैंड (स्टेम सेल (IPSCs) reprogramming सेंडाइ वायरस (सेव) वायरल पारगमन cardiomyocytes (ICMS) IPSC व्युत्पन्न पुनर्योजी चिकित्सा पेशी Dystrophy प्रेरित ) dystrophic कार्डियोमायोपैथी।
पेशी Dystrophy रोगियों से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी: मूत्र ली गई कोशिकाओं के कुशल एकीकरण मुक्त Reprogramming
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Afzal, M. Z., Strande, J. L. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells. J. Vis. Exp. (95), e52032, doi:10.3791/52032 (2015).

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