Bu protokol, kas distrofisi hastalarından idrardan türetilmiş hücrelerin izolasyonu için ayrıntılı prosedürler gerektirir; Sendai virüsü transdüksiyonu yoluyla verimli ve hızlı yeniden programlamaları.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Distrofik kardiyomiyopati müsküler distrofi bir tam olarak anlaşılamamıştır sonucudur. Kas distrofisi olan hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretilmesi, in vitro bir hastalık modeli sistemleri için çok değerli bir hücre kaynağıdır ve ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Hasta türetilmiş idrar hücreleri distrofik kardiyomiyopati 1 modellemek için uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine başarılı bir yeniden programlama kullanılmıştır. Vektör sistemlerinin entegre güvenlik endişelerini hitaben, biz Yamanaka transdüksiyon müsküler distrofi hastalardan alınan idrar hücrelerine faktörler olmayan bir entegre Sendai virüsü vektörü kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokol, tamamen 2-3 hafta içinde klonlar yeniden programlanan üretir. pluripotent hücreler geçit-13 vektör-ücretsizdir. Bu distrofik iPSCs kardiyomiyositlerde ayrılmakta ve hastalık mekanizmalarını tam ve ilaç taraması için çalışma halinde kullanılabilir.
Giriş
Kardiyomiyopati Duchenne ve Becker kas distrofisi (MD) olan hastalarda ölüm ikinci önde gelen nedenidir. X'e bağlı distrofin genindeki mutasyonlar 1 ortaya karşın: 3.500 erkek doğum, çok az ilerici kalp kası hasarına yol açan moleküler ve hücresel olaylar hakkında bilinmektedir. Müsküler distrofi hastalardan elde edilen insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri altta yatan hastalık mekanizmaları incelemek ve ilaç 1,2 tarama için kullanılacak yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır.
cilt biyopsisi veya kan örneklerinin beklenen rahatsızlık çalışması katılım için onay vermek, genç hastalar ve / veya onların veliler caydırmak ol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Hastalar ve / veya veliler çalışmayı onayladı bir Kurumsal Değerlendirme Kurulu katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir.
1. Tamponlar ve Medya Hazırlıklar
- Yıkama tamponu: yıkama tamponu 100 ml hazırlamak fosfat tamponlu salin (PBS) ile 99 ml 100x pen / strep çözeltisi (Streptomisin 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml), 1 ml ekleyin.
- İdrar Progenitor Hücre (UPC) Orta: UPC orta hazırlamak keratinosit Serum Ücretsiz (KSF) Orta + Progenitor Hücre Orta eşit hacimlerde karıştırmak için.
- KSF Orta: epidermal büyüme faktörü 5 ng / ml (EGF), büyükbaş hayvan hipofız bezi ekstraktı, 50 ng / ml (BPB), kolera to....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
(Sırasıyla, 97,37%, 97.09%, ve% 97.3; Şekil 1A ve 1B) insan idrarından izole en projenitör hücreleri, CD44, CD73 ve CD146 gibi epitelyal progenitör ve perisit işaretleri için pozitiftir. Bu hücreler, aynı zamanda, alfa-düz kas aktin ve vimentin (Şekil 1B) gibi diğer mezenşimal ifade edilen işaretçileri değiştirmemiştir. RT-PCR analizi sitokeratin-7 zayıf sentezleme olduğu kültürlerin hücre oluşan karışık bir popülasyonda kanıt sağlar (CK-7) ve Uroplakin (UP) Ia--IIIa, e.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IPSCs kullanarak kardiyovasküler hastalıklar Modelleme genetik katkı 4-6 anlamak için ortak bir yaklaşım haline gelmektedir. Hastaların hücre örnekleri elde bazıları beklenmedik zorluklar, özellikle küçük çocuklar, böyle bir idrar toplama gibi bir non-invaziv bir yaklaşım seçeneği sunarak önlenebilir. Bu genç hasta popülasyonunda, bu yeniden programlama için yeterli idrar hücreleri elde etmek için yeterli idrar hacmini toplamak genellikle zordur. Sıvıları idrar toplama öncesinde 30 dakika içmek için genç hast.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu protokolün geliştirilmesi, Daha Sağlıklı Bir Wisconsin'in Geliştirilmesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, Translasyonel Bilimleri Geliştirme Ulusal Merkezi tarafından 8UL1TR000055 Hibe Numarası ile desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Kapaklı Numune Kabı | İdrar Örneği Toplama için | STL Medical Supply | M9AMSAS340 |
| 15 ml BD-Falcon Tüpleri | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tüpleri | Fisher Scientific | 352098 | |
| Yuvarlak Cam Lameller | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Yeniden Programlama Kiti | Yaşam Teknolojileri | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Yaşam Teknolojileri | 10010-023 | |
| Glutaminsiz Pen-Strep | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | 37 °C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| B-27 İnsülinçli Takviye (50x) | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| B-27 İnsülinsiz Takviye (50x) | Yaşam Teknolojileri | 0050129SA | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| DMEM/F12 (1:1) | Yaşam Teknolojileri | 11330-032 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Versene, 1: 5.000 | Yaşam Teknolojileri | 15040066 | 37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu |
| bFGF (10 & mikro; g) | Yaşam Teknolojileri | 13256-029 | 37 & derece'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Hücre Sayacı Kartuşları | Yaşam Teknolojileri | C10228 | |
| Nakavt Serumu (500 ml Şişe) | Yaşam Teknolojileri | 10828-028 | 37 °C Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Geri Kazanım Hücre Kültürü Dondurma Orta Yaşam Teknolojileri | 12648-010 | ||
| Keratinosit-SFM (1x), Sıvı Yaşam Teknolojileri | 17005-042 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu | |
| DMEM, Yüksek Glikoz, Glutamax | Yaşam Teknolojileri | 10566-016 | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Ham's F-12 Besin Karışımı | Yaşam Teknolojileri | 11765-054 | 37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| EGF Rekombinant İnsan Proteini, Sıvı Form | Yaşam Teknolojileri | PHG0311L | 37 °C Ilık; Kullanmadan önce C su banyosu |
| İnsülin, İnsan Rekombinant, Çinko Soln | Life Technologies | 12585-014 | 37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| TeSR-E8 | Kök Hücre Teknolojileri | 5940 37 | ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| ROCK İnhibitörü (Y-27632) | Selleck | S1049 | 37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Nitelikli Matris, LVED Ücretsiz |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Sentez Kiti | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Termo-Scientific | K1081 | |
| FBS Nitelikli | Sigma Aldrich | F6178 | 37 °C &°C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Adenin Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | 37 ° C'de sıcak; C kullanmadan önce su banyosu |
| Vibrio cholerae< / em> | Sigma Aldrich | C8052-.5MG'den | 37 derecede sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Hidrokortizon | Sigma Aldrich | H0888-1G | 37 ° C'de ısıtın; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Sigma Aldrich | T0665-50MG'den | Holo-transferrin | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| 3,3 ',5-Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu | Sigma Aldrich | T6397-100MG | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| DAPI | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-3598 | |
| Fluoromount Susu montaj ortamı | Sigma Aldrich | F4680 | |
| %16 Paraformaldehit | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antikorlar | |||
| Mouse anti CD44 - FITC ile etiketlenmiş | BD Biosciences | 560977 | |
| Fare anti CD146 - PE ile etiketlenmiş | BD Biosciences | 561013 | |
| Fare anti CD73 - PE ile etiketlenmiş | BD Biosciences | 561014 | |
| Fare anti-&alfa;-düz kas aktini | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Fare anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Fare Anti - TRA-1-81 | Yaşam Teknolojileri | 411100 | |
| Tavşan anti Ekim 3/4 | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-9081 | |
| Fare Anti Distrofin | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Kaynaklar
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
