Abstract
Distrofik kardiyomiyopati müsküler distrofi bir tam olarak anlaşılamamıştır sonucudur. Kas distrofisi olan hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretilmesi, in vitro bir hastalık modeli sistemleri için çok değerli bir hücre kaynağıdır ve ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilir. Hasta türetilmiş idrar hücreleri distrofik kardiyomiyopati 1 modellemek için uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine başarılı bir yeniden programlama kullanılmıştır. Vektör sistemlerinin entegre güvenlik endişelerini hitaben, biz Yamanaka transdüksiyon müsküler distrofi hastalardan alınan idrar hücrelerine faktörler olmayan bir entegre Sendai virüsü vektörü kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokol, tamamen 2-3 hafta içinde klonlar yeniden programlanan üretir. pluripotent hücreler geçit-13 vektör-ücretsizdir. Bu distrofik iPSCs kardiyomiyositlerde ayrılmakta ve hastalık mekanizmalarını tam ve ilaç taraması için çalışma halinde kullanılabilir.
Introduction
Kardiyomiyopati Duchenne ve Becker kas distrofisi (MD) olan hastalarda ölüm ikinci önde gelen nedenidir. X'e bağlı distrofin genindeki mutasyonlar 1 ortaya karşın: 3.500 erkek doğum, çok az ilerici kalp kası hasarına yol açan moleküler ve hücresel olaylar hakkında bilinmektedir. Müsküler distrofi hastalardan elde edilen insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri altta yatan hastalık mekanizmaları incelemek ve ilaç 1,2 tarama için kullanılacak yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır.
cilt biyopsisi veya kan örneklerinin beklenen rahatsızlık çalışması katılım için onay vermek, genç hastalar ve / veya onların veliler caydırmak olabilir. İdrar numuneleri yeniden programlama yöntemleri iyileştirilebilir olan somatik hücre non-invaziv bir kaynağıdır. Son zamanlarda, kas distrofisinin, hastalardan toplanan idrar hücreler kültürlendi olabileceğini göstermiştir ve verimli bir şekilde Yamanaka faktörleri ile retroviral transdüksiyonu ile iPSCs (içine yeniden programlanabilir adresOct3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-Myc; OSKM) 1. retroviral gen aktarımı dezavantajı konak kromozom içine yeniden programlanması genlerin rastgele bütünleşmesidir. Bu sınırlamayı aşmak için, biz idrar hücre yeniden programlama olmayan entegre Sendai virüsü kullandık.
Bu protokol daha sonra çalışma için kardiyomiyositlerde ya da diğer hücre tiplerine ayırt edilebilir kas distrofisi hastalardan elde edilen idrar hücrelerinin Sendai virüsü yeniden programlama göstermektedir. Bu protokol, aynı zamanda diğer hasta belirli hastalıklar için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hastalar ve / veya veliler çalışmayı onayladı bir Kurumsal Değerlendirme Kurulu katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir.
1. Tamponlar ve Medya Hazırlıklar
- Yıkama tamponu: yıkama tamponu 100 ml hazırlamak fosfat tamponlu salin (PBS) ile 99 ml 100x pen / strep çözeltisi (Streptomisin 100 U / ml penisilin + 100 ug / ml), 1 ml ekleyin.
- İdrar Progenitor Hücre (UPC) Orta: UPC orta hazırlamak keratinosit Serum Ücretsiz (KSF) Orta + Progenitor Hücre Orta eşit hacimlerde karıştırmak için.
- KSF Orta: epidermal büyüme faktörü 5 ng / ml (EGF), büyükbaş hayvan hipofız bezi ekstraktı, 50 ng / ml (BPB), kolera toksini, 30 ng / ml, ve pen / strep çözeltisi (100 u ilave keratinosit ortamı hazırlamak için / ml penisilin, 500 ml, KSF ortam için, 100 ug / ml streptomisin).
- Progenitor Hücre Orta: FBS, 0.4 ug / ml hidrokortizon, 0.1 Ham-F12 medya dörtte biri ile DMEM dörtte üçü ekleyin ve% 10 ile eknM, kolera toksini, 5 ng / ml insülin, 1.8 x 10 -4 M adenin / ml transferin, 2 x 10 -9 M triiyodo tironin, 10 ng / ml EGF ve pen / strep solüsyonu 5 ug.
- embriyonik kök Ortamı:% 20 KO-serum yerine (K-SR), 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 100 uM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml bFGF ve pen / strep ekleyin 400 mi DMEM / F12 ortamı.
2. İdrar Numune Toplama
- Idrar yeterli miktarda (~ 30-40 ml) tahsil edilebilir olmasını sağlamak için idrar toplama 30 dakika önce sıvıları içmek hasta söyleyin.
- Hasta ve / veya onların veliler aşağıdaki öğeleri içeren bir idrar toplama kiti ver: (1) steril ya da temiz yakalamak idrar örneği almak için nasıl yazılı talimatlar, (2) nemli bir anti-bakteriyel tuvaletler, ve (3) 100 ml steril örnek toplama fincan. Örnek toplamak için hasta söyleyin.
- Hemen buz üzerinde idrar örnekleri yer ve laborant transferBir soğutucu tory. Hemen hücre izolasyonu için idrar işleyin. Bir gecikme kaçınılmaz ise, hücre canlılığı kaybıyla kadar 4 saat boyunca buz üzerinde numune saklamak.
3. İzolasyon ve İdrar Hücreleri Genişleme
NOT: Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın.
- Steril pipetler kullanarak, transferi idrar örnekleri 50-ml santrifüj tüpleri steril alanlar. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Tüp içinde 1 ml bırakarak süpernatant aspire; Hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
- Süspanse yıkama tamponu 7 ml birden çok tüpünden elde edilen taneler bir araya ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de tekrar santrifüj ve.
- Dikkatle hücre pelet ve süpernatant ~ 0,2-0,5 ml bırakarak, süpernatant aspire. İdrar Progenitor Hücre (UPC) orta 2-3 ml süspanse ve un 4-6 kuyulara süspansiyon transferikaplanmış 24 oyuklu plaka.
- 72 saat sonra, göz başına taze UPC ortamı, 0.5 ml kültür ek ve 2-3 gün sonra ortam değiştirin. plaka takmak gerekmez eritrosit ve skuamöz hücreler orta değişikliklerle silinecektir.
- 4-6 gün sonra kültür izleyin.
NOT: Küçük 2-4 hücre kolonileri görünmeye başlayacak. Hücreler yuvarlak veya tip I veya renal epitel (RE) hücrelerin sırasıyla 3 tip II temsil eden uzamış olacaktır. - Hücreler görünür bir kez, onlar hızlı bir genişleme fazı uğrayacak beri her 2-3 günde orta değiştirin.
- Hücreler% 80-90, kaplama sonra yaklaşık 9-15 gün ulaştıklarında, daha da genişlemesi için 24 plaka 2-4 kuyuları üzerine hücreleri (15,000-18,000 hücre / cm 2) ayırmak ve geçit. Hücre geçişi 1 (P1) olarak bu işaretleyin.
- Akım sitometri analizi yoluyla soy özellikleri için idrar hücreleri karakterize immunohistochemnik boyama ya da ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla (RT-PCR).
- Uzun süreli dondurulup saklanma (DMEM% 10 serum ve% 10 DMSO ile desteklenmiş) izole idrar hücreleri (bölüm 4) reprogram veya Orta Donma onları aşağı dondurma.
Sendai Virüs Kullanılması 4. İdrar Hücre yeniden programlanması
NOT: transfekte maddeler işlenirken doğru kullanımı ve PPE (kişisel koruyucu ekipman) kullanılması tavsiye edilir. Bir BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabinesi steril koşullar altında aşağıdaki adımları uygulayın. ajan ve / veya transfekte hücreleri transfekte uygun atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak idrar hücre yeniden programlanması için, üreticinin besleyici bağımlı protokol değişiklikleri ile Sendai yeniden programlanması Kit kullanın.
- Sendai virüsü kullanarak yüksek verim yeniden programlama sağlamak için, kullanım hızlı olan idrar hücrelerinin 1-5 geçişlerily bölünmesi. Hücreler de çoğaltmak veya yaşlanınca yoksa onlar verimli reprogram olmayacak gibi, onları atın.
- Tohum, 6 gözlü bir plakanın iki kuyu içinde oyuk başına 60,000 hücre. Mark Day -2 olarak bu. Hücre tohumlama yoğunluğunu ayarlayın (5 x 04-09 Ekim x 10 4 hücre kuyu başına) Günün 0% 80-90 ulaşmak için gerektiği gibi.
- Gün 0 (hücreleri kaplama sonra 48 saat), dört OSKM faktörlerin her içeren Sendai yeniden programlama vektörleri (SeV) hazırlamak. Önceden ısıtılmış UPC ortamı, 1 ml için vektörlerin her ekleyin. Yeniden programlama idrar hücreleri için yeterli olan 1-1.5 MOI (5-7,5 x 10 5 UKÜ) kullanın. Orta aspire ve yavaş yavaş idrar hücrelerinin bir kuyuya 1 ml UPC + Sev ekleyin. Transdüksiyon negatif kontrol olarak ikinci kuyu kullanın.
- Gün 1, taze UPC ortam ile UPC + SeV orta yerine. Bazı hücre ölümü nedeniyle viral sitotoksisite 24 saat sonra görülür.
- Reprogrammed Clon verimliliğine bağlıE oluşumları ve kompakt morfolojisi, günde 6 ya da 7 kadar günlük orta değişen tutmak.
- Önce kalıt aktarımlı hücrelerin (gün 5 veya 6), Mitomisin-C (3 st için 10 ug / ml), 0.1 5 x 10 4 hücre / cm2, yoğunluğu tedavi-MEF'ler kaplama ile MEF besleyici plakalar hazırlamak ayrışması için bir günlük % jelatin 100 mm 2 kültür yemekleri kaplı.
- Ertesi gün (gün 6 ya da 7),% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırmak UPC orta ve plaka 5 x 10 4 hücreleri tekrar süspansiyon - 2 x 10 5 hücre / 100 mm2 MEF besleyici plaka.
- Ertesi gün, embriyonik kök ortamına geçiş ve ortam her gün değiştirin. Dönüştürülmüş hücreler izlemek için bir mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır.
NOT: Hücreler karakteristik arnavut morfolojisi ve sitoplazmik oranı yüksek çekirdeğe sahip (12-18 gün sonrası transdüksiyon) ile klonal agregatlar oluştururlar. - 2-3 hafta içinde transdüksiyon sonra, koloniler almak ve klon için yeni plakalar transferal genişleme.
- 37 ° C'de 1 saat süre ile TRA-1-81 antikoru ile inkübe edilmesi ile iPSC klonların seçilmesi için canlı hücre boyama gerçekleştirme C CO CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 1 saat boyunca özel bir floresan boya konjuge sekonder antikor ile karşı boyama ile 2 kuluçka takip etti.
- Bir 26 G 1½ inç iğne kullanın küçük eşit büyüklükte parçalar halinde büyük TRA-1-81 pozitif iPSC klonlar (klon başına 4-6 adet) çapraz yumurtadan.
- Çekme ve transfer Matrigel her çukuruna (10 ug / cm2) birden çok klonun 10-20 çapraz kesik parça embriyonik kök ortamı ile 24 yuvalı plaka -kaplı bir steril pipet ucu kullanın.
NOT: Tek bir kuyuya ayrı ayrı kaplama bir tek klon gelen adet genişletmek veya pluripotensini korumak değil. - Programlanması klonlar Matrigel yüzeyine bağlı sonra iPSC ortamına hes 24-48 saat değiştirin.
- Matrigel kaplı plakalar, manuel SCRA üzerinde bakım sırasındape-off tamamen yeniden programlanması ve pluripotent distrofik iPSC (MD-iPSC) klonları için zenginleştirmek için bir pipet-ucu kullanarak herhangi bir farklılaşmış hücre veya kontamine MEF besleyici hücreler.
- Tek tek klonlar, ~ 100 um boyutlara ulaşmış sonra, 3 dakika boyunca 0.48 mM EDTA (etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi ile ayrıştırma ve iPSC ortamda süspansiyon haline getirilmiş, MD-iPSCs küçük hücre toplulukları kaplama ile klonlar genişletme (5 uM Y27632 Rho Kinaz ile takviye önleyicisi ) taze matrigel (10 ug / cm 2) 12 plaka kaplama. Günlük iPSC orta değiştirin.
- Her bir klonun tam yeniden programlama OSKM genler ve Pluripotency belirteçlerinin (Oct3 / 4 ve TRA-1-81) immünohistokimyasal boyama her iki gen ekspresyon analizi ile tespit edilebilir. Pluripotency potansiyeli titiz bir değerlendirme tamamen reprogrammed iPSC hatları üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylamak için istihdam edilmelidir. Bu embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ve farklılaştırma denemesinde veya ter yoluyla gerçekleştirilebilmektedirAtoma formasyonu deneyi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(Sırasıyla, 97,37%, 97.09%, ve% 97.3; Şekil 1A ve 1B) insan idrarından izole en projenitör hücreleri, CD44, CD73 ve CD146 gibi epitelyal progenitör ve perisit işaretleri için pozitiftir. Bu hücreler, aynı zamanda, alfa-düz kas aktin ve vimentin (Şekil 1B) gibi diğer mezenşimal ifade edilen işaretçileri değiştirmemiştir. RT-PCR analizi sitokeratin-7 zayıf sentezleme olduğu kültürlerin hücre oluşan karışık bir popülasyonda kanıt sağlar (CK-7) ve Uroplakin (UP) Ia--IIIa, epitelyal soy belirteçleri (Şekil 1C).
yeniden programlama adımları Şekil 2A şematik olarak özetlenmiştir. Örnek görüntüler protokolü (Şekil 2B) boyunca farklı zaman noktalarında boyunca hücrelerin morfolojisini göstermektedir. idrar hücreleri uzamış gelen, tip II hücreleri Arnavut kaldırımı deseni içine (Gün 0) (Gün 4) yeniden programlama sırasında dönüşümü. By Günü 12 tipik pluripotent klonlar (iPSC) görüldü ve besleyici özgür koşullar altında pluripotent morfolojisi (iPSC-P2) muhafaza edebiliyoruz. TRA-1-81 için canlı hücre boyama Yeniden programlanan klonlar (Şekil 2C) tanımlar.
Vektör ve transgen serbest pluripotent klonlarının oluşumunu doğrulamak için, RT-PCR, SeV viral genom karşı primerler ve eksojen OSKM faktörlerin her biri kullanılarak gerçekleştirilir. endojen yeniden programlama faktörleri yukarı-düzenleme de bu aşamada teyit edilebilir. eksojen gen sentezleme artık geçit-13 tarafından tespit edilir, fakat vücut içi faktör yukarı düzenlemesi (Şekil 3A) görülmüştür. Immunofluorescent boyama iPSCs üzerinde pluripotency işaretleyici ifade doğruladı (Oct3 / 4 ve TRA-1-81; Şekil 3B). idrar hücrelerde görülen endojen yeniden programlama gen ifadesi için diğer somatik hücre kaynaklarına kıyasla daha yüksek verim 1 de yeniden programlamak için bu hücrelerin neden olabilir. expresDistrofin geni ve protein ekspresyonunu immünofloresan boyama ile doğrulanır, Western Blot (WB) ve RT-PCR (Şekil 3C-e) analiz eder. Distrofin için vahşi tip UCS ve iPSCs immunofluorescent boyama iPSCs belirgin nükleer lokalizasyonu 11 göstermek, ama çok az UCS pozitif (Şekil 3C) dile getirdi. Hücrelerde distrofin ekspresyonunu doğrulamak için, distrofin bağışıklık benekleme analizi distrofik iPSCs distrofin gen ifadesi eksik ise her yerde distrofin izoform (Dp71) tespit edilemeyen Dp71 ekspresyonu (Şekil 3D), vahşi tip iPSCs üretilen yaygın bir izoform olan olduğunu göstermektedir. distrofin ekson silme mutasyonu silinmiş eksonları yan spesifik primerler kullanılarak distrofik iPSCs teyit edilebilir. Vahşi tip iPSCs distrofin transkript amplifikasyonu (Şekil 3E) göstermektedir, öte yandan herhangi bir PCR amplifikasyonu, distrofik iPSCs saptanır.
"Her zaman" => sayfa içinde 
Izole İdrar Hücrelerinin (UCS) Şekil 1. Karakterizasyonu üroepitelyal progenitör, mezenkimal ve düz kas soy gösterir. (A) Akış UCS sitometrik analizi üroepitelyal ve perisit belirteçleri CD44, CD73 ve CD146 karşı konjuge antikorlarla sondalandı. CD44, αSMA ve Vimentinin ile UCS (B) Immunofluorescent boyama. A-düz kas aktini (αSMA) ve gen ekspresyonu, pozitif kontrol ile karşılaştırılabilir iken pozitif kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında (C) UCS gen ekspresyon profili CK-7 ve yukarı-la ve yukarı-IIIa'nın zayıf ifadesi olduğunu gösterir. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
/ 52.032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700px "upload />
UC Şekil 2. yeniden programlanması iPSCs oluşturmak için. Yeniden programlama zaman çizelgesi (A) şematik bir bakış. (B) Günün 0 (SeV iletimi), 4. Gün (morfolojik geçiş), Gün 12, SeV iletimi sırasında UCS farklı morfolojileri temsil Görüntüler, (pluripotent klonları MEF'ler üzerinde yükselen) ve besleyici içermeyen koşullar altında karakteristik iPSC klon (iPSC Matrigel -P2). (C) TRA-1-81 Gün 17 de pluripotent kolonileri tespit etmek için canlı hücre görüntüleme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Viral genomun ve Transgen Ücretsiz iPSCs Şekil 3. Nesil (A).Endojen gen ifadesi boyunca devam ederken Gen ifadesi analizi geçişi 2 (iPSC-P2) ve geçit 13 (iPSC-P13) kendi kaybolması ile SeV genomu ve OSKM transjenlerin varlığını gösterir. UCS ve sonuç iPSCs içinde Oct3 / 4 ve TRA-1-81 boyama karşılaştırılması (B) Faz kontrastlı görüntüler ve immunofloresans. (C) Distrofin vahşi tip UCS ve (D) spesifik distrofin izoform (Dp71) DB tarafından teyit edilebilir kıyasla, vahşi tip iPSCs olarak bağışıklık ile saptanır. (E) RT-PCR analizi vahşi tip UCS ve iPSCs göre distrofik iPSCs belirli distrofin ekson silme işlemini onaylamak için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Reaktif / Malzeme / Ekipman Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar |
| GAPDH-İleri Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Ters Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-İleri Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Ters Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Yukarı-la-ileri primer | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Yukarı-la-Ters Primer | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Yukarı-IIIa ileri primer | IDT A.Ş. | Sıra gyorumlarda iven | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Yukarı-IIIa Ters Primer | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-İleri Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Ters Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (Eksojen) -İlet Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (Eksojen) -Reverse Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (Eksojen) -İlet Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (Eksojen) -Reverse Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (Eksojen) -İlet Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (Eksojen) -Reverse Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (Eksojen) -İlet Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (Eksojen) -Reverse Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (Eksojen) -İlet Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (Eksojen) -Reverse Astar * | IDT A.Ş. | * Hayat Tech-Cytotune kiti | BirCCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (Endojen) -İlet Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (Endojen) -Reverse Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (Endojen) -İlet Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (Endojen) -Reverse Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Distrofin-İleri Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Distrofin-Ters Astar | IDT A.Ş. | Dizi yorumlarda verilen | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Pri Tablo 1. listesimer dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPSCs kullanarak kardiyovasküler hastalıklar Modelleme genetik katkı 4-6 anlamak için ortak bir yaklaşım haline gelmektedir. Hastaların hücre örnekleri elde bazıları beklenmedik zorluklar, özellikle küçük çocuklar, böyle bir idrar toplama gibi bir non-invaziv bir yaklaşım seçeneği sunarak önlenebilir. Bu genç hasta popülasyonunda, bu yeniden programlama için yeterli idrar hücreleri elde etmek için yeterli idrar hacmini toplamak genellikle zordur. Sıvıları idrar toplama öncesinde 30 dakika içmek için genç hastaları Koçluk idrar hücre izolasyonu başarısını artırır. Ancak, tekrar idrar koleksiyonları bu popülasyonda gerekli olabilir. Biz kombine ve müsküler distrofi hastalardan UCS izolasyonu ve kültürü optimize etmek için iki farklı protokolleri 3,7 uyarladık.
Uyarılmış pluripotent kök hücreler, müsküler distrofi, patien deri fibroblast veya idrar hücrelerden elde edilmiştirts 1,2. Ancak, her iki yeniden programlama protokolleri somatik hücre içine yeniden programlama faktörleri tanıtmak için lentivirüsler dayanıyordu. Transgen rasgele konak genomuna entegre ve (8 gözden) transgenini reaktivasyonu veya mutajenezini ya neden bu entegre virüs teslim yöntemi sorunlu olabilir. Bu nedenle, biz olmayan bir entegre şekilde 9 idrar hücrelerine OSKM transgenleri transdüse Sendai virüsü kullanarak bu tekniklerin üzerine geliştirilmiş.
UCS yeniden programlamak için Sendai virüsü kullanarak Bu yöntem daha yüksek bir iletim verimliliği 9,10 olmayan bir entegre yaklaşımın avantajı sunuyor. Müsküler distrofi hastalardan toplanan idrar hücreleri 2-3 hafta sonrası transdüksiyon içinde yeniden programlanmıştır. Bu yeniden programlanması kinetik lentiviral transdüksiyon 1 kullanarak UC yeniden programlama karşılaştırılabilir. Bu protokol idrar hücre yeniden programlama için besleyici içermeyen bir yöntem kurmak için ölçekli olmasına rağmen, olacakmüsküler distrofi hastalardan izole idrar hücrelerinin Sendai-virüs iletiminin kullanarak etkili bir yöntem ing. Tarif edilen bu yöntem, bütünüyle geçit 2'de için besleyici içermeyen koşullar transfer edilmeden önce pluripotent MD klonu tespit etmek için bir besleyici tabaka olarak MEF'ler dayanır.
distrofin proteinin Dp71 izoformuna nükleer dağılımı uzun farklı embriyonik evre hücre modellerinde 11,12 yılında kurulmuştur. Erken progenitör / embriyonik aşama hücrelerinin nükleer matris fraksiyonu Dp71 bu yerde ifade nükleer mimarisi ve hücre döngüsü düzenlenmesinde 12 rollerini göstermektedir. Bizim yeniden programlanması vahşi tip iPSCs Dp71 ifade; Bununla birlikte, distrofik iPSCs onun yokluğunda yeniden programlama ya da distrofik hücrelerin pluripotent potansiyel inhibe etmez. Sonuç olarak, distrofik gen mutasyonları reprogrammed iPSCs muhafaza edilir; o etkin bir araç yapma distrofik kardiyomiyopati model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
