Abstract
이영 심근 병증은 근육 이영양증 제대로 이해 결과이다. 근이영양증 환자에서 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하면 체외 질병 모델 시스템을위한 귀중한 셀룰러 소스 및 약물 검사 연구에 사용할 수 있습니다. 환자 뇨 - 유래 세포는 1 이영양증 심근증을 모델링하기 위해 유도 된 다 능성 줄기 세포로의 성공적인 리 프로그래밍에 사용되어왔다. 벡터 시스템을 통합의 안전성 문제를 해결하는, 우리는 야마나카의 전달은 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포에 인자 비 통합 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 완전히 2-3주 내에서 클론을 재 프로그램 생성합니다. 만능 세포 통로 (13)에 의해 벡터 무료입니다. 이 이영 iPSCs는 심근 세포로 분화 및 질병 메커니즘 또는 약물 검사에 대한 공부를 사용할 수있다.
Introduction
심근증은 뒤 시엔 느와 베커 근이영양증 (MD) 환자에서 두 번째로 높은 사망 원인이다. X-연결 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 하나 발생하더라도 3,500 남성 출산, 약간은 진보적 인 심장 근육 손상을 유도하는 분자 및 세포 이벤트에 대한 알려져있다. 근이영양증 환자 유래의 인간 유도 다 능성 줄기 세포는 기저 질환 메커니즘을 연구 약물 1,2- 스크리닝에 사용하는 신규 한 도구로 나왔다.
피부 조직 검사 또는 혈액 샘플의 예상되는 불편 함은 연구 참여에 대한 동의를하는 젊은 환자 및 / 또는 보호자를 설득 할 수 있습니다. 소변 샘플은 리 프로그래밍을 수정할 수있는 방법이다 체세포 비 침습적 원천이다. 우리는 최근 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포를 배양 할 수 있다는 것을 도시하고 효율적 야마나카 인자를 사용하여 레트로 바이러스 형질 도입 iPSCs (내로 재 프로그램 한OCT3 / 4, SOX2, Klf4 및 c-Myc와; OSKM) 1. 레트로 바이러스 유전자 전달의 단점은 숙주 염색체로 유전자의 재 프로그래밍 랜덤 통합이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 소변 세포 리 프로그래밍에 대한 비 통합 센다이 바이러스를 사용 하였다.
이 프로토콜은 추가 연구를위한 심근 세포 또는 다른 종류의 세포로 분화 할 수 근이영양증 환자의 격리 소변 세포의 센다이 바이러스의 재 프로그래밍에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 특정 환자 다른 질환을 위해 더 적응 될 수있다.
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Protocol
참고 : 환자 및 / 또는 보호자는 연구를 승인 심사위원회 (Institutional Review Board)에 참여하는 동의를 제공해야합니다.
1. 버퍼 및 미디어 준비
- 세척 버퍼 : 세척 버퍼 100 ㎖를 준비 인산염 완충 식염수 (PBS)의 99 ml의 100 배 펜 / 연쇄상 구균 솔루션 (스트렙토 마이신의 100 U / ml의 페니실린이 + 100 μg의 / ㎖) 1 ㎖를 추가합니다.
- 소변 전구 세포 (UPC) 중간 : UPC 미디어를 준비 케 라티노 세럼 무료 (KSF) 중간 + 전구 세포 매체의 동일한 볼륨을 혼합합니다.
- KSF 중간 : 표피 성장 인자의 5 ng를 / ㎖ (EGF), 소 뇌하수체 추출물의 50 ng를 / ㎖ (BPE), 콜레라 독소의 30 ng를 / ㎖, 펜 / 연쇄상 구균 용액 (100 U를 추가, 각질 세포 미디어를 준비 / ml의 페니실린 500 ml의 KSF 매체, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신).
- 전구 세포 매체 : FBS, 0.4 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 0.1 햄 F12 미디어의 1/4과 DMEM의 4 분의 3에 추가하고 10 % 보완nM의 콜레라 독소, 5 NG / ml의 인슐린, 1.8 × 10 -4 M 아데닌, / ㎖ 트랜스페린, 2 × 10 -9 M의 triiodo의 로닌, 10 NG / ml의 EGF, 펜 / 패 혈성 솔루션 5 μg의.
- 배아 줄기 중간 : 20 % KO-세럼 교체 (K-SR), 1X MEM 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 100 μM의 β 머 캅토 에탄올, 20 NG / ㎖의 bFGF 및 펜 / 패 혈성 추가 400 ㎖의 DMEM / F12 배지.
2. 소변 샘플 컬렉션
- 소변 적절한 양의 (~ 30 ~ 40 ml)을 수집 할 수 있도록 소변 컬렉션에 30 분 전에 음료수를 마시지하는 환자를 지시합니다.
- 환자 및 / 또는 보호자 다음 항목이 포함 된 소변 수집 키트를 제공한다 : (1) 멸균 또는 클린 캐치 소변 샘플을 구하는 방법에 대한 작성 지침, (2) 습기 항균 toilettes, (3) 100 ml의 멸균 표본 수집 컵. 샘플을 수집하는 환자를 지시합니다.
- 즉시 얼음에 소변 샘플을 배치하고 LABORA로 전송쿨러 토리. 즉시 세포 분리를위한 소변을 처리합니다. 지연이 불가피한 경우, 세포 생존 능력의 손실을 최소화하면서 최대 4 시간 동안 얼음에 표본을 저장합니다.
3. 분리 및 소변 세포의 확장
참고 : BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.
- 멸균 피펫을 사용하여, 전송 소변 샘플은 50 ml의 원심 분리 튜브 멸균한다. RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리한다.
- 튜브에 1 ㎖를 떠나 뜨는을 기음; 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 재현 탁은 세척 완충액 7 ㎖ 중에 다중 튜브의 펠렛을 결합하고 RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리를 반복하고.
- 조심스럽게 세포 펠렛 및 상등액 ~ 0.2 ~ 0.5 ml를 떠나, 뜨는을 대기음. 소변 전구 세포 (UPC) 매체의 2-3 용액에 재현 탁과 유엔의 4-6 우물에 정지를 전송코팅 된 24 웰 플레이트.
- 72 시간 후, 잘 당 신선한 UPC 매체의 0.5 ml의 문화를 보완하고 2 ~ 3 일 후에 매체 변경합니다. 판에 부착하지 않는 적혈구 및 편평 상피 세포 매체 변화에 제거됩니다.
- 4-6일 후 문화를 모니터링합니다.
참고 : 작은 2-4 세포 식민지가 나타 시작합니다. 세포는 둥근 또는 유형 I 또는 신장 상피 (RE) 세포를 각각 3 종류 II를 대표하는 연장됩니다. - 세포가 표시되면, 그들은 빠른 확장 단계를 거쳐야하기 때문에 2-3 일마다 매체를 변경합니다.
- 세포가 80-90 %, 도금 후 약 9-15일에 도달하면, 추가 확장 24 웰 플레이트의 2-4 우물에 세포 (15,000-18,000 세포 / cm 2) 해리와 통로. 세포 통로 1 (P1)로이를 표시합니다.
- 유세포 분석을 통해 혈통 사양 소변 세포를 특성화, immunohistochem적인 염색 또는 역전사 효소 - 중합 효소 연쇄 반응을 통한 (RT-PCR).
- 장기 cryostorage에 대한 (DMEM 10 % 혈청과 10 % DMSO로 보충) 절연 소변 세포 (섹션 4)를 다시 프로그램 또는 중간 동결에 그들을 동결.
센다이 바이러스를 사용하여 4. 소변 세포 재 프로그래밍
참고 : 트랜 에이전트를 조작하는 동안 적절한 취급과 PPE (개인 보호 장비)를 사용하는 것이 좋습니다. BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 에이전트 및 / 또는 형질 감염된 세포를 형질의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다. 아래에 설명 된대로 소변 세포 재 프로그래밍은 제조업체의 공급에 의존하는 프로토콜의 수정 센다이 리 프로그래밍 키트를 사용합니다.
- 센다이 바이러스를 사용하여 고효율의 리 프로그래밍을 보장하기 위해 사용되어 신속한 뇨 세포 1-5 통로해동 분할. 세포가 잘 복제하거나 노화가되지 않는 경우가 효율적으로 재 프로그래밍되지 않으므로 취소하십시오.
- 시드 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 60,000 세포. 마크 일 -2이. 셀 시드 농도를 조정 (5 × 10월 4일에서 9일까지 × 10 4 세포 아니라 당) 일 0으로 80-90 %에 도달하기 위해 필요에 따라.
- 0 일째 (셀 도금 후 48 시간)에서, 네 OSKM 요소 각각을 함유 센다이 리 프로그래밍 벡터 (SEV)을 제조. 미리 예열 UPC 매체의 1 ml의 벡터의 각을 추가합니다. 프로그램을 다시 소변 세포에 충분한 1.5의 MOI (5-7.5 × 10 5 CIU)를 사용합니다. 매체를 대기음 천천히 소변 세포의 잘 하나에 1 ml의 UPC + SEV를 추가합니다. 전달 음성 대조군으로 두 번째 잘 사용합니다.
- 1 일에, 신선한 UPC 매체와 UPC + SEV 매체를 교체합니다. 일부 세포의 죽음으로 인해 바이러스의 세포 독성에 24 시간 후에 볼 수 있습니다.
- 재 프로그램 클론의 효율성에 따라전자 형성하고 컴팩트 한 형태는 하루 6 또는 7까지 매일 매체를 계속 변경.
- 이전에 형질 세포 (5 일 또는 6), 미토 마이신 C (3 시간 10 ㎍ / ㎖)을 0.1에 5 × 104 세포 / cm 2의 밀도에서 처리-MEFs에 도금하여 MEF 피더 플레이트를 준비 해리에 어느 날 % 젤라틴은 100mm 2 배양 접시를 코팅.
- 다음 날 (6 또는 7 일), 0.25 % 트립신으로 세포를 해리 UPC 매체 플레이트 5 × 104 세포에 재현 탁 - 2 × 105 세포 / 100mm이 MEF 피더 플레이트.
- 다음 날, 배아 줄기 매체로 전환 한 매체 매일을 변경합니다. 형질 전환 된 세포를 모니터링 현미경으로 세포를 관찰한다.
참고 : 세포 특성 조약돌 형태와 세포질 비율이 더 높은 핵을 가진 (12-18일 게시물 전달)와 클론 집계를 형성한다. - 2~3주 내에서 전달 후, 식민지를 선택하고 클론에 대한 새로운 접시로 전송알 확장.
- 37 ℃에서 1 시간 동안 TRA-1-81 항체로 세포를 배양하여 IPSC 클론을 선택하기위한 생균 염색을 수행 ° C에서 CO는 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 특정 형광 염료와 접합 된 이차 항체 염색에 의해 대향 인큐베이터 하였다.
- 에 26 G 1.5 인치 바늘을 사용하여 작은 동일한 크기의 조각으로 큰 TRA-1-81 긍정적 인 IPSC 클론 (복제 당 4-6 개) 크로스 - 부화.
- 선택 및 전송 매트 리겔의 각 웰 (10 ㎍ / cm 2)으로 여러 클론에서 10 ~ 20 크로스 해치 조각 배아 줄기 매체 24 웰 플레이트를 코팅 처리하는 멸균 피펫 팁을 사용합니다.
참고 : 하나의 우물에 개별적으로 도금 단일 클론에서 조각 확장 또는 능성을 유지하지 않습니다. - 재 프로그래밍 클론 마트 리젤의 표면에 부착 한 후 IPSC 매체에 배아 줄기에서 24 ~ 48 시간을 변경합니다.
- 마트 리겔 코팅 플레이트, 수동 scra 유지 보수시PE-오프 완전히 재 프로그래밍과 만능 이영 IPSC (MD-IPSC) 클론 풍부하게 피펫 팁을 사용하는 차별화 된 세포 또는 오염 MEF 피더 세포를.
- 개별 클론 ~ 100 ㎛의 크기에 도달 한 후, 3 분 동안 0.48 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 용액으로 해리 및 IPSC 배지에 현탁 MD-iPSCs 작은 세포 집합체를 도금함으로써 클론 확장 (5 μM Y27632, RHO 키나제 보충 억제제 ) 신선한 마트 리겔 (10 ㎍ / cm 2) 12 웰 플레이트를 코팅. 매일 IPSC 매체를 변경합니다.
- 각 클론의 완전한 리 프로그래밍은 OSKM 유전자 및 다 능성 마커 (OCT3 / 4, TRA-1-81)의 면역 조직 화학 염색을 모두 유전자 발현 분석에 의해 결정될 수있다. 만능 전위의 엄격한 평가가 완전히 재 프로그램 IPSC 라인 세 배엽으로 분화 할 수 확인하기 위해 채용되어야한다. 이 배아 체 (EB) 형성과 분화 분석 또는 운에 의해 중 수행 할 수 있습니다atoma 형성 분석법.
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Representative Results
(각각 97.37 %, 97.09 %, 97.3 %; 그림 1A 및 1B) 인간의 소변에서 분리 된 대부분의 전구 세포는 CD44, CD73, 및 CD146 등 uroepithelial 전구 및 혈관 주위 세포 마커에 대한 긍정적이다. 이 세포는 또한 알파 - 평활근 액틴과 멘틴 (그림 1B)와 같은 다른 중간 엽 마커를 표명했다. RT-PCR 분석 아세포-7의 약한 표현이 점에서 문화 세포의 혼합 인구의 증거를 제공합니다 (CK-7) 및 Uroplakin (UP) -ia 및 -IIIa, uroepithelial 혈통의 마커 (그림 1C).
재 프로그래밍 단계는도 2a에 개략적으로 나타내었다. 대표적인 이미지는 프로토콜 (도 2B)에 걸쳐 상이한 시점 동안 세포의 형태를 보여준다. 소변 세포는 연장에서, 유형 II 셀 조약돌 패턴에 (0 일) (4 일) 재 프로그래밍하는 동안 변환. BY의 날 (12), 전형적인 만능 클론 (IPSC)는 볼 피더 무료 조건에서 만능 형태 (IPSC-P2)를 유지할 수있다. TRA-1-81에 대한 라이브 세포 얼룩은 재 프로그램 클론 (그림 2C)를 식별합니다.
벡터 및 자유 능성 트랜스 클론의 생성을 확인하기 위하여, RT-PCR은 바이러스 게놈에 대해 SEV 프라이머 및 외인성 인자 OSKM 각각을 사용하여 수행된다. 리 프로그래밍 내인성 인자들의 상향 조절은 또한이 단계에서 확인 될 수있다. 외인성 유전자의 발현은 더 이상 통로 (13)에 의해 검출되지 않고, 내인성 인자의 상향 조절 (up-regulation)는 (도 3a)을 볼 수있다. 면역 형광 염색에 iPSCs 능성 마커 발현을 확인 (OCT3 / 4, TRA-1-81을도 3B 참조). 소변에서 세포 리 프로그래밍 보이는 내인성 유전자의 발현은 다른 체세포 소스에 비해 높은 효율로 한 재 프로그래밍이 셀들을 초래할 수있다. EXPRES디스트로핀 유전자 및 단백질의 시온은 면역 형광 염색으로 확인, 웨스턴 블롯 (WB)과 RT-PCR (그림 3C-E) 분석합니다. 디스트로핀에 대한 야생형 UCS와 iPSCs의 면역 염색 iPSCs에서 분명 핵 지역화 (11)을 보여,하지만 거의 UCS는 긍정적 (그림 3C)를 표명했다. 세포에서 디스트로핀의 발현을 확인하려면, 디스트로핀에 대한 면역 분석은 이영 iPSCs는 디스트로핀 유전자 발현이 부족한 상태에서 유비쿼터스 디스트로핀 이소 형 (Dp71)이 검출되지 Dp71 식 (그림 3 차원), 야생형 iPSCs에서 생산 지배적 인 이소 한 것으로 밝혀졌다. 디스트로핀의 엑손 결실 돌연변이 삭제 엑손을 플 랭킹 프라이머를 사용하여 특정 이영양증 iPSCs에서 확인할 수있다. 야생형 iPSCs는 디스트로핀 성적 증명서 증폭 (그림 3E)를 보여 반면 어떤 PCR 증폭 이영 iPSCs에서 검출되지 않습니다.
"항상"=> 페이지 내에서 
격리 된 소변 세포 (UCS)의 그림 1. 특성화 uroepithelial 전구, 중간 엽 평활근 계보를 보여줍니다. (A) 흐름 UCS의 유세포 분석 uroepithelial 및 혈관 주위 세포 마커 CD44, CD73와 CD146에 대한 복합 항체와 프로브. CD44, αSMA 및 멘틴와 UCS의 (B) 면역 염색. 알파 - 평활근 액틴 (αSMA)의 유전자 발현이 양성 대조군에 비해 동안 양성 대조군 샘플에 비해 (C) UCS의 유전자 발현 프로파일은 CK-7 및 UP-1a 및 UP-Ⅲa에 약한 표현을 보여줍니다. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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UC 그림 2. 재 프로그래밍 iPSCs를 생성합니다. 프로그램을 다시 타임 라인의 (A) 도식 개요. (B) 0 일 (SEV 전달), 4 일 (형태 전환), 일 (12)의 SEV 전달하는 동안 UCS의 다른 형태학을 나타내는 이미지 (만능 클론 MEFs에에 신흥) 및 피더없는 조건에서 특성 IPSC 클론 (IPSC을 마트 리겔에 -P2). (C) TRA-1-81 일 17 만능 식민지를 식별하기위한 라이브 세포 이미징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
바이러스 성 게놈 및 형질 전환 유전자 무료 iPSCs 그림 3. 세대. (A)내인성 유전자 발현에 걸쳐 지속되는 동안 유전자 발현 분석 통로 (2) (IPSC-P2) 및 통로 (13) (IPSC-P13)에 의해 자신의 실종에 SEV 게놈과 OSKM의 도입 유전자의 존재를 보여줍니다. UCS 및 얻어진 iPSCs에 OCT3 / 4, TRA-1-81 염색 비교 (B) 위상차 이미지 및 면역 형광. (C) 디스트로핀 야생형 UCS, 및 (D) 특정 디스트로핀 이성체 (Dp71)은 WB에 의해 확인 될 수있다 비해 야생형 iPSCs에서 면역 형광에 의해 검출된다. (E) RT-PCR 분석을 야생형 UCS 및 iPSCs에 비해 이영 iPSCs에서 특정 디스트로핀 엑손 삭제를 확인하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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PRI의 표 1. 목록메르 시퀀스.
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Discussion
iPSCs를 사용하여 심혈관 질환을 모델링하는 것은 유전 적 기여 4-6를 이해하는 일반적인 방법이되고있다. 환자 세포로부터 샘플을 얻는 몇몇 예상치 못한 문제, 특히 어린 아이들, 이러한 소변 수집 같이 비 침습적 접근하는 옵션을 제공함으로써 회피 할 수있다. 이 젊은 환자 집단에서, 재 프로그래밍을위한 충분한 세포 소변을 수득하기에 충분한 양의 소변을 수집하는 것이 곤란하다. 유체에게 소변 수집하기 전에 30 분을 마시는 젊은 환자 코칭 소변 세포 분리의 성공을 향상시킨다. 그러나, 반복 소변 컬렉션이 인구에 필요할 수 있습니다. 우리는 합하고 근이영양증 환자에서 UCS의 분리 및 배양을 최적화하기 위해 두 개의 서로 다른 프로토콜을 3,7-을 적응.
유도 된 다 능성 줄기 세포는 근육 이영양증의 patien로부터 피부 섬유 아세포 또는 소변 중 세포에서 생성 된TS 1,2. 그러나 두 리 프로그래밍 프로토콜은 체세포로 리 프로그래밍 요소를 소개하는 렌티 바이러스에 의존. 트랜스 임의로 숙주 게놈에 통합 (평가 8) 또는 트랜스 활성화 돌연변이를 일으키는 경우 통합 바이러스 배송 방법은 문제가 될 수있다. 따라서 비 통합 방식 9 소변 세포로 OSKM 형질 전환 유전자를 형질 도입하는 센다이 바이러스를 사용하여 이러한 방법으로 향상.
UCS 재 프로그램 센다이 바이러스를 사용하는이 방법은 더 높은 전달 효율 9,10와 비 통합 방식의 장점을 제공한다. 근이영양증 환자에서 수집 한 소변 세포는 2-3주 후 전달 내에서 재 프로그래밍된다. 이러한 재 프로그래밍 반응 속도는 렌티 바이러스 전달 1을 사용 UC 재 프로그래밍에 필적한다. 이 프로토콜은 소변 세포 재 프로그래밍에 대한 공급이없는 방법을 설정하기 위해 확장 할 수 있지만, 수근이영양증 환자에서 분리 한 세포의 뇨 센다이 바이러스를 이용한 형질 도입 효율적인 방법을 보내고. 설명 된이 방법은 완전히 통로 (2)에 피더가없는 조건을 양도하기 전에 능성 MD 클론을 확립하기 위해 피더 층으로서 MEFs에 의존.
디스트로핀 단백질 Dp71 이성체의 분포는 핵의 맹아 긴 다른 셀 모델 (11, 12)에 설립되었다. 초기 전구 / 배아 단계의 세포의 핵 매트릭스 분율 Dp71이 유비쿼터스 표현은 핵 아키텍처와 세포주기 조절 (12)에서 자신의 역할을 제안합니다. 우리의 재 프로그래밍 야생형 iPSCs는 Dp71을 표현; 그러나, 이영 iPSCs의 부재는 곧 재 프로그래밍 또는 이영 세포의 만능 가능성을 억제하지 않습니다. 결론적으로, 이영 유전자 돌연변이 재 프로그램 iPSCs에 보존된다; 그것을 효율적인 도구를 만드는 것은 이영 심근 병증을 모델링합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
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- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
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- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
