Abstract
Dystrofe kardiomyopati er en dårlig forstått konsekvens av muskeldystrofi. Generere induserte Pluripotent stamceller (iPSCs) fra pasienter med muskeldystrofi er en uvurderlig mobilnettet kilde for in vitro sykdom modellsystemer og kan brukes for narkotika screening studier. Pasient-avledet urin celler er blitt anvendt i vellykket omprogrammering i induserte pluripotente stamceller for å modellere en dystrofiske kardiomyopati. Adressering sikkerhet bekymringer med å integrere vektorsystemer, presenterer vi en protokoll med et ikke-integrere Sendai virusvektor for transduksjon av Yamanaka faktorer inn i urin celler hentet fra pasienter med muskeldystrofi. Denne protokollen genererer fullt omprogrammeres kloner i løpet av 2-3 uker. De pluripotente celler er vektor-fri ved passasje-13. Disse dystrofiske iPSCs kan differensieres i kardiomyocytter og brukes enten for å studere sykdomsmekanismer eller for narkotika screening.
Introduction
Kardiomyopati er den nest største årsaken til dødsfall hos pasienter med Duchenne og Becker muskeldystrofi (MD). Selv om mutasjoner i X-linked dystrofingenet oppstå i en: 3500 mannlige fødsler, er svært lite kjent om de molekylære og cellulære hendelser som fører til progressiv hjertemuskelskader. Menneskeskapte pluripotente stamceller hentet fra muskeldystrofi pasienter har dukket opp som en roman verktøy for å studere de underliggende sykdomsmekanismer og å bruke for narkotika screening 1,2.
Den forventede ubehag av hud biopsier eller blodprøver kan fraråde unge pasienter og / eller deres foresatte til å gi samtykke til studiedeltakelse. Urinprøver er en ikke-invasiv kilde for somatiske celler, som er foranderlig i reprogrammerings-metoder. Vi har nylig vist at urin celler hentet fra muskeldystrofi pasienter kan være kultivert og effektivt omprogrammeres til iPSCs bruker retrovirale transduksjon med Yamanaka faktorer (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, og c-Myc; OSKM) 1. Ulempen med retrovirale genavlevering er tilfeldig integrering av reprogrammerings-gener inn i vertens kromosom. For å overvinne denne begrensningen, har vi brukt den ikke-integrere Sendai virus for urin celle omprogrammering.
Denne protokollen beskriver Sendai virus omprogrammering av isolerte urin celler fra muskeldystrofi pasienter som deretter kan differensieres i kardiomyocytter eller andre celletyper for videre studier. Denne protokollen kan også tilpasses for andre pasientspesifikke sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Pasienter og / eller deres foresatte bør gi informert samtykke til å delta i en Institutional Review Board godkjent studien.
1. Buffere og Media Forberedelser
- Vaskebuffer: For å fremstille 100 ml vaskebuffer, tilsett 1 ml 100x pen / strep-oppløsning (100 U / ml penicillin + 100 ug / ml streptomycin) i 99 ml fosfatbuffersaltløsning (PBS).
- Urin stamceller (UPC) Medium: For å forberede UPC medium, blande like volumer av keratinocyte Serum Free (KSF) Medium + stamcelle Medium.
- KSF Medium: For å fremstille keratinocytt-medium, tilsett 5 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 50 ng / ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), 30 ng / ml av koleratoksin, og pennen / strep-oppløsning (100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) i 500 ml KSF medium.
- Stamcelle Medium: Legg tre fjerdedeler av DMEM med en fjerdedel av Ham-F12 media og supplere med 10% FBS, 0,4 mikrogram / ml hydrokortison, 0.1nM koleratoksin, 5 ng / ml insulin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 -9 M trijod thyronine, 10 ng / ml EGF, og pennen / strep-løsning.
- Hes Medium: Legg 20% KO-serum erstatning (K-SR), 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mm L-glutamin, 100 mikrometer β-mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF og penn / strep til 400 ml DMEM / F12 medium.
2. Urin Prøvetaking
- Instruere pasienten til å drikke 30 min før urinoppsamling for å sikre at en tilstrekkelig mengde (~ 30-40 ml) av urin kan samles.
- Gi pasientene og / eller deres foresatte en urin kit som inneholder følgende elementer: (1) skriftlige instruksjoner om hvordan du kan få steril eller ren fangst urinprøve, (2) fuktig anti-bakterielle toaletter, og (3) en 100 ml steril prøvetaking cup. Instruere pasienter å samle prøven.
- Umiddelbart plassere urinprøver på is og overføre til laboraTory i en kjøligere. Behandle urin for celle isolasjon umiddelbart. Dersom forsinkelsen er uunngåelig, lagre prøven på is i opp til 4 timer med minimalt tap av celle-levedyktighet.
3. Isolering og Utvidelse av urin Cells
MERK: Utfør følgende trinn under sterile forhold i en BSL2 biologisk sikkerhetskabinett.
- Ved hjelp av sterile pipetter, å overføre urinprøver sterilt 50 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 400 x g i 10 minutter ved RT.
- Aspirere supernatanten forlater 1 ml i røret; være forsiktig for ikke å forstyrre cellen pellet.
- Resuspender og kombinere de pellets fra flere rør i 7 ml vaskebuffer, og gjenta sentrifugering ved 400 x g i 10 minutter ved RT.
- Aspirere nøye supernatanten, forlater cellepelleten og ~ 0,2 til 0,5 ml av supernatanten. Resuspender i 2-3 ml av urin stamceller (UPC) medium og overføre suspensjon inn 4-6 brønner av en unbelagte 24-brønners plate.
- Etter 72 timer, supplere kultur med 0,5 ml friskt medium UPC per brønn og endre medium hver 2-3 dager etter. Erytrocytter og plateepitel celler som ikke festes til platen vil bli fjernet med de mellom endringer.
- Overvåke kultur etter 4-6 dager.
MERK: Små 2-4 cellekolonier vil begynne å dukke opp. Celler vil bli avrundet eller avlange som representerer type I eller type II av renal epitel (RE) celler på henholdsvis tre. - Endre medium hver 2-3 dager siden en gang cellene vises, vil de gjennomgå en rask ekspansjonsfase.
- Når cellene når 80-90% samløpet, rundt 9-15 dager etter plating, distansere og passasje cellene (15.000-18.000 celler / cm 2) på 2-4 brønner av 24 brønners plate for videre ekspansjon. Markere dette som celle passasje 1 (P1).
- Karakterurin celler for avstamning spesifikasjoner gjennom flowcytometrisk analyse, immunohistochemical farging eller ved revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR).
- Omprogrammere isolerte urin celler (§ 4) eller fryse dem ned i Frysing Medium (DMEM supplert med 10% serum og 10% DMSO) for langsiktig cryostorage.
4. Urin Cell Omprogrammering Bruke Sendai Virus
MERK: Riktig håndtering og bruk av PVU (personlig verneutstyr) anbefales mens manipulere trans agenter. Utfør følgende trinn under sterile forhold i en BSL2 biologisk sikkerhetskabinett. Riktig disponering av transmiddel og / eller transfekterte celler anbefales å unngå risiko for miljø- og helsefare. For urin celle omprogrammering, bruk en Sendai Omprogrammering Kit med modifikasjoner til produsentens mater avhengig protokoll som beskrevet nedenfor.
- For å sikre høy effektivitet omprogrammering hjelp av Sendai virus, passasjer bruk 1-5 av urin celler som er raskly dele. Hvis cellene ikke replikere godt eller bli senescent, kast dem som de ikke vil omprogrammere effektivt.
- Seed 60.000 celler per brønn i to brønner i en 6 brønners plate. Merk dette som Dag -2. Justere celle seeding tetthet (5 x 4 til 9 oktober x 10 4 celler per brønn) som trengs for å nå 80-90% samløpet ved dag 0.
- På dag 0 (48 h etter plating av cellene), fremstille de Sendai reprogrammerings-vektorer (SEV) inneholdende hver av de fire OSKM faktorer. Legge til hver av vektorene til 1 ml forvarmet UPC medium. Bruke en MOI på 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), som er tilstrekkelig for omprogrammering urin celler. Aspirer medium og sakte legge til en ml UPC + SeV til ett godt av urin celler. Bruk det andre, i tillegg til transduksjon negativ kontroll.
- På dag 1, erstatte UPC + SeV medium med frisk UPC medium. Noen celledød ses etter 24 timer på grunn av virus-cytotoksisitet.
- Avhengig av effektiviteten av omprogrammeres Clone formasjoner og den kompakte morfologi, holde endre mediet daglig til dag 6 eller 7.
- En dag forut for dissosiasjon av transduserte celler (dag 5 eller 6), forberede MEF mater platene ved utsåing Mitomycin-C (10 ug / ml i 3 timer) ble behandlet-MEFs på tetthet på 5 x 10 4 celler / cm 2, på 0,1 % gelatin belagt 100 mm 2 kultur retter.
- Neste dag (dag 6 eller 7), dissosiere cellene med 0,25% trypsin, resuspender cellene i UPC medium og platen 5 x oktober 4-2 x 10 5 celler / 100 mm 2 MEF mateplaten.
- Dagen etter bytte til HMS medium og endre medium hver dag. Observere cellene under et mikroskop for å overvåke transformerte celler.
MERK: Cellene danner klonale aggregater med karakteristiske brostein morfologi og har høyere kjernen til cytoplasma ratio (12-18 dager etter transduksjon). - Innen to til tre uker etter transduksjon, plukke kolonier og overføre til nye plater for Clonal ekspansjon.
- Opptre live cellefarging for å velge IPSC kloner ved å inkubere cellene med TRA-1-81 antistoff i 1 time ved 37 ° C i CO2-inkubator, etterfulgt av telleren farging med spesifikke fluoriserende fargestoff konjugert sekundært antistoff i 1 time ved 37 ° C i CO2-inkubator.
- Bruk en 26 G 1½ tommers nål til kryss klekkes de større TRA-1-81 positive IPSC kloner i små like store biter (4-6 stk pr klone).
- Bruk av en steril pipette-spissen for å velge og overføre 10-20 kryss-skraverte stykker fra flere kloner inn i hver brønn av Matrigel (10 mikrogram / cm 2) belagte 24-brønners plate med HES medium.
MERK: Stykker fra en enkelt klone belagt individuelt i en enkelt brønn ikke utvide eller opprettholde pluripotency. - Endring fra hes til IPSC medium 24-48 timer etter at omprogrammeres kloner er festet til Matrigel overflate.
- Under vedlikehold på Matrigel-belagte plater, manuelt SCRApe-off eventuelle differensierte celler eller forurensende MEF mater celler ved hjelp av en pipette-tip til å berike for fullt omprogrammeres og pluripotente dystrofiske IPSC (MD-IPSC) kloner.
- Etter individuelle kloner har nådd ~ 100 mikrometer størrelse, utvide kloner ved dissociating med 0,48 mM EDTA (ethylendiamintetraeddiksyre) løsning for 3 min og plating små celle aggregater av MD-iPSCs suspendert i IPSC medium (supplert med fem mikrometer Y27632, Rho kinase inhibitor ) på fersk matrigel (10 mikrogram / cm 2) belagt 12-brønners plate. Endre IPSC medium daglig.
- Full omprogrammering av hver klon kan bestemmes ved både genekspresjon analyse av OSKM gener og immunhistokjemisk farging av pluripotency markører (Oct3 / 4 og TRA-1-81). En grundig evaluering av pluripotency potensialet bør benyttes for å bekrefte fullt omprogrammerte IPSC linjer kan skille i tre bakterie lag. Dette kan oppnås enten ved embryoid legeme (EB) dannelse og differensiering assay eller et terAtoma dannelse analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste stamceller isolert fra human urin er positive for uroepithelial progenitor og pericyte markører slik som CD44, CD73, CD146 og (97,37%, 97,09% og 97,3% henholdsvis, figur 1A og 1B). Disse cellene uttrykte også andre mesenchymale markører som alpha-glatt muskulatur aktin og vimentin (figur 1B). RT-PCR-analyse gir bevis for en blandet populasjon av celler i kulturer i at det er svak ekspresjon av Cytokeratin-7 (CK-7) og Uroplakin (UP) -ia & -IIIa, markører for uroepithelial avstamning (figur 1C).
Omprogrammering trinn er oppsummert av skjematisk i figur 2A. Representative bildene viser morfologien av cellene under forskjellige tidspunkter i løpet av protokollen (figur 2B). Urin celler forvandle fra langstrakt, type II celler (dag 0) i en brostein mønster (Dag 4) under omprogrammering. By Day 12, typiske pluripotente kloner (IPSC) blir sett og er i stand til å opprettholde sin pluripotent morfologi etter mater frie forhold (IPSC-P2). Levende celle farging for TRA-1-81 identifiserer omprogrammerte kloner (Figur 2C).
For å bekrefte dannelsen av vektor og transgene fri pluripotente kloner, RT-PCR utført ved å bruke primerne mot SEV virusgenomet, og hver av de eksogene OSKM faktorer. Oppreguleringen av endogene reprogrammerings faktorer kan også bli bekreftet ved dette trinnet. Den eksogene genekspresjon ikke lenger detekteres ved passasje-13, men opp-regulering av endogene faktorer er sett (figur 3A). Immunofluorescent farging bekrefter pluripotency markør uttrykk på iPSCs (Oct3 / 4 og TRA-1-81, figur 3B). Den endogene omprogrammering genekspresjon sett i urin celler kan føre disse cellene til å omprogrammere ved høyere virkningsgrader 1, sammenlignet med andre somatiske cellekilder. De expressjon av dystrofingenet og protein er verifisert av immunfluorescens farging, western blot (WB) og RT-PCR-analyser (figur 3C-E). Immunofluorescent farging av villtype UCS og iPSCs for dystrophin demonstrere tydelig kjernefysiske lokalisering 11 i iPSCs, men svært få UCS uttrykte positive (Figur 3C). Å verifisere dystrophin uttrykk i cellene, immunoblotanalyse for dystrophin avdekket at den allestedsnærværende dystrophin isoform (Dp71) er den dominerende isoform produsert i villtype iPSCs, mens dystrofiske iPSCs mangler dystrophin genuttrykk har undetectable Dp71 uttrykk (Figur 3D). De exon delesjonsmutasjoner dystrophin kan bekreftes i dystrofe iPSCs bruker spesifikke primere flankerer de slettede eksoner. Ingen PCR forsterkning er oppdaget i dystrofe iPSCs mens villtype iPSCs demonstrere dystrophin transkripsjon forsterkning (Figur 3E).
innen-side = "always"> 
Figur 1. Karakterisering av isolerte Urin Cells (UCS) viser uroepithelial stamfar, mesenchymale og glatte muskelceller linjene. (A) Flowcytometrisk analyse av UCS undersøkt med konjugerte antistoffer mot uroepithelial og pericyte markører CD44, CD73 og CD146. (B) Immunofluorescent farging av UCS med CD44, αSMA og vimentin. (C) Gene uttrykk profilen til UCS viser svak uttrykk for CK-7 og UP-Ia og UP-IIIa i forhold til positive kontrollprøver mens genuttrykk av alfa-glatt muskulatur aktin (αSMA) kan sammenlignes med positiv kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
laste opp / 52032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 2. programmering av UC å generere iPSCs. (A) Skjematisk oversikt over reprogrammerings-tidslinjen. (B) som representerer forskjellige morfologi av UCS under SeV transduksjon, på dag 0 (SeV transduksjon), Dag 4 (morfologisk overgang), Dag 12 (pluripotente kloner dukker opp på MEFs) og den karakteristiske IPSC klone etter mater frie forhold (IPSC P2 på Matrigel). (C) Live-cell imaging for TRA-1-81 å identifisere pluripotente kolonier på dag 17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. generasjon av Viral Genome og Transgene Free iPSCs. (A)Genekspresjon analysen viser tilstedeværelsen av SEV-genomet og OSKM transgener ved passasje 2 (IPSC-P2) og deres forsvinning av passasjen 13 (IPSC-P13) mens endogene genekspresjon vedvarer hele. (B) bilder Fase kontrast og immunfluorescens sammenligne Oct3 / 4 og TRA-1-81 flekker i UCS og resulterende iPSCs. (C) dystrofin detekteres av immunfluorescens i villtype iPSCs sammenlignet med villtype-UCS, og (D) den spesifikke dystrofin isoform (Dp71) kan bekreftes ved WB. (E) RT-PCR-analyse brukes til å bekrefte den spesifikke dystrophin ekson sletting i dystrofe iPSCs sammenlignet med villtype UCS og iPSCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn av Reagens / materiell / utstyr | Selskap | Catalog Number | Kommentarer |
| GAPDH-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gIven i kommentarer | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (eksogene) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (eksogene) -Motsatt Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (eksogene) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (eksogene) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (eksogene) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (eksogene) -Motsatt Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (eksogene) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (eksogene) -Motsatt Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (eksogene) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (eksogene) -Motsatt Primer * | IDT Inc. | * Livet Tech-Cytotune kit | ACCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (Endogen) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (Endogen) -Motsatt Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (Endogen) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (Endogen) -Motsatt Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Dystrophin-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Dystrophin-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq gitt i kommentarer | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabell 1. Liste over PriMer sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellering kardiovaskulære sykdommer ved hjelp iPSCs blir en felles tilnærming for å forstå den genetiske bidraget 4-6. Noen uventede vanskeligheter med å skaffe celleprøver fra pasienter, særlig små barn, kan unngås ved å tilby muligheten av en ikke-invasiv metode for eksempel en urinoppsamling. I denne unge pasientpopulasjon, er det ofte vanskelig å samle et volum av urin som er tilstrekkelig til å gi nok urin celler for omprogrammering. Coaching de unge pasientene å drikke 30 min før urinen samling forbedrer suksessen av urin celle isolasjon. Imidlertid kan gjenta urin samlinger være nødvendig i denne populasjonen. Vi har kombinert og tilpasset to ulike protokoller 3,7 for å optimalisere isolering og kultur av UCS fra pasienter med muskulær dystrofi.
Induserte pluripotente stamceller har blitt generert fra enten hudfibroblaster eller urin celler fra muskeldystrofi patients 1,2. Men begge omprogrammering protokoller stolt på lentiviruses å innføre omprogrammering faktorer i de somatiske celler. Denne integrering av virusleveringsmetode kan være problematisk dersom transgenet integreres tilfeldig inn i vertsgenomet og forårsaker enten transgen reaktivering eller mutagenese (oversikt i 8). Derfor forbedres vi over disse teknikker ved hjelp av Sendai-virus til å omsette de OSKM transgener i urinen cellene i en ikke-integrert måte ni.
Denne metode under anvendelse av Sendai-virus til å omprogrammere UCS gir fordelen av en ikke-integrert tilnærming med en høyere virkningsgrad transduksjon 9,10. Urin celler hentet fra muskeldystrofi pasienter blir reprogrammert innen 2-3 uker etter transduksjon. Disse omprogrammering kinetikk er sammenlignbare med UC omprogrammering hjelp lentiviral transduksjon en. Selv om denne protokollen kan skaleres til å etablere mater-fri metode for urin celle omprogrammering, væreing en effektiv metode å bruke Sendai-virus transduksjon av urin celler isolert fra muskeldystrofi pasienter. Denne metoden er beskrevet er avhengig av MEFs som en mater-lag for å fullt etablere pluripotent MD klone før overføring til mater-frie forholdene på passasje to.
Atom fordeling av Dp71 isoformen av dystrophin protein har lenge vært etablert i forskjellige fosterstadiet cellemodeller 11,12. Denne allestedsnærværende uttrykk for Dp71 i atom matrise brøkdel av tidlige progenitor / fosterstadiet celler antyder sin rolle i atom arkitektur og cellesyklusregulering 12. Våre omprogrammeres villtype iPSCs uttrykke Dp71; imidlertid ikke sitt fravær i dystrofe iPSCs ikke hemme omprogrammering eller pluripotent potensialet i dystrofe celler. I konklusjonen, er dystrofe genmutasjoner konservert i omprogrammerte iPSCs; noe som gjør det til et effektivt verktøy for å modellere dystrofe kardiomyopati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
