Abstract
Cardiomiopatía distrófica es una consecuencia mal entendido de la distrofia muscular. Generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con distrofia muscular es una fuente inestimable para celular in vitro sistemas modelo de la enfermedad y puede ser utilizado para los estudios de detección de drogas. Células de orina derivados de los pacientes se han utilizado con éxito en la reprogramación de las células madre pluripotentes inducidas con el fin de modelar la miocardiopatía distrófica 1. Abordar los problemas de seguridad de la integración de sistemas de vectores, se presenta un protocolo utilizando un vector de virus Sendai no integrador para la transducción de Yamanaka factores en las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular. Este protocolo genera clones reprogramado completamente dentro de 2-3 semanas. Las células pluripotentes son libre de vectores mediante el paso-13. Estos iPSCs distróficos pueden diferenciarse en cardiomiocitos y se utilizan ya sea para estudiar mecanismos de la enfermedad o para la detección de drogas.
Introduction
La cardiomiopatía es la segunda causa principal de muerte en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y de Becker (MD). Aunque las mutaciones en el gen de la distrofina ligada al cromosoma X se producen en 1: 3.500 nacimientos de varones, se sabe muy poco acerca de los eventos moleculares y celulares que conducen al daño del músculo cardíaco progresivo. Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de pacientes con distrofia muscular se han convertido en una nueva herramienta para estudiar los mecanismos subyacentes de la enfermedad y que se utilizará para la detección de drogas 1,2.
La incomodidad anticipada de biopsias de piel o muestras de sangre puede disuadir a los pacientes jóvenes y / o sus tutores para dar su consentimiento para participar en el estudio. Las muestras de orina son una fuente no invasiva de células somáticas que son modificables a los métodos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular pueden ser cultivadas y eficiente reprogramado en iPSCs utilizando la transducción retroviral con los factores de Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc; OSKM) 1. La desventaja del suministro de genes retrovirales es la integración aleatoria de los genes de reprogramación en los cromosomas del huésped. Para superar esta limitación, hemos utilizado el virus Sendai no integrante de la reprogramación celular orina.
Este protocolo detalla la reprogramación de virus Sendai de células aisladas de orina de pacientes con distrofia muscular que a su vez pueden diferenciarse en cardiomiocitos u otros tipos de células para su posterior estudio. Este protocolo también se puede adaptar para otras enfermedades específicas del paciente.
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Protocol
NOTA: Los pacientes y / o sus tutores deben dar su consentimiento informado para participar en una Junta de Revisión Institucional aprobado estudio.
1. Los tampones y Preparaciones Medios
- Tampón de lavado: Para preparar 100 ml de tampón de lavado, añadir 1 ml de la pluma de 100x / Solución estreptocócica (100 U / ml de penicilina + 100 g / ml de estreptomicina) a 99 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Urinario Progenitor Cell (UPC) Medio: Para preparar medio UPC, mezclar volúmenes iguales de queratinocitos sin suero (FCE) Medio + Progenitor medio celular.
- KSF Medio: Para preparar el medio de queratinocitos, añadir 5 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), 30 ng / ml de toxina del cólera, y solución de penicilina / estreptomicina (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) a 500 ml de medio KSF.
- Medio Progenitor Cell: Añadir tres cuartas partes de DMEM con un cuarto de los medios de Ham-F12 y complementar con 10% de FBS, 0,4 mg / ml de hidrocortisona, 0,1nM toxina del cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 g / ml de transferrina, 2 x 10 -9 M tironina triyodo, 10 ng / ml de EGF, y pen / strep solución.
- hES Medio: Añadir 20% de reemplazo KO-suero (K-SR), 1x MEM aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, 100 mM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF y penicilina / estreptomicina a 400 ml de DMEM / medio F12.
2. Muestra de orina Colección
- Instruir a los pacientes a beber líquidos 30 minutos antes de la recolección de orina para asegurarse de que una cantidad adecuada (~ 30 a 40 ml) de orina se pueden recoger.
- Dar a los pacientes y / o sus tutores un kit de recogida de orina que contiene los siguientes elementos: (1) las instrucciones escritas sobre cómo obtener la muestra de orina estéril o limpia, (2) toilettes antibacterianas húmedas, y (3) a 100 ml estéril taza de la recogida de muestras. Indique a los pacientes a tomar la muestra.
- Coloque inmediatamente las muestras de orina en el hielo y la transferencia a la laboratoria en un refrigerador. Procesar la orina para el aislamiento de células inmediatamente. Si un retardo es inevitable, almacenar la muestra en hielo durante hasta 4 horas con una mínima pérdida de la viabilidad celular.
3. El aislamiento y la expansión de las células de orina
NOTA: Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2.
- El uso de pipetas estériles, las muestras de orina para la transferencia estéril tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo; tener cuidado de no perturbar el sedimento celular.
- Resuspender y combinar los gránulos de múltiples tubos en 7 ml de tampón de lavado y repetir la centrifugación a 400 xg durante 10 min a TA.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando el sedimento celular y ~ 0,2-0,5 ml de sobrenadante. Volver a suspender en 2-3 ml de orina de células progenitoras (UPC) a medio y transferir la suspensión en 4-6 pocillos de una ONUplaca de 24 pocillos recubierta.
- Después de 72 horas, suplementar el cultivo con 0,5 ml de medio fresco UPC por pozo y cambiar de medio cada 2-3 días después. Los eritrocitos y células escamosas que no se adhieren a la placa se eliminarán con los cambios de medio.
- Supervisar la cultura después de 4-6 días.
NOTA: Las pequeñas colonias de células 2-4 comenzarán a aparecer. Las células serán redondeadas o alargadas que representan tipo I o II del epitelio renal (RE) células respectivamente 3. - Cambie el medio cada 2-3 días desde que una vez que aparecen las células, se someterá a una fase de rápida expansión.
- Una vez que las células alcanzan 80-90% de confluencia, alrededor de 9-15 días después de placas, disociar y el paso de las células (15,000-18,000 células / cm 2) en 2-4 pocillos de placa de pocillos 24 para una mayor expansión. Marque esto como paso célula 1 (P1).
- Caracterizar las células de orina para las especificaciones de linaje a través del análisis de citometría de flujo, immunohistochemtinción iCal o mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
- Reprogramar células aisladas de orina (sección 4) o congelarlos en el medio de congelación (DMEM suplementado con 10% de suero y 10% DMSO) para almacenamiento criogénico a largo plazo.
4. La orina Reprogramación Celular Usando Sendai Virus
NOTA: El manejo adecuado y el uso de los EPI (equipos de protección individual) se recomienda durante la manipulación de los agentes de transfección. Realice los pasos siguientes en condiciones estériles en una cabina de seguridad biológica BSL2. Se recomienda la eliminación adecuada de la transfección de células de agentes y / o transfectadas para evitar el riesgo de peligros ambientales y de salud. Para la reprogramación celular orina, use un Reprogramación Kit Sendai con modificaciones al protocolo de alimentación dependiente del fabricante como se detalla a continuación.
- Para garantizar una alta eficiencia de reprogramación con el virus Sendai, uso pasajes 1-5 de células de orina que son rápidasly dividiendo. Si las células no se replican bien o se vuelven senescentes, descartarlos ya que no se vuelva a programar de manera eficiente.
- Seed 60.000 células por pocillo en dos pocillos de una placa de 6 pocillos. Marcar este como el Día de -2. Ajuste la densidad de siembra de células (5 x 04 al 09 10 x 10 4 células por pocillo) según sea necesario para llegar a un 80-90% de confluencia en el día 0.
- En el Día 0 (48 h después de la siembra de las células), preparar los vectores de reprogramación Sendai (SeV) que contienen cada uno de los cuatro factores OSKM. Añadir cada uno de los vectores a 1 ml de medio UPC pre-calentado. Utilice una MOI de 1 a 1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), que es suficiente para que las células de orina reprogramación. Aspirar el medio y agregue lentamente el 1 ml UPC + VSe a un pocillo de las células de orina. Utilice el segundo así como el control negativo de transducción.
- En el Día 1, sustituir el medio UPC + VSe con medio UPC fresco. Algunos muerte celular es visto después de 24 h debido a la citotoxicidad vírica.
- En función de la eficiencia de clon reprogramadae formaciones y la morfología compacta, siguen cambiando el medio diariamente hasta el día 6 o 7.
- Un día antes de la disociación de las células transducidas (día 5 o 6), preparar placas de alimentación MEF en placas Mitomicina-C (10 mg / ml durante 3 horas) tratados con MEFs a una densidad de 5 x 10 4 células / cm 2, en 0,1 % de gelatina recubierta platos 100 mm 2 de cultivo.
- Al día siguiente (día 6 o 7), disociar las células con 0,25% de tripsina, resuspender las células en medio UPC y la placa 5 x 10 4 - placa de alimentador de 2 x 10 5 células / 100 mm 2 MEF.
- Al día siguiente, cambiar a medio hES y cambiar el medio todos los días. Observar las células bajo un microscopio para controlar las células transformadas.
NOTA: Las células forman agregados clonales con morfología característica de adoquines y tener mayor núcleo al citoplasma (12-18 días después de transducción). - Dentro de dos o tres semanas después de la transducción, recoger colonias y traslado a las nuevas placas de clonexpansión al.
- Realizar tinción de células vivas para la selección de clones IPSC mediante la incubación de las células con TRA-1-81 anticuerpo durante 1 hora a 37 ° C en incubadora de CO 2 seguido por tinción con colorante fluorescente contador específico conjugado anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C en el incubador de CO2.
- Use un G 1½ pulgada aguja 26 a interrogar a eclosionar los grandes TRA-1-81 clones positivos IPSC en pequeños trozos de igual tamaño (4-6 piezas por clon).
- Utilice una pipeta de punta estéril para recoger y transferencia 10-20 piezas rayadas de varios clones en cada pozo de Matrigel (10 g / cm2) presenta el revestimiento de placa de 24 pocillos con medio hES.
NOTA: Las piezas de un solo clon chapado en forma individual en un solo pozo no se expanden o mantener la pluripotencia. - Cambie de hES a medio IPSC 24-48 horas después de que los clones reprogramadas están unidos a la superficie de Matrigel.
- Durante el mantenimiento en placas recubiertas con Matrigel, SCRA manualmentePE-off ningún células diferenciadas o contaminantes células alimentadoras MEF utilizando una punta de pipeta para enriquecer IPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas y pluripotentes.
- Después de clones individuales han alcanzado ~ 100 micras de tamaño, ampliar los clones disociando con EDTA 0,48 mM (ácido etilendiaminotetraacético) solución durante 3 minutos y enchapado pequeños agregados celulares de MD-iPSCs suspendidas en medio de IPSC (suplementado con 5 mM Y27632, Rho-cinasa inhibidor ) en matrigel fresco (10 g / cm 2) recubierto placa de 12 pocillos. Cambie medio IPSC diaria.
- Reprogramación completa de cada clon se puede determinar por tanto el análisis de expresión génica de genes OSKM y tinción inmunohistoquímica de los marcadores de pluripotencia (Oct3 / 4 y TRA-1-81). Una evaluación rigurosa del potencial pluripotencia debe ser empleado para confirmar totalmente reprogramadas líneas IPSC pueden diferenciarse en tres capas germinales. Esto se puede lograr ya sea por el cuerpo embrioide (EB) formación y diferenciación de ensayo o un terensayo de formación atoma.
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Representative Results
La mayoría de las células progenitoras aisladas de orina humana son positivos para los marcadores progenitoras y de pericitos uroepithelial tales como CD44, CD73, y CD146 (97,37%, 97,09% y 97,3%, respectivamente; Figura 1A y 1B). Estas células también expresan otros marcadores mesenquimales tales como la actina alfa del músculo liso y vimentina (Figura 1B). Análisis de RT-PCR da evidencia de una población mixta de células en los cultivos en que hay una expresión débil de citoqueratina-7 (CK-7) y uroplakin (UP) -Ia y -IIIa, los marcadores de linaje uroepiteliales (Figura 1C).
Los pasos de reprogramación se resumen por esquemática en la Figura 2A. Imágenes representativas demuestran la morfología de las células durante diferentes puntos de tiempo en todo el protocolo (Figura 2B). Las células se transforman de orina alargado, las células de tipo II (día 0) en un patrón de adoquines (día 4) durante la reprogramación. By el día 12, clones pluripotentes típicos (IPSC) se ven y son capaces de mantener su morfología pluripotente bajo condiciones de alimentación libres (IPSC-P2). Tinción de células vivas para TRA-1-81 identifica clones reprogramadas (Figura 2C).
Para confirmar la generación de vector y libre de transgenes clones pluripotentes, RT-PCR se realiza usando cebadores contra el genoma viral de VSe y cada uno de los factores exógenos OSKM. La regulación de los factores de reprogramación endógenos también se puede confirmar en este paso. La expresión del gen exógeno ya no se detecta por el paso-13, pero la regulación de factores endógenos se observa (Figura 3A). La tinción de inmunofluorescencia confirma la expresión de marcadores de pluripotencia en células iPS (Oct3 / 4 y TRA-1-81; Figura 3B). La expresión del gen endógeno reprogramación visto en células de orina puede conducir estas células para reprogramar a mayores eficiencias 1, en comparación con otras fuentes de células somáticas. Los expressión del gen y la proteína distrofina es verificada por la tinción de inmunofluorescencia, transferencia de western (WB) y los análisis de RT-PCR (Figura 3C-E). Tinción de inmunofluorescencia de UC de tipo salvaje y iPSCs para distrofina demostrar localización nuclear evidente 11 en iPS, pero muy pocos UC expresó positivo (Figura 3C). Para verificar la expresión de distrofina en las células, análisis de inmunotransferencia de la distrofina reveló que la isoforma de la distrofina ubicua (DP71) es la isoforma predominante producida en iPSCs de tipo salvaje, mientras que iPSCs distróficos que carecen de la expresión del gen de la distrofina ha DP71 expresión indetectable (Figura 3D). Las mutaciones de deleción de exón distrofina se pueden confirmar en las iPSCs distróficos utilizando primers específicos que flanquean los exones eliminados. No se detecta la amplificación por PCR en las células iPS distróficos mientras iPSCs tipo salvaje demuestran amplificación transcripción distrofina (Figura 3E).
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Figura 1. Caracterización de células de orina aisladas (UCS) muestra progenitor uroepiteliales, mesenquimal y linajes musculares lisas. (A) Análisis citométrico de flujo UCs sondeó con anticuerpos conjugados contra marcadores de pericitos uroepiteliales y CD44, CD73 y CD146. (B) tinción de inmunofluorescencia de UC con CD44, αSMA y vimentina. (C) Perfil de expresión génica de UCs muestran expresión débil de CK-7 y UP-Ia y UP-IIIa en comparación con muestras de control positivas, mientras que la expresión del gen de la alfa-actina de músculo liso (αSMA) es comparable con el control positivo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. La reprogramación de la UC para generar células iPS. (A) Esquema general de la línea de tiempo de reprogramación. (B) Las imágenes que representan diferentes morfologías de UC durante la transducción VSe, en el día 0 (transducción SEV), Día 4 (transición morfológica), el día 12 (clones pluripotentes emergente sobre MEF) y la característica IPSC clon en condiciones libres de alimentador (IPSC -P2 en Matrigel). (C) de imágenes de células vivas para TRA-1-81 para identificar colonias pluripotentes en el día 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Generación del genoma viral y Transgén gratuito iPSCs. (A)Análisis de expresión génica muestra la presencia del genoma de SeV y transgenes OSKM en el paso 2 (IPSC-P2) y su desaparición mediante el paso 13 (IPSC-P13), mientras que la expresión del gen endógeno persiste a lo largo. (B) imágenes de contraste de fase y de inmunofluorescencia que comparan Oct3 / 4 y TRA-1-81 tinción en UC y iPS resultantes. (C) La distrofina es detectado por inmunofluorescencia en células iPS de tipo salvaje en comparación con los de tipo salvaje UC, y (D) la isoforma específica de la distrofina (DP71) puede ser confirmado por el Banco Mundial. Análisis (E) RT-PCR se utiliza para confirmar la eliminación específica distrofina exón en las iPSCs distróficos en comparación con los de tipo salvaje UC y iPSCs. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del reactivo / materiales / Equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| GAPDH-Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-Cebador | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-Forward Primer | IDT Inc. | Sec gada en los comentarios | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (exógena) Primer Les gusto * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (exógena) -ReversPrimer E * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (exógena) Les gusto Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (exógena) Les gusto Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| VSe (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| VSe (exógena) Les gusto Primer * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | LaCCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (endógena) -Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (endógena) Les gusto Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (endógena) -Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (endógena) Les gusto Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| La distrofina-Forward Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| La distrofina-Reverse Primer | IDT Inc. | Sec da en los comentarios | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabla 1. Lista de PriSecuencias mer.
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Discussion
Modelado de las enfermedades cardiovasculares mediante iPSCs se está convirtiendo en un enfoque común de entender la contribución genética 4-6. Algunas dificultades no previstas de la obtención de muestras de células de los pacientes, especialmente los niños pequeños, se pueden evitar al ofrecer la opción de un método no invasivo, como una muestra de orina. En esta población joven paciente, a menudo es difícil recoger un volumen de orina suficiente para producir suficientes células de orina para la reprogramación. Entrenando los pacientes jóvenes a beber líquidos 30 minutos antes de la recolección de orina mejora el éxito de aislamiento de células de la orina. Sin embargo, muestras de orina de repetición pueden ser necesarios en esta población. Hemos combinado y adaptado dos protocolos diferentes 3,7 con el fin de optimizar el aislamiento y cultivo de UCs de pacientes con distrofia muscular.
Las células madre pluripotentes inducidas se han generado a partir de cualquiera de los fibroblastos de la piel o las células de orina de patien distrofia muscularts 1,2. Sin embargo, ambos protocolos de reprogramación se basaron en los lentivirus para introducir los factores de reprogramación en las células somáticas. Este método de entrega virus integración puede ser problemático si el transgén se integra aleatoriamente en el genoma del huésped y causa sea la reactivación del transgén o mutagénesis (revisado en 8). Por lo tanto, hemos mejorado en estas técnicas utilizando el virus Sendai para transducir los transgenes OSKM en las células de orina de una manera no-integración 9.
Este método que utiliza el virus Sendai para reprogramar UC ofrece la ventaja de un enfoque no-integración con una eficiencia de transducción mayor 9,10. Células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular se reprograman dentro de 2-3 semanas después de la transducción. Estos cinética reprogramación son comparables a la UC reprogramación utilizando transducción lentiviral 1. Aunque este protocolo se puede escalar a establecer método de alimentación libre para la reprogramación celular orina, debeing un método eficiente mediante transducción Sendai-virus de las células de orina aisladas de pacientes con distrofia muscular. Este método descrito se basa en MEFs como un alimentador de capa a fin de establecer plenamente la pluripotentes MD clon antes de la transferencia al alimentador condiciones libres en el paso 2.
La distribución nuclear de la isoforma DP71 de la proteína distrofina tiempo se ha establecido en diferentes modelos celulares etapa embrionarias 11,12. Esta expresión ubicua de DP71 en la fracción de la matriz nuclear de células progenitoras de la etapa / embrionaria temprana sugiere su papel en la arquitectura nuclear y la regulación del ciclo celular 12. Nuestros iPS reprogramadas expresan tipo salvaje DP71; Sin embargo, su ausencia en iPSCs distróficos no inhibe la reprogramación o potencial de las células pluripotentes distróficos. En conclusión, las mutaciones genéticas distrófica se conservan en iPS reprogramadas; por lo que es una herramienta eficaz para modelar cardiomiopatía distrófica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
