Abstract
اعتلال عضلة القلب التصنع هو نتيجة غير مفهومة من الضمور العضلي. توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات هو مصدر الخلوي لا يقدر بثمن لفي المختبر أنظمة نموذج المرض، ويمكن استخدامها للدراسات فحص المخدرات. وقد استخدمت خلايا البول المستمدة من المريض في إعادة برمجة ناجحة في الخلايا الجذعية المحفزة من أجل نموذج اعتلال عضلة القلب حثلي 1. معالجة مخاوف تتعلق بالسلامة دمج أنظمة النواقل، نقدم بروتوكول باستخدام غير دمج-سينداي ناقلات الفيروس لتنبيغ ياماناكا العوامل في خلايا البول التي جمعت من المرضى الذين يعانون من الضمور العضلي. هذا البروتوكول يولد برمجتها بالكامل الحيوانات المستنسخة في غضون 2-3 أسابيع. الخلايا المحفزة هي خالية من متجه من قبل مرور 13. يمكن التفريق بين هذه iPSCs التصنع في العضلية وتستخدم إما لدراسة آليات المرض أو لفحص المخدرات.
Introduction
اعتلال عضلة القلب هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في المرضى الذين يعانون من دوشين وبيكر ضمور العضلات (MD). على الرغم من أن الطفرات في العاشر مرتبطة الدستروفين الجينات تحدث في 1: 3،500 المواليد الذكور، والقليل جدا هو المعروف عن الأحداث الجزيئية والخلوية مما يؤدي إلى تلف العضلات التدريجي القلب. وظهرت الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان المستمدة من مرضى ضمور العضلات كأداة جديدة لدراسة آليات المرض الكامنة واستخدامها لفحص المخدرات 1،2.
عدم الراحة المتوقعة من خزعات الجلد أو عينات الدم قد يثني المرضى الصغار و / أو أولياء أمورهم لإعطاء الموافقة للمشاركة الدراسة. عينات البول هي مصدر غير الغازية من الخلايا الجسدية التي هي قابلة للتعديل لأساليب إعادة برمجة. لقد أظهرنا مؤخرا أن الخلايا البول التي جمعت من مرضى ضمور العضلات قد يكون مثقف وكفاءة برمجتها في iPSCs باستخدام تنبيغ فيروسات مع العوامل ياماناكا (Oct3 / 4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. OSKM) 1. وعيب توصيل الجينات فيروسات هو دمج عشوائي من الجينات إعادة برمجة في الكروموسومات المضيف. للتغلب على هذا القيد، وقد استخدمنا غير دمج الفيروسات سينداي لإعادة برمجة خلايا البول.
هذا البروتوكول تفاصيل إعادة برمجة فيروس سينداي الخلايا البول معزولة من مرضى ضمور العضلات ومن ثم يمكن متباينة في العضلية أو أنواع الخلايا الأخرى لمزيد من الدراسة. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأمراض محددة المريض الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب على المرضى و / أو أولياء أمورهم إعطاء الموافقة المسبقة للمشاركة في مجلس المراجعة المؤسسية وافق الدراسة.
1. المخازن والاستعدادات وسائل الإعلام
- غسل العازلة: لتحضير 100 مل من غسل العازلة، إضافة 1 مل من القلم 100X / بكتيريا الحل (100 U / البنسلين مل + 100 ميكروغرام / مل من الستربتوميسين) إلى 99 مل من المياه المالحة عازلة الفوسفات (PBS).
- البولية السلف خلية (UPC) المتوسطة: لإعداد UPC المتوسطة، مزيج أحجام متساوية من الكيراتينية المصل الحرة (KSF) متوسطة + السلف خلية متوسطة.
- KSF المتوسطة: لتحضير القرنية المتوسطة، إضافة 5 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)، 50 نانوغرام / مل من مستخلص الغدة النخامية البقري (BPE)، 30 نانوغرام / مل من السم الكوليرا، والحل القلم / بكتيريا (100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) إلى 500 مل المتوسطة قوة أمن كوسوفو.
- متوسط السلف الخلية: إضافة ثلاثة أرباع DMEM مع ربع من وسائل الاعلام هام-F12 وتكملة مع 10٪ FBS، 0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 0.1نانومتر السم الكوليرا، 5 نانوغرام / مل الأنسولين، 1.8 × 10 -4 M الأدينين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 2 × 10 -9 M triiodo ثيرونين، 10 نانوغرام / مل EGF، والقلم / بكتيريا الحل.
- [هس المتوسطة: إضافة 20٪ استبدال KO المصل (K-SR)، 1X MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 ملي لتر-الجلوتامين، و 100 ميكرومتر β المركابتويثانول، 20 نانوغرام / مل bFGF والقلم / بكتيريا إلى 400 مل DMEM / F12 المتوسطة.
2. البول جمع العينات
- إرشاد المرضى على شرب السوائل 30 دقيقة قبل جمع البول للتأكد من أن كمية كافية (~ 30-40 مل) من البول يمكن جمعها.
- إعطاء المرضى و / أو أولياء أمورهم مجموعة جمع البول تحتوي على العناصر التالية: (1) تعليمات مكتوبة حول كيفية الحصول على معقمة أو نظيفة عينة البول الصيد، (2) المراحيض مضادة للبكتيريا رطبة، و (3) 100 مل العقيمة عينة كوب المجموعة. إرشاد المرضى لجمع العينة.
- وضع على الفور عينات البول على الجليد ونقل إلى لابوراحزب المحافظين في برودة. معالجة البول لعزل الخلايا الفور. إذا كان تأخير أمر لا مفر منه، وتخزين العينة على الجليد لمدة تصل إلى 4 ساعات مع فقدان الحد الادنى من بقاء الخلية.
3. عزل وتوسيع الخلايا البول
ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية.
- استخدام ماصات معقمة، وعينات البول لنقل العقيمة أنابيب الطرد المركزي 50 مل. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
- نضح طاف وترك 1 مل في أنبوب؛ يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
- في resuspend والجمع بين الكريات من أنابيب متعددة في 7 مل من غسل العازلة وتكرار الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
- نضح بعناية طاف، وترك بيليه الخلية و~ 0.2-0.5 مل من طاف. resuspend في 2-3 مل من البول السلف خلية (UPC) متوسطة ونقل إلى تعليق 4-6 الآبار من الامم المتحدةالمغلفة لوحة 24-جيدا.
- بعد 72 ساعة، تكملة الثقافة مع 0.5 مل من المتوسط UPC جديدة لكل بئر وتغيير المتوسطة بعد كل 2-3 أيام. سيتم إزالة كريات الدم الحمراء والخلايا الحرشفية التي لا نعلق على لوحة مع التغييرات المتوسطة.
- مراقبة الثقافة بعد 4-6 أيام.
ملاحظة: سوف تبدأ صغيرة 2-4 مستعمرات الخلايا على ما يبدو. سيتم تقريب الخلايا أو ممدود التي تمثل النوع الأول أو النوع الثاني من الظهارية الكلوي (RE) الخلايا على التوالي 3. - تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام مرة واحدة منذ ظهور الخلايا، فإنها تخضع لمرحلة التوسع السريع.
- وبمجرد أن تصل إلى خلايا 80-90٪ التقاء، حوالي 9-15 أيام بعد الطلاء، فصل ومرور الخلايا (15،000-18،000 خلية / سم 2) على 2-4 الآبار من 24 لوحة جيدا لمزيد من التوسع. بمناسبة هذا الأمر خلية مرور 1 (P1).
- تميز خلايا البول للمواصفات النسب من خلال تحليل تدفق cytometric، immunohistochemتلطيخ كال أو من خلال العكسي الناسخ، البلمرة سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR).
- إعادة برمجة خلايا البول معزولة (القسم 4) أو تجميد عليهم في تجميد المتوسطة (DMEM تستكمل مع 10٪ مصل و 10٪ DMSO) لcryostorage على المدى الطويل.
4. البول إعادة برمجة الخلية باستخدام سينداي الفيروسات
ينصح التعامل السليم واستخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، في حين التلاعب وكلاء transfecting: ملاحظة. نفذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية. ويوصى التخلص السليم من بنقل العدوى إلى خلايا وكيل و / أو transfected لتجنب خطر حدوث الأخطار البيئية والصحية. لالبول خلية إعادة برمجة، استخدم إعادة برمجة كيت سينداي مع تعديلات على البروتوكول التي تعتمد على التغذية الشركة المصنعة كما هو مفصل أدناه.
- لضمان إعادة برمجة عالية الكفاءة باستخدام فيروس سينداي، واستخدام الممرات 1-5 من الخلايا البول التي هي سريعةلاي الانقسام. إذا كانت الخلايا لا تتكاثر بشكل جيد أو تهرم، التخلص منها لأنها لن إعادة برمجة بكفاءة.
- البذور 60،000 الخلايا لكل بئر في بئرين لوحة 6 جيدا. اجعل هذا يوما -2. ضبط كثافة البذر الخلية (5 × 04-09 أكتوبر × 10 4 خلايا لكل بئر) حسب الحاجة للوصول إلى 80-90٪ التقاء قبل يوم 0.
- في يوم 0 (48 ساعة بعد طلاء الخلايا)، وإعداد موجهات إعادة برمجة سينداي (SEV) التي تحتوي على كل من العوامل OSKM الأربعة. إضافة كل من ناقلات إلى 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة UPC. استخدام وزارة الداخلية من 1-1.5 (5-7،5 × 10 5 CIU)، وهو ما يكفي لإعادة برمجة خلايا البول. نضح المتوسطة وببطء إضافة 1 مل UPC + SEV إلى بئر واحدة من الخلايا البول. استخدام البئر الثانية كما سيطرة سلبية التنبيغ.
- في يوم 1، استبدل المتوسطة UPC + SEV مع الطازجة المتوسطة UPC. وينظر بعض موت الخلايا بعد 24 ساعة نظرا لسمية الخلايا الفيروسية.
- اعتمادا على كفاءة نسيلة برمجتهاتشكيلات الإلكترونية والتشكل المدمجة، والحفاظ على تغيير المتوسطة يوميا حتى يوم 6 أو 7.
- يوم واحد قبل تفكك خلايا transduced (يوم 5 أو 6)، وإعداد لوحات المغذية MEF بواسطة الطلاء ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعة) معاملة MEFS في كثافة 5 × 10 4 خلية / سم 2، على 0.1 ٪ الجيلاتين المغلفة 100 مم 2 أطباق الثقافة.
- اليوم التالي (يوم 6 أو 7)، فصل الخلايا مع 0.25٪ التربسين، resuspend الخلايا في UPC المتوسطة وصفيحة 5 × 04-02 أكتوبر × 10 5 خلية / 100 مم 2 MEF لوحة المغذية.
- في اليوم التالي، والتحول إلى حس المتوسط وتغيير المتوسطة كل يوم. مراقبة الخلايا تحت المجهر لمراقبة الخلايا تحولت.
ملاحظة: الخلايا تشكل مجاميع نسيلي مع خاصية التشكل المرصوفة بالحصى وجود نواة لأعلى نسبة حشوية (12-18 أيام آخر التنبيغ). - في غضون شهرين إلى ثلاثة أسابيع بعد التنبيغ، واختيار المستعمرات ونقل إلى لوحات جديدة للنسيلةالتوسع آل.
- أداء تلطيخ الخلايا الحية لاختيار الحيوانات المستنسخة التوجيهية التي تفرخ الخلايا مع TRA-1-81 الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة على 37 ° C في CO 2 حاضنة تليها مكافحة تلطيخ مع صبغة الفلورسنت محدد الضد الثانوية مترافق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
- استخدام 26 G 1½ بوصة الإبرة إلى عبر يفقس أكبر TRA-1-81 استنساخ IPSC إيجابية إلى قطع متساوية الحجم صغيرة (4-6 قطعة في استنساخ).
- استخدام معقم ماصة معلومات سرية لالتقاط ونقل 10-20 القطع عبر الفقس من الحيوانات المستنسخة متعددة في كل بئر من Matrigel (10 ميكروغرام / سم 2) -coated 24 لوحة جيدا مع حس المتوسطة.
ملاحظة: قطعة من استنساخ واحد مطلي بشكل فردي في بئر واحد لا توسيع أو الحفاظ على تعدد القدرات. - تغيير من حس لIPSC المتوسطة 24-48 ساعة بعد أن يتم إرفاق استنساخ برمجتها إلى السطح Matrigel.
- أثناء الصيانة على لوحات Matrigel المغلفة، يدويا SCRAPE-إيقاف أي خلايا متباينة أو تلويث الخلايا المغذية MEF باستخدام ماصة طرف لإثراء لالتصنع IPSC (MD-IPSC) استنساخ برمجتها بالكامل والمحفزة.
- بعد استنساخ الفردية وصلت ~ 100 حجم ميكرون، وتوسيع الحيوانات المستنسخة التي كتبها النأي مع 0.48 ملي EDTA (حمض ethylenediaminetetraacetic) حل لمدة 3 دقائق وطلي المجاميع خلية صغيرة من MD-iPSCs معلقة في IPSC المتوسطة (تستكمل مع 5 ميكرومتر Y27632، رو كيناز المانع ) على matrigel الطازجة (10 ميكروغرام / سم 2) المغلفة 12 لوحة جيدا. تغيير IPSC المتوسط يوميا.
- إعادة برمجة الكاملة لكل استنساخ يمكن تحديد كل من تحليل التعبير الجيني الجينات OSKM وتلطيخ المناعى من علامات تعدد القدرات (Oct3 / 4 و TRA-1-81). وينبغي استخدام تقييم دقيق لإمكانية تعدد القدرات للتأكيد أن الخطوط التوجيهية إعادة برمجة بالكامل تفرق في ثلاث طبقات جرثومية. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق هيئة مضغي الشكل (EB) تشكيل والتمايز فحص أو ثالثاatoma تشكيل الفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معظم الخلايا الاصلية المعزولة من البول البشري إيجابية للسلف وخلية حوطية علامات uroepithelial مثل CD44، CD73، وCD146 (97.37٪، 97.09٪، و97.3٪ على التوالي؛ الشكل 1A و 1B). أعرب هذه الخلايا أيضا علامات الوسيطة الأخرى مثل الأكتين ألفا السلس العضلات وفيمنتين (الشكل 1B). تحليل RT-PCR يعطي دليلا على وجود يقطنها خليط سكاني من الخلايا في الثقافات في أنه لا يوجد تعبير ضعف Cytokeratin-7 (CK-7) وUroplakin (UP) -Ia و-IIIa، علامات النسب uroepithelial (الشكل 1C).
وتتولى التخطيطي تلخيص الخطوات إعادة برمجة في الشكل 2A. صور الممثل تثبت مورفولوجيا الخلايا خلال نقاط زمنية مختلفة في جميع أنحاء بروتوكول (الشكل 2B). الخلايا البول تحويل من ممدود، نوع II الخلايا (يوم 0) في نمط الحصوه (يوم 4) خلال إعادة برمجة. Bوينظر ذ يوم 12، استنساخ المحفزة نموذجية (IPSC)، وتمكن من الحفاظ على التشكل المحفزة في ظل ظروف خالية المغذية (IPSC-P2). تلطيخ الخلايا الحية لTRA-1-81 يحدد استنساخ إعادة برمجة (الشكل 2C).
لتأكيد جيل من النواقل والتحوير مجانا استنساخ المحفزة، يتم تنفيذ RT-PCR باستخدام بادئات ضد الجينوم الفيروسي SEV وكل من العوامل OSKM الخارجية. ويمكن أيضا وأكد أن التنظيم يتكون من عوامل إعادة برمجة الذاتية في هذه الخطوة. لم يعد الكشف عن التعبير الجيني خارجي من قبل مرور 13، ولكن ينظر إلى تنظيم ما يصل من العوامل الداخلية (الشكل 3A). تلطيخ مناعي يؤكد تعدد القدرات علامة التعبير على iPSCs (Oct3 / 4 و TRA-1-81؛ الشكل 3B). والذاتية التعبير إعادة برمجة الجينات في خلايا البول قد تؤدي هذه الخلايا لإعادة برمجة في أعلى الكفاءات 1، بالمقارنة مع غيرها من مصادر خلية جسدية. ومورينداتاهيتيانوني يتم التحقق منها سيون من الجينات الدستروفين والبروتين المناعي تلطيخ، وصمة عار الغربية (WB) وRT-PCR تحليل (الشكل 3C-E). تلوين مناعي من UCS نوع البرية وiPSCs لالدستروفين تثبت توطين النووية واضح 11 في iPSCs، ولكنها أعربت عن عدد قليل جدا من UCS الإيجابي (الشكل 3C). للتحقق من التعبير الدستروفين في الخلايا، وكشف تحليل لطخة مناعية الدستروفين أن شكل الإسوي الدستروفين في كل مكان (Dp71) هو شكل الإسوي الغالبة التي تنتج في iPSCs نوع البرية، في حين iPSCs التصنع تفتقر إلى التعبير الدستروفين الجين قد لا يمكن الكشف عنها Dp71 التعبير (الشكل 3D). ويمكن التأكد من الطفرات اكسون حذف الدستروفين في iPSCs التصنع باستخدام بادئات محددة المرافقة إلى exons المحذوفة. لم يتم الكشف عن التضخيم PCR في iPSCs التصنع في حين iPSCs نوع البرية تظهر التضخيم الدستروفين نسخة (الشكل 3E).
في صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. توصيف خلايا البول معزولة (UCS) يبين السلف uroepithelial، الوسيطة والأنساب العضلات الملساء. (A) تحليل تدفق cytometric من UCS بحث مع الأجسام المضادة مترافق ضد علامات uroepithelial وخلية حوطية CD44، CD73 وCD146. (B) مناعي تلطيخ UCS مع CD44، αSMA وفيمنتين. (C) لمحة التعبير الجيني من UCS تظهر التعبير ضعف CK-7 وUP-IA وUP-الثالث ألف بالمقارنة مع عينات مراقبة إيجابية بينما التعبير الجيني من الأكتين العضلات ألفا السلس (αSMA) هو مشابه لمراقبة إيجابية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 52032 / 52032fig2highres.jpg "العرض =" 700px "/>
الشكل 2. إعادة برمجة UC لتوليد iPSCs. (A) نظرة عامة تخطيطي لجدول زمني إعادة برمجة. (B) الصور التي تمثل الأشكال التضاريسية مختلفة من UCS خلال تنبيغ SEV، في يوم 0 (SEV التنبيغ)، يوم 4 (الانتقال الصرفي)، يوم 12 (استنساخ المحفزة الناشئة على MEFS) واستنساخ IPSC مميزة في ظل ظروف خالية من وحدة التغذية (IPSC -P2 على Matrigel). (C) تصوير الخلايا الحية لTRA-1-81 لتحديد المستعمرات المحفزة في يوم 17. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الجيل الفيروسية الجينوم والتحوير الحرة iPSCs. (A)ويظهر تحليل الجينات التعبير وجود الجينوم SEV والجينات المحورة OSKM في مرور 2 (IPSC-P2) واختفائها من قبل مرور 13 (IPSC-P13)، في حين استمر الذاتية التعبير الجيني في جميع أنحاء. (B) صور المرحلة التباين والمناعي مقارنة Oct3 / 4 و TRA-1-81 تلطيخ في UCS وiPSCs الناتجة. تم الكشف عن (C) الدستروفين التي كتبها المناعي في البرية من نوع iPSCs مقارنة البرية من نوع UCS، و (D) والدستروفين شكل الإسوي محددة (Dp71) يمكن التأكد من WB. يستخدم التحليل (E) RT-PCR لتأكيد الحذف الدستروفين اكسون محدد في iPSCs التصنع مقارنة البرية من نوع UCS وiPSCs. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الكاشف / المواد / المعدات | شركة | عدد كتالوج | تعليقات |
| GAPDH-الأمام التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-الأمام التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| يصل IA-الأمام التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| يصل IA-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| يصل الثالث ألف-الأمام التمهيدي | IDT شركة | يليها زاللاعب Iven في تعليقات | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| يصل الثالث ألف-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-الأمام التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (مصادر خارجية) -Forward التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (مصادر خارجية) التمهيدي -Reverse * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (مصادر خارجية) -Forward التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (مصادر خارجية) -Reversالبريد التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (مصادر خارجية) -Forward التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (مصادر خارجية) -Reverse التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (مصادر خارجية) -Forward التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (مصادر خارجية) -Reverse التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SEV (مصادر خارجية) -Forward التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SEV (مصادر خارجية) -Reverse التمهيدي * | IDT شركة | * الحياة تك-Cytotune عدة | ACCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (الذاتية) -Forward التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (الذاتية) -Reverse التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (الذاتية) -Forward التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (الذاتية) -Reverse التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| الدستروفين-الأمام التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| الدستروفين-عكس التمهيدي | IDT شركة | بعدها تعطى في تعليقات | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
الجدول 1. قائمة الحزب الثوري المؤسسيمير متواليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نمذجة أمراض القلب والشرايين باستخدام iPSCs أصبحت نهج مشترك لفهم مساهمة الوراثية 4-6. بعض الصعوبات غير المتوقعة من الحصول على عينات من خلايا المرضى، خاصة الأطفال الصغار، ويمكن تجنبها من خلال تقديم خيار نهج غير الغازية مثل جمع البول. في هذه الفئة من السكان الشباب المريض، وغالبا ما يكون من الصعب جمع كمية من البول كافية لانتاج خلايا البول ما يكفي لإعادة البرمجة. يدرب المرضى الصغار على شرب السوائل 30 دقيقة قبل جمع البول يحسن نجاح العزلة خلية البول. ومع ذلك، قد يكون مجموعات البول تكرار الضروري في هذه الفئة من السكان. لقد مجتمعة وتكييفها اثنين من بروتوكولات مختلفة 3،7 من أجل تحسين العزلة وثقافة UCS من المرضى الذين يعانون من الضمور العضلي.
تم إنشاء الخلايا الجذعية المحفزة إما من الخلايا الليفية الجلد أو خلايا البول من الضمور العضلي patienنهاية الخبر 1،2. ومع ذلك، اعتمدت كلا البروتوكولين إعادة برمجة على lentiviruses لإدخال عوامل إعادة برمجة إلى خلايا جسدية. هذا إدماج فيروس طريقة التسليم يمكن أن يكون مشكلة إذا كان التحوير يدمج بشكل عشوائي في الجينوم المضيف ويسبب إما إعادة تنشيط التحوير أو الطفرات (استعراضها في 8). ولذلك، فإننا تحسينها هذه التقنيات باستخدام فيروس سينداي الى تنبيغ الجينات المحورة OSKM إلى خلايا البول بطريقة غير دمج-9.
هذه الطريقة باستخدام فيروس سينداي لإعادة برمجة UCS يقدم ميزة نهج غير دمج-مع كفاءة أعلى التنبيغ 9،10. وبرمجة خلايا البول التي جمعت من مرضى ضمور العضلات في غضون 2-3 أسابيع بعد التنبيغ. هذه حركية إعادة برمجة قابلة للمقارنة مع UC إعادة برمجة باستخدام تنبيغ lentiviral 1. على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن زيادتها لإنشاء طريقة خالية من تغذية للبول خلية برمجة، يكونجي وسيلة فعالة باستخدام التنبيغ سينداي الفيروسات الخلايا البول معزولة من مرضى ضمور العضلات. هذا الأسلوب هو موضح يعتمد على MEFS باعتبارها طبقة المغذية من أجل إقامة تماما المحفزة MD استنساخ مسبق لنقل ظروف خالية المغذية لفي مرور 2.
منذ فترة طويلة أنشئت توزيع النووي للشكل الإسوي Dp71 من البروتين الدستروفين في مختلف النماذج خلية المرحلة الجنينية 11،12. هذا التعبير في كل مكان من Dp71 في جزء مصفوفة النووي من السلف / الجنينية خلايا مرحلة مبكرة تشير دورها في الهندسة المعمارية النووية وخلية تنظيم دورة 12. لدينا برمجتها iPSCs نوع البرية تعبر عن Dp71. ومع ذلك، عدم وجوده في iPSCs التصنع لا تمنع إعادة برمجة أو إمكانية المحفزة للخلايا مصابة بالتشوهات. في الختام، والحفاظ على طفرات الجينات التصنع في iPSCs إعادة برمجة. مما يجعلها أداة فعالة لنموذج اعتلال عضلة القلب حثلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
