Abstract
Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.
Introduction
Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2.
Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani e / oi loro tutori a dare il consenso per la partecipazione allo studio. I campioni di urina sono una fonte non invasiva di cellule somatiche che sono modificabili a metodi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule di urina raccolti da pazienti distrofia muscolare possono essere colta ed efficiente riprogrammati in iPSCs utilizzando trasduzione retrovirale con i fattori di Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc; OSKM) 1. Lo svantaggio di consegna del gene retrovirale è l'integrazione casuale dei geni riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite. Per superare questo limite, abbiamo usato il Sendai non-integrazione per la riprogrammazione delle cellule urine.
Dettagli Questo protocollo virus riprogrammazione Sendai di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare, che possono poi essere differenziati in cardiomiociti o altri tipi di cellule per ulteriori studi. Questo protocollo può anche essere adattato per altre malattie specifiche del paziente.
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Protocol
NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio.
1. Tamponi e preparati media
- Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS).
- Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium.
- KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti, aggiungere 5 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 50 ng / ml di estratto pituitario bovino (BPE), 30 ng / ml di tossina del colera, e la soluzione penna / strep (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina) a 500 ml medie KSF.
- Progenitor cellulare Medium: Aggiungere tre quarti di DMEM con un quarto dei mezzi Ham-F12 e integrare con il 10% FBS, 0,4 mg / ml idrocortisone, 0,1nM tossina del colera, 5 ng / ml di insulina, 1,8 x 10 -4 M adenina, 5 mg / ml di transferrina, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml EGF, e la penna / strep soluzione.
- hES Media: Aggiungi il 20% di sostituzione KO siero (K-SR), aminoacidi non essenziali 1x MEM, 2 mm L-glutammina, 100 micron β-mercaptoetanolo, 20 ng / ml bFGF e penna / strep a 400 ml DMEM / F12.
2. Campione di urine Collection
- Istruire i pazienti di bere liquidi 30 min prima della raccolta delle urine per garantire che una quantità adeguata (~ 30-40 ml) di urina possono essere raccolti.
- Dare i pazienti e / o dei loro tutori un kit di raccolta delle urine, contenente i seguenti elementi: (1) istruzioni scritte su come ottenere campione di urina cattura sterile o pulite, (2) toilettes antibatteriche umide, e (3) un 100 ml sterile bicchiere di raccolta dei campioni. Informare i pazienti di raccogliere campioni.
- Porre immediatamente i campioni di urina sul ghiaccio e trasferimento laboraTory in un dispositivo di raffreddamento. Processo immediatamente l'urina per l'isolamento delle cellule. Se il ritardo è inevitabile, conservare i campioni in ghiaccio per un massimo di 4 ore con una minima perdita di vitalità cellulare.
3. Isolamento ed espansione di cellule urina
NOTA: eseguire le seguenti operazioni in condizioni di sterilità in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica.
- Usando pipette sterili, i campioni di urina trasferimento sterilizzato provette da 50 ml. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT.
- Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nel tubo; fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Risospendere e combinare i pellets da più tubi in 7 ml di tampone di lavaggio e ripetere centrifugazione a 400 xg per 10 min a RT.
- Con attenzione aspirare il surnatante, lasciando il pellet e ~ 0,2-0,5 ml di surnatante. Risospendere in 2-3 ml di urinario Progenitor cellulare (UPC) di medie e trasferire la sospensione in 4-6 pozzetti di una nonrivestito 24-pozzetti.
- Dopo 72 ore, integrare la cultura con 0,5 ml di fresco UPC medie per bene e cambiare media ogni 2-3 giorni dopo. Gli eritrociti e cellule squamose che non si attaccano alla piastra saranno rimossi con il mezzo modifiche.
- Monitorare cultura dopo 4-6 giorni.
NOTA: Piccole 2-4 colonie di cellule inizieranno ad apparire. Le cellule saranno arrotondati o allungata, che rappresentano di tipo I o di tipo II di epiteliale renale (RE) le cellule rispettivamente 3. - Cambiare la media ogni 2-3 giorni dal momento che, una volta compaiono le cellule, che sarà oggetto di una fase di rapida espansione.
- Una volta che le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, circa 9-15 giorni dopo la placcatura, dissociare e il passaggio delle cellule (15,000-18,000 cellule / cm 2) sul 2-4 pozzetti di 24 pozzetti per un'ulteriore espansione. Segna questo come cellulare di passaggio 1 (P1).
- Caratterizzare cellule di urina per le specifiche lignaggio attraverso l'analisi di citometria di flusso, immunohistochemcolorazione ical o tramite reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR).
- Riprogrammare cellule urina isolate (sezione 4) o congelare giù a congelamento (DMEM integrato con il 10% di siero e il 10% DMSO) per crioconservazione a lungo termine.
4. Urine Riprogrammazione cellulare Utilizzando Sendai Virus
NOTA: La corretta gestione e l'uso di DPI (dispositivi di protezione individuale) è raccomandato durante la manipolazione degli agenti trasfettando. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni sterili in un BSL2 Biological Safety Cabinet. Il corretto smaltimento dei trasfezione cellule agente e / o transfettate si consiglia di evitare il rischio di pericoli per l'ambiente e per la salute. Per urine riprogrammazione cellulare, utilizzare un Sendai Riprogrammazione Kit con modifiche al protocollo alimentatore-dipendente dal produttore, come descritto di seguito.
- Per garantire un'elevata efficienza riprogrammazione utilizzando il Sendai, uso passaggi 1-5 di cellule di urina che sono rapidily dividendo. Se le cellule non replicano bene o diventano senescenti, disfarsene in quanto non riprogrammare in modo efficiente.
- Seed 60.000 cellule per pozzetto in due pozzetti di una piastra 6 bene. Segna questo come giorno -2. Regolare la densità di semina delle cellule (5 x 4-9 OTTOBRE x 10 4 cellule per pozzetto) come necessario per raggiungere 80-90% di confluenza di giorno 0.
- Il giorno 0 (48 ore dopo la placcatura le cellule), preparare i vettori di riprogrammazione Sendai (SEV) contenenti ciascuno dei quattro fattori OSKM. Aggiungere ognuno dei vettori a 1 ml di pre-riscaldato a medio UPC. Utilizzare un MOI di 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), che è sufficiente per cellule urina riprogrammazione. Aspirare il medio e aggiungere lentamente il 1 ml UPC + SeV ad un pozzetto delle celle di urina. Utilizzare il secondo e il controllo negativo trasduzione.
- Il giorno 1, sostituire il mezzo di UPC + SeV fresca media UPC. Alcuni morte cellulare è visto dopo 24 ore a causa di citotossicità virale.
- A seconda dell'efficienza di clon riprogrammatoe formazioni e la morfologia compatta, continuano a cambiare il mezzo di tutti i giorni fino al giorno 6 o 7.
- Un giorno prima della dissociazione di cellule trasdotte (giorno 5 o 6), preparare piastre alimentatore MEF placcando mitomicina-C (10 ug / ml per 3 ore) trattati-MEF a densità di 5 x 10 4 cellule / cm 2, su 0.1 % di gelatina rivestito 100 mm 2 piatti di coltura.
- Il giorno successivo (giorno 6 o 7), dissociare le cellule con 0,25% tripsina, risospendere le cellule in UPC medio e piastra 5 x 10 4 - Piastra alimentatore 2 x 10 5 cellule / 100 mm 2 MEF.
- Il giorno seguente, passare hES medie e cambiare il mezzo ogni giorno. Osservare le cellule al microscopio per monitorare le cellule trasformate.
NOTA: Le cellule formano aggregati clonali con morfologia caratteristica ciottoli e avere maggiore nucleo rapporto citoplasmatica (12-18 giorni dopo trasduzione). - Entro due o tre settimane dopo la trasduzione, raccogliere le colonie e il trasferimento di nuove piastre per clonespansione al.
- Eseguire colorazione delle cellule in tempo reale per la selezione dei cloni IPSC incubando le cellule con TRA-1-81 anticorpi per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2 seguita dal contatore colorazione con colorante fluorescente specifico anticorpo secondario coniugato per 1 ora a 37 ° C in incubatore CO 2.
- Utilizzare un pollice G 1½ ago 26 a tratteggio incrociato più grandi TRA-1-81 positivi cloni IPSC in piccoli pezzi uguali dimensioni (4-6 pezzi per clone).
- Utilizzare una pipetta punta sterile per raccogliere e trasferire 10-20 pezzi cross-nati da più cloni in tutti i pozzetti di Matrigel (10 mg / cm 2) Rivestiti 24 pozzetti con HES media.
NOTA: Pezzi di un singolo clone placcato singolarmente in un unico pozzo non si espandono o mantenere pluripotenza. - Cambiare dal hES all'IPSC medio 24-48 ore dopo i cloni riprogrammati sono attaccati alla superficie Matrigel.
- Durante la manutenzione su piastre Matrigel rivestite, SCRA manualmentepe-off tutte le cellule differenziate o contaminanti cellule di alimentazione MEF con una pipetta punta ad arricchire per distrofici iPSC (MD-IPSC) cloni pienamente riprogrammate e pluripotenti.
- Dopo i singoli cloni hanno raggiunto ~ 100 micron dimensioni, espandere i cloni dissociandosi con EDTA 0,48 mm (etilendiamminotetraacetico) soluzione per 3 min e placcatura piccoli aggregati di cellule di MD-iPSCs sospese in iPSC medio (integrato con 5 micron Y27632, Rho Kinase inibitore ) su Matrigel freschi (10 mg / cm 2) rivestito 12 pozzetti. Cambiare iPSC media giornaliera.
- Riprogrammazione completa di ogni clone può essere determinata sia da analisi di espressione genica di geni OSKM e colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (Oct3 / 4 e TRA-1-81). Una valutazione rigorosa del potenziale pluripotenza dovrebbe essere impiegato per confermare le linee IPSC completamente riprogrammati in grado di differenziare in tre foglietti embrionali. Ciò può essere eseguito mediante corpo embrioide (EB) formazione e differenziazione dosaggio o terAtoma test formazione.
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Representative Results
La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP) -Ia & -IIIa, marcatori di stirpe uroepithelial (Figura 1C).
Le fasi di riprogrammazione sono riassunti dalla schematica nella Figura 2A. Immagini rappresentative dimostrano la morfologia delle cellule durante tempi diversi durante il protocollo (Figura 2B). Le cellule di urina trasformano da allungata, le cellule di tipo II (giorno 0) in un modello di ciottoli (Giorno 4) durante la riprogrammazione. By Giorno 12, cloni pluripotenti tipici (IPSC) sono visti e sono in grado di mantenere la loro morfologia pluripotenti in condizioni di libero alimentazione (IPSC-P2). Colorazione diretta cella per TRA-1-81 identifica cloni riprogrammati (Figura 2C).
Per confermare la generazione di vettori e transgene gratuito cloni pluripotenti, RT-PCR viene eseguita utilizzando primer contro il genoma virale SeV e ciascuno dei fattori esogeni OSKM. L'up-regolazione di fattori di riprogrammazione endogeni può essere confermata in questa fase. L'espressione del gene esogeno non viene più rilevato per passaggio-13, ma l'up-regolazione di fattori endogeni è visto (Figura 3A). Colorazione immunofluorescente conferma espressione marcatore pluripotenza su iPSCs (Oct3 / 4 e TRA-1-81; Figura 3B). L'espressione genica riprogrammazione endogena visto in cellule urina può portare queste cellule riprogrammare a maggiori efficienze 1, rispetto ad altre fonti di cellule somatiche. I expressione di gene della distrofina e delle proteine è verificato da immunofluorescenza, Western Blot (WB) e RT-PCR analisi (Figura 3C-E). Immunofluorescenza di UC wild type e iPSCs per distrofina dimostrare evidente localizzazione nucleare 11 in iPSCs, ma molto pochi UC espresso positivi (Figura 3C). Per verificare distrofina espressione nelle cellule, analisi immunoblot per distrofina rivelato che l'isoforma distrofina ubiquitario (DP71) è l'isoforma predominante prodotta in iPSCs tipo selvaggio, mentre iPSCs distrofici senza espressione genica distrofina è espressione DP71 rilevabile (Figura 3D). Le mutazioni di delezione dell'esone di distrofina possono essere confermati nelle iPSCs distrofici con primer specifici fiancheggianti gli esoni eliminati. No amplificazione PCR viene rilevato nelle iPSCs distrofici mentre Tipo iPSCs selvatici dimostrano distrofina trascrizione di amplificazione (Figura 3E).
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Figura 1. caratterizzazione di cellule isolate urina (UCS) dimostra progenitore uroepithelial, mesenchimali e lignaggi muscolari lisce. (A) analisi citofluorimetrica di UC sondato con anticorpi coniugati contro marcatori uroepithelial e periciti CD44, CD73 e CD146. (B) immunofluorescenza di UC con CD44, αSMA e Vimentin. (C) il profilo di espressione genica di UC mostrano deboli espressione di CK-7 e UP-Ia e UP-IIIa, rispetto ai campioni di controllo positivi, mentre l'espressione del gene dell'alfa-actina del muscolo liscio (αSMA) è paragonabile a controllo positivo. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Riprogrammazione di UC per generare iPSCs. (A) Schema della timeline riprogrammazione. (B) che rappresentano diverse morfologie del UC durante la trasduzione SEV, al giorno 0 (SeV trasduzione), 4 ° giorno (transizione morfologica), 12 ° giorno (cloni pluripotenti emergenti MEF) e il caratteristico clone IPSC in condizioni di assenza di alimentazione (IPSC -P2 su Matrigel). (C) l'imaging cellulare dal vivo di TRA-1-81 per identificare colonie pluripotenti al giorno 17. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Generazione di Viral Genome e Transgene libero iPSCs. (A)Analisi di espressione genica mostra la presenza del genoma SeV e transgeni OSKM al passaggio 2 (COPSI-P2) e la loro scomparsa mediante passaggio 13 (COPSI-P13) mentre l'espressione del gene endogeno persiste per tutta. (B) immagini a contrasto di fase ed immunofluorescenza confronto Oct3 / 4 e TRA-1-81 colorazione in UCS e iPSCs risultanti. (C) Distrofina viene rilevato mediante immunofluorescenza in wild-type iPSCs rispetto al wild-type UC, e (D) la distrofina isoforma specifico (DP71) può essere confermata dalla WB. Analisi (E) RT-PCR viene utilizzata per confermare la specifica delezione dell'esone distrofina nei iPSCs distrofici rispetto al wild-type UCS e iPSCs. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Nome del reagente / materiale / attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| GAPDH-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-Forward Primer | IDT Inc. | Seq given nei commenti | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (esogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (esogena) Primer -Inversa * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (esogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (esogena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (esogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (esogena) -Inversa Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (esogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (esogena) -Inversa Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (esogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (esogena) -Inversa Primer * | IDT Inc. | * Kit Vita Tech-Cytotune | LaCCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (endogena) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (endogena) -Inversa Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (endogena) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (endogena) -Inversa Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Distrofina-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Distrofina-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dato nei commenti | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabella 1. Elenco dei Primer sequenze.
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Discussion
Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i piccoli pazienti di bere liquidi 30 minuti prima della raccolta delle urine migliora il successo di isolamento delle cellule urine. Tuttavia, la raccolta delle urine può essere necessario ripetere in questa popolazione. Abbiamo combinato e adattato due diversi protocolli 3,7 al fine di ottimizzare l'isolamento e la coltura di UC da pazienti affetti da distrofia muscolare.
Le cellule staminali pluripotenti indotte sono stati generati sia da fibroblasti cutanei o cellule di urina da distrofia muscolare patients 1,2. Tuttavia, entrambi i protocolli di riprogrammazione invocato lentivirus di introdurre i fattori di riprogrammazione nelle cellule somatiche. Questa integrazione di metodo di consegna virus può essere problematico se il transgene si integra in modo casuale nel genoma dell'ospite e provoca sia riattivazione transgene o mutagenesi (rivisto in 8). Pertanto, abbiamo migliorato su queste tecniche utilizzando Sendai per trasdurre i transgeni OSKM nelle cellule di urina in modo non integrando 9.
Questo metodo utilizza Sendai riprogrammare UC offre il vantaggio di un approccio non integrazione con una maggiore efficienza di trasduzione 9,10. Cellule di urina raccolti da distrofia muscolare pazienti vengono riprogrammati entro 2-3 settimane post-trasduzione. Questi cinetica riprogrammazione sono paragonabili a UC riprogrammazione utilizzando trasduzione lentivirale 1. Anche se questo protocollo può essere scalata a stabilire il metodo senza alimentatore per l'urina riprogrammazione cellulare, essereing un metodo efficiente utilizzando trasduzione Sendai-virus di cellule di urina isolate da pazienti distrofia muscolare. Questo metodo descritto si basa su un alimentatore MEF come strato per stabilire pienamente il pluripotenti MD clone prima del trasferimento condizioni alimentatore-Free al passaggio 2.
La distribuzione nucleare della isoforma DP71 della proteina distrofina è da tempo stabilito in diversi modelli cellulari fase embrionale 11,12. Questa espressione ubiquitaria di DP71 in frazione matrice nucleare di cellule progenitrici stadio / embrionale precoce suggerisce il loro ruolo in architettura nucleare e regolazione del ciclo cellulare 12. Il nostro tipo iPSCs selvatici riprogrammate esprimono DP71; tuttavia, la sua assenza in iPSCs distrofici non inibisce la riprogrammazione o potenziale delle cellule pluripotenti distrofici. In conclusione, le mutazioni del gene distrofico sono conservati in iPSCs riprogrammati; che lo rende uno strumento efficace per modellare cardiomiopatia distrofici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
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- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
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