Abstract
Dystrofisk kardiomyopati är en dåligt känd konsekvens av muskeldystrofi. Generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från patienter med muskeldystrofi är en ovärderlig cellulär källa för in vitro sjukdomsmodellsystem och kan användas för drogscreeningstudier. Patienthärledda urin celler har använts i framgångsrika omprogrammering i inducerade pluripotenta stamceller i syfte att modellera dystrofisk kardiomyopati 1. Att ta itu med säkerhetsfrågor för att integrera vektorsystem, presenterar vi ett protokoll med ett icke-integrerande Sendai-virusvektor för transduktion av Yamanaka faktorer urinceller som samlats in från patienter med muskeldystrofi. Detta protokoll genererar helt omprogrammeras kloner inom 2-3 veckor. De pluripotenta celler är vektorfria genom passage-13. Dessa dystrofa iPSCs kan differentieras till hjärtmuskelceller och användas antingen för att studera sjukdomsmekanismer eller för drogscreening.
Introduction
Kardiomyopati är den näst vanligaste dödsorsaken hos patienter med Duchennes och Beckers muskeldystrofi (MD). Även mutationer i X-länkade dystrofingenen uppstå i en: 3.500 födda pojkar, är mycket lite känt om de molekylära och cellulära händelser som leder till progressiv hjärtmuskelskada. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller från muskeldystrofi patienter har dykt upp som ett nytt verktyg för att studera de underliggande sjukdomsmekanismer och att använda för läkemedels screening 1,2.
Den förväntade obehag av hud biopsier eller blodprov kan avskräcka unga patienter och / eller deras vårdnadshavare att ge samtycke till deltagande i studien. Urinprover är en icke-invasiv källa till somatiska celler som är möjliga att ändra till omprogrammering metoder. Vi har nyligen visat att urinceller som samlats in från muskeldystrofi patienter kan odlas och effektivt omprogrammeras till iPSCs använder retroviral transduktion med Yamanaka faktorer (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, och c-Myc; OSKM) 1. Nackdelen med retroviral genavgivning är slumpmässig integration av omprogrammeringen gener i värdkromosomer. För att övervinna denna begränsning, har vi använt icke-integrerande Sendai-virus för urin cell omprogrammering.
Detta protokoll detaljer i Sendaivirus omprogrammering av isolerade urinceller från muskeldystrofi patienter som sedan kan differentieras till hjärtmuskelceller eller andra celltyper för vidare studier. Detta protokoll kan också anpassas för andra patientspecifika sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Patienter och / eller deras vårdnadshavare bör ge sitt informerade samtycke till att delta i en Institutional Review Board godkänt studien.
1. Buffertar och Media Förberedelser
- Tvättbuffert: För att bereda 100 ml tvättbuffert, tillsätt 1 ml 100x pen / strep Solution (100 U / ml penicillin + 100 | ig / ml streptomycin) till 99 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Urin progenitorcell (UPC) Medium: För att förbereda UPC medium, blanda lika volymer av Keratinocyte Serum Free (KSF) Medium + stamcellstransplantation Medium.
- KSF Medium: För att förbereda keratinocyt-medium, tillsätt 5 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 50 ng / ml av bovint hypofysextrakt (BPE), 30 ng / ml koleratoxin, och pen / strep-lösning (100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin) till 500 ml KSF-medel.
- Stamcellstransplantation Medium: Lägg tre fjärdedelar av DMEM med en fjärdedel av Ham-F12 media och komplettera med 10% FBS, 0,4 mikrogram / ml hydrokortison, 0,1nM koleratoxin, 5 ng / ml insulin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 | ig / ml transferrin, 2 x 10 -9 M trijod tyronin, 10 ng / ml EGF, och pen / strep-lösning.
- hES Medium: Lägg 20% KO-serumersättning (K-SR), 1x MEM icke-essentiella aminosyror, 2 mM L-glutamin, 100 ^ iM β-merkaptoetanol, 20 ng / ml bFGF och pen / strep till 400 ml DMEM / F12-medium.
2. Urin Provtagning
- Instruera patienterna att dricka vätska 30 min före urinsamling för att säkerställa att en tillräcklig mängd (~ 30-40 ml) av urin kan samlas.
- Ge patienterna och / eller deras vårdnadshavare en urinuppsamlings kit som innehåller följande poster: (1) skriftliga instruktioner om hur du erhåller sterila eller ren provfångst urin, (2) fuktiga antibakteriella toaletter, och (3) en 100 ml steril provtagningskopp. Instruera patienten att samla prov.
- Omedelbart placera urinprov på is och överföra till laborarium i en kylare. Process urinen för cellisolering omedelbart. Om ett dröjsmål inte kan undvikas, lagra provet på is i upp till 4 h med minimal förlust av cellviabilitet.
3. Isolering och utbyggnad av urin Cells
OBS: Utför följande steg under sterila förhållanden i en BSL2 biologiska säkerhetsskåp.
- Använda sterila pipetter, för överföring urinprov steril 50 ml centrifugrör. Centrifugera vid 400 x g under 10 min vid RT.
- Aspirera supernatanten lämnar 1 ml i röret; vara noga med att inte störa cellpelleten.
- Resuspendera och kombinera pellets från flera rör i 7 ml tvättbuffert och upprepa centrifugering vid 400 x g under 10 min vid RT.
- Försiktigt aspirera supernatanten, lämnar cellpelleten och ~ 0,2-0,5 ml supernatant. Resuspendera i 2-3 ml urin stamcellstransplantation (UPC) medium och överför suspensionen i 4-6 brunnar i en unbelagda 24-brunnsplatta.
- Efter 72 timmar, komplettera kultur med 0,5 ml färskt UPC-medium per brunn och ändra medium var 2-3 dagar efter. Erytrocyterna och skvamösa celler som inte fäster till plattan kommer att tas bort med medium ändras de.
- Övervaka kultur efter 4-6 dagar.
OBS: Små 2-4 cellkolonier kommer att börja visas. Celler rundas eller avlånga som representerar typ I eller typ II av njur epitel (RE) celler respektive 3. - Ändra mediet var 2-3 dagar, sedan när cellerna visas, kommer de att genomgå en snabb fas expansion.
- När cellerna når 80-90% sammanflödet, cirka 9-15 dagar efter plätering, dissociera och passage cellerna (15,000-18,000 celler / cm2) på 2-4 brunnar av 24 brunnar för ytterligare expansion. Markera detta som cellpassage 1 (P1).
- Karakterisera urin celler för härstamning specifikationer genom flödescytometrisk analys, immunohistochemical färgning eller genom omvänt transkriptas-polymeraskedjereaktion (RT-PCR).
- Programmera isolerade urinceller (avsnitt 4) eller frysa ner dem i Frysning Medium (DMEM kompletterat med 10% serum och 10% DMSO) för långsiktig kryoförvaring.
4. Urin Cell Omprogrammering Använda Sendai Virus
OBS: korrekt hantering och användning av personlig skyddsutrustning (personlig skyddsutrustning) rekommenderas samtidigt manipulera transfekterar agenter. Utför följande steg under sterila förhållanden i en BSL2 biologiska säkerhetsskåp. Korrekt avfallshantering av transfektering agent och / eller transfekterade celler rekommenderas att undvika risken för miljö- och hälsorisker. För urincell omprogrammering, använd en Sendai Omprogrammering Kit med ändringar av tillverkarens feeder beroende protokoll som beskrivs nedan.
- För att garantera hög effektivitet omprogrammering använder Sendaivirus, passager användning 1-5 av urinceller som är snabbaly dela. Om cellerna inte replikera bra eller blir senescent, kasta dem eftersom de inte kommer omprogrammera effektivt.
- Seed 60.000 celler per brunn i två brunnar av en 6-brunnsplatta. Markera detta som Dag -2. Justera cellsåddtäthet (5 x 04-9 oktober x 10 4 celler per brunn) som krävs för att nå 80-90% konfluens vid dag 0.
- På dag 0 (48 h efter plätering av cellerna), förbereda Sendai omprogrammering vektorerna (SEV) innehållande vardera av de fyra OSKM faktorerna. Lägg varje vektor till 1 ml förvärmda UPC-medium. Använd en MOI av 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), vilket är tillräckligt för omprogrammering urinceller. Sug på medellång och sakta lägga till 1 ml UPC + SeV till en brunn av urincellerna. Använd den andra samt transduktion negativ kontroll.
- Dag 1, byter UPC + SeV medium med färskt UPC medium. Vissa celldöd ses efter 24 timmar på grund av virus cytotoxicitet.
- Beroende på effektivitet omprogrammeras Clone formationer och den kompakta morfologi, hålla ändra mediet dagligen till dag 6 eller 7.
- En dag före dissociation av transducerade celler (dag 5 eller 6), förbereda MEF matarplattorna genom utstrykning Mitomycin-C (10 ^ g / ml under 3 timmar) behandlade-MEF vid densitet av 5 x 10 4 celler / cm 2, på 0,1 % gelatin belagt 100 mm 2 odlingsskålar.
- Nästa dag (dag 6 eller 7), dissociera cellerna med 0,25% trypsin, resuspendera cellerna i UPC medium och platta 5 x 4-2 OKTOBER x 10 5 celler / 100 mm 2 MEF matare plattan.
- Följande dag, byta till hES medium och ändra mediet varje dag. Beakta cellerna under mikroskop för att övervaka transformerade celler.
OBS: Cellerna bildar klon aggregat med karakteristisk kullersten morfologi och har högre kärnan till cytoplasma förhållandet (12-18 dagar efter transduktion). - Inom två till tre veckor efter transduktion, plocka kolonier och överföra till nya plattor för Clonal expansion.
- Utför levande cell färgning för val IPSC-kloner genom inkubation celler med TRA-1-81 antikropp under 1 timme vid 37 ° C i CO2 inkubator följt av motfärgning med specifik fluorescerande färgämne konjugerad sekundär antikropp under 1 timme vid 37 ° C i CO2 inkubator.
- Använd en 26 G 1½ tum nål för kors kläcks de större TRA-1-81 positiva IPSC kloner i små lika stora bitar (4-6 stycken per klon).
- Använd en steril pipett-spets för att plocka och överföring 10-20 kors kläckta bitar från flera kloner i varje brunn på Matrigel (10 ug / cm2) -belagda 24 brunnar med HES medium.
OBS: Bitar från en enda klon pläterat individuellt i en enda väl inte expandera eller bibehålla pluripotens. - Ändring från hES till iPSC mediet 24-48 h efter den omprogrammerade klonerna är fästa på Matrigel ytan.
- Vid underhåll på Matrigel-belagda plattor, manuellt SCRApe-off några differentierade celler eller förorenande MEF matarceller med hjälp av en pipett-tips att anrika fullt omprogrammerade och pluripotenta dystrofa iPSC (MD-iPSC) kloner.
- Efter enskilda kloner har nått ~ 100 nm storlek, expandera kloner genom dissociation med 0,48 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra) lösning för 3 min och plätering små cellaggregat av MD-iPSCs suspenderade i iPSC medium (kompletterat med 5 ^ M Y27632, Rho-kinashämmare ) på färsk Matrigel (10 | ig / cm 2) belagda 12-brunnsplatta. Ändra iPSC mediet dagligen.
- Fullständig omprogrammering av varje klon kan bestämmas genom både genuttrycksanalys av OSKM gener och immunhistokemisk färgning av pluripotens markörer (Oct3 / 4 och TRA-1-81). En noggrann utvärdering av pluripotens potential bör utnyttjas för att bekräfta fullt omprogrammeras IPSC linjer kan differentiera till tre groddblad. Detta kan åstadkommas antingen genom embryoid kropp (EB) bildning och differentiering analys eller flera koatoma bildningsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De flesta progenitorceller isolerade från mänsklig urin är positivt för uroepithelial stamceller och pericyte markörer såsom CD44, CD73, och CD146 (97,37%, 97,09%, och 97,3% respektive; Figur 1A och 1B). Dessa celler uttryckte också andra mesenkymala markörer såsom alfa-glattmuskelaktin och vimentin (Figur 1B). RT-PCR-analys ger bevis på en blandad population av celler i de kulturer i att det finns en svag expression av Cytokeratin-7 (CK-7) och Uroplakin (UP) -ia & -IIIa, markörer för uroepithelial härstamning (Figur 1C).
Omprogrammeringen steg sammanfattas genom schematisk i figur 2A. Bilderna visar morfologin av cellerna under olika tidpunkter under hela protokollet (Figur 2B). Urin celler omvandlas från långsträckta, typ Il-celler (dag 0) till en gatsten mönster (Day 4) under omprogrammering. By Dag 12, typiska pluripotenta kloner (IPSC) ses och kan behålla sin pluripotenta morfologi enligt feeder fria förhållanden (iPSC-P2). Live cellfärgning för TRA-1-81 identifierar omprogrammerade kloner (Figur 2C).
För att bekräfta generationen av vektor och transgena fri pluripotenta kloner, är RT-PCR utförs med hjälp primers mot SeV virala genomet och var och en av de exogena OSKM faktorerna. Den uppreglering av endogena omprogrammering faktorer kan också bekräftas i detta steg. Den exogena genexpression inte längre detekteras genom passage-13, men den uppreglering av endogena faktorer kan ses (Figur 3A). Immunofluorescerande färgning bekräftar pluripotens markör uttryck på iPSCs (Oct3 / 4 och TRA-1-81; Figur 3B). Den endogena omprogrammering genuttryck ses i urinceller kan leda dessa celler att omprogrammera vid högre verkningsgrader 1, jämfört med andra somatiska cellkällor. De expressionen av dystrofin-gen och protein verifieras genom immunofluorescens-färgning, western blöt (WB) och RT-PCR-analyser (Figur 3C-E). Immunofluorescens färgning av vildtyp UCs och iPSCs för dystrofin demonstrera uppenbar nukleär lokaliserings 11 i iPSCs, men mycket få UCs uttryckte positiva (figur 3C). För att verifiera dystrofin uttryck i cellerna, immunoblotanalys för dystrofin avslöjade att den allestädes närvarande dystrofin isoform (Dp71) är den dominerande isoform produceras i vild typ iPSCs, medan dystrofiska iPSCs saknar dystrofin genuttryck har omätbara Dp71 uttryck (Figur 3D). De exon deletionsmutationer av dystrofin kan bekräftas i de dystrofa iPSCs med specifika primers flankerar de raderade exoner. Ingen PCR-amplifiering detekteras i de dystrofiska iPSCs medan vildtyp iPSCs demonstrera dystrofin transkriptet amplifiering (figur 3E).
inom-page = "always"> 
Figur 1. Karakterisering av isolerade Urin Cells (UCS) visar uroepithelial progenitor, mesenkymala och glatta muskelceller linjerna. (A) Flödescytometrisk analys av UC: er undersöktes med konjugerade antikroppar mot uroepithelial och pericyte markörer CD44, CD73 och CD146. (B) immunofluorescerande färgning UCS med CD44, αSMA och Vimentin. (C) Genexpression profil UCs visar svaga uttryck av CK-7 och UP-Ia och UP-IIIa jämfört med positiva kontrollprover medan genuttrycket av alfa-glattmuskelaktin (αSMA) är jämförbar med positiv kontroll. Klicka här för en större version av denna siffra.
ladda upp / 52.032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figur 2. Omprogrammering av UC för att generera iPSCs. (A) Schematisk översikt av omprogrammering tidslinje. (B) bilder som representerar olika morfologier UCS under SeV transduktion, vid dag 0 (SeV transduktion), Dag 4 (morfologisk övergång), Dag 12 (pluripotenta kloner växande på MEF) och den karakteristiska iPSC klonen enligt feeder fria förhållanden (IPSC -P2 på Matrigel). (C) Live cell imaging för TRA-1-81 för att identifiera pluripotenta kolonier vid dag 17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Generering av Viral Genome och Transgene Gratis iPSCs. (A)Genuttrycksanalys visar närvaron av SEV genomet och OSKM transgener vid passage 2 (iPSC-P2) och deras försvinnande från passagen 13 (iPSC-P13), medan endogena genuttryck kvarstår hela. (B) Fas kontrastrika bilder och immunofluorescens jämföra Oct3 / 4 och TRA-1-81 färgning i UCs och resulte iPSCs. (C) dystrofin detekteras genom immunofluorescens i vildtyp iPSCs jämfört med vildtyp UCs, och (D) den specifika dystrofin isoform (Dp71) kan bekräftas med WB. (E) RT-PCR-analys används för att bekräfta den specifika dystrofin exon borttagning i de dystrofa iPSCs jämfört med vildtyp UCs och iPSCs. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på reagens / Material / Utrustning | Företag | Katalognummer | Kommentarer |
| GAPDH-Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Upp-Ia-framåtriktad primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Upp-IIIa-framåtriktad primer | IDT Inc. | Seq given i kommentarer | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (Exogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (Exogena) -Omvänd Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (Exogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (exogena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (Exogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (Exogena) -Omvänd Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (Exogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (Exogena) -Omvänd Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (Exogena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (Exogena) -Omvänd Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | ENCCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (Endogena) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (Endogena) -Omvänd Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (Endogen) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (Endogen) -Omvänd Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Dystrofin-Forward Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Dystrofin-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq ges i kommentarer | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabell 1. Förteckning över Primer-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellering kardiovaskulära sjukdomar med hjälp iPSCs blir en gemensam strategi för att förstå den genetiska bidraget 4-6. Vissa oväntade svårigheter att erhålla cellprover från patienter, speciellt små barn, kan undvikas genom att erbjuda möjlighet till en icke-invasiv metod, såsom en urinsamling. I denna unga patientgrupp, är det ofta svårt att samla en volym av urin är tillräcklig för att ge tillräckligt med urin celler för omprogrammering. Coaching de unga patienterna att dricka vätska 30 min före urinsamling förbättrar framgången av urin cellisolering. Emellertid kan upprepade urininsamlingar vara nödvändiga i denna population. Vi har kombinerat och anpassat två olika protokoll 3,7 för att optimera isolering och odling av UC: er från patienter med muskeldystrofi.
Inducerade pluripotenta stamceller har genererats från antingen hud fibroblaster eller urin celler från muskeldystrofi patients 1,2. Men båda omprogrammeringar protokollen åberopas lentiviruses att införa omprogrammeringar faktorer i somatiska celler. Detta integrerande virus leveransmetod kan vara problematiskt om transgenen integrerar slumpvis in i värdgenomet och orsakar antingen transgen reaktive eller mutagenes (ses över 8). Därför har vi förbättrat vid dessa tekniker genom användning av Sendai-virus för att transducera de OSKM transgener in i urinen celler i en icke-integrerande sätt 9.
Denna metod med användning av Sendai-virus att omprogrammera UCs erbjuder fördelen av en icke-integrerande strategi med en högre transduktionseffektiviteten 9,10. Urin celler som samlats in från muskeldystrofi patienter omprogrammeras inom 2-3 veckor efter transduktion. Dessa omprogrammering kinetik är jämförbara med UC omprogrammering med hjälp lentiviral transduktion 1. Även om detta protokoll kan skalas för att upprätta feeder-fri metod för urin cell omprogrammering, varaing en effektiv metod att använda Sendai-virus transduktion av urin celler som isolerats från muskeldystrofi patienter. Denna metod beskrivs förlitar sig på MEF som ett matarskikt för att fullt ut etablera den pluripotenta MD klonen före överföring till feeder-fria betingelser vid passagen 2.
Kärn fördelningen av Dp71 isoform av dystrofin proteinet har länge varit etablerade i olika embryonala stadiet cellmodeller 11,12. Denna ubiquitous uttryck av Dp71 i kärnmatris bråkdel av tidiga progenitorceller / fosterstadiet celler antyder deras roll i kärn arkitektur och cellcykelreglering 12. Våra omprogrammerade vildtyp iPSCs uttrycka Dp71; dock inte sin frånvaro i dystrofiska iPSCs inte hämmar omprogrammering eller pluripotenta potential dystrofiska celler. Sammanfattningsvis är dystrofisk genmutationer konserverad i omprogrammeras iPSCs; vilket gör det till ett effektivt verktyg för att modellera dystrofisk kardiomyopati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
