Токсикологические анализы для тестирования воздействию эпигенетические препарата на развития, плодовитость и выживаемость малярийных комаров
Summary
A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Abstract
Инсектицидные сопротивление представляет собой серьезную проблему для программ по борьбе с малярией. Комары адаптироваться к широкому диапазону изменений в окружающей среде быстро, что делает борьбы с малярией вездесущую проблему в тропических странах. Появление инсектицидами устойчивых популяций гарантирует разведку новых целевых наркотиков путей и соединений для контроля комаров-переносчиков. Эпигенетические препараты хорошо зарекомендовали себя в области исследований рака, но не так много известно об их влиянии на насекомых. Это исследование дает простой протокол для изучения токсикологических эффектов 3-Deazaneplanocin А (DZNep), экспериментальной эпигенетической препарата для терапии рака, на переносчиками малярии, Anopheles gambiae. Зависит от концентрации увеличение смертности и уменьшением размера наблюдалось в незрелых комаров, подвергшихся DZNep, в то время как соединение уменьшили плодовитость взрослых комаров по сравнению с контрольными процедурами. Кроме того, было снижение наркотической зависимостью в S -аденозилгомоцистеин (САК) гидролазы деятельность в комаров после воздействия DZNep по сравнению с контрольной процедуры. Эти протоколы обеспечивают исследователя с простой, шаг за шагом процедуры для оценки несколько токсикологических для экспериментального препарата и, в свою очередь, демонстрируют уникальный подход мульти-контакт для изучения токсикологических эффектов водорастворимых эпигенетических наркотиков или соединений Интерес к комаров и других насекомых.
Introduction
Малярия является ответственным за наибольшее количество смертей насекомых, связанных в мире. По оценкам, 219 млн случаи происходят ежегодно во всем мире, в результате чего около 660 000 случаев смерти, главным образом в Африке 1. Несмотря на согласованные усилия, малярии, сталкиваются с рядом проблем. В то время как инсектицидные сеток, обработанных инсектицидами, а также крытый остаточные компоненты форма распыления ключевые программы, устойчивость к инсектицидам в местных групп населения подрывают эти усилия 2. Быстрый рост инсектицидом устойчивых популяций комаров в значительной степени объясняется способностью малярийных комаров быстро адаптироваться к изменениям в окружающей среде и эксплуатировать различные ниши 3,4,5. Чтобы преодолеть существующие механизмы стойкости к инсектицидам, разведка новых объектов инсектицидами и соединений нового поколения является оправданным. Простой, шаг за шагом протокол для определения эффективности экспериментальных инсектицидов на различных стадиях жизненного цикла малярийного мosquitoes значительно повысит эти усилия.
Фармакологические исследования эффектов препарата на клеточных линий и моделей на животных установлено использование эпигенетических наркотиков в качестве полезного инструмента для модуляции генетики и физиологии клеток и организмов. Метилирование ДНК и модификации гистонов два эпигенетические механизмы, которые влияют на экспрессию генов в многоклеточных организмов, не изменяя основную последовательность ДНК 6. Сообщение трансляционные модификации, такие как метилирование играют решающую роль в поддержании целостности клеток и экспрессию генов, и может повлиять на несколько фундаментальных процессов 7,8,9. Исследования в некоторых видов насекомых подчеркнули важность эпигенетических в процессах с участием оогенеза и стволовых ячейку для содержания 10, а также дозовой компенсации 11. Тем не менее, такие аспекты переносчиков болезней еще предстоит исследовать. Использование соединения для модуляции эту систему в комаров может предоставить нам вдостопримечательности в роман целевых инсектицид путей. 3-Deazaneplanocin (DZNep) является известный метилирования гистонов ингибитор, которые оказывают влияние на различные виды рака были изучены 12,13,14,15,16. DZNep является стабильным водорастворимый эпигенетические препарат, который косвенно препятствует гистонов лизина N -methyltransferase (EZH2), компонент Поликомб репрессивный комплекс 2 (PRC2) в клетках млекопитающих. PRC2 играет важную роль в регуляции роста стволовых клеток в многоклеточных организмов, и метилирования гистонов является ключевым аспектом PRC2 опосредованного молчания генов. В ослабленным иммунитетом мышей, клетки предварительно обрабатывали DZNep, как было показано, менее онкогенными 17. Этот препарат становится для изучения других заболеваний, таких как безалкогольное жирных заболевания печени, в которой EZH2 вовлечен 18. DZNep является создана S -adenosylhomocysteine (САК) гидролазы ингибитор 19, 20. Ингибирование САК результатов гидролазы внакопление и САК, в свою очередь, приводит к ингибированию активности метилтрансферазы, ограничивая доступные метил группы доноров. САК является производным аминокислоты используются многих организмов, в том числе насекомых, в их метаболических путей. Недавнее исследование показало, что DZNep в низких дозах может влиять на диапаузы и задержкой развития у насекомых 21.
Здесь надежный протокол исследования влияния водорастворимой соединения на различных стадиях жизненного цикла комаров развивается. Три части этого протокола включают в себя инструкции для изучения влияния водорастворимого соединения на незрелых комаров, взрослых крови вскармливания женщин и ферментативной активности у взрослых самцов и самок москитов. Во-первых, DZNep растворяют в воде для изучения незрелых развитие комаров и выживание. Это выполняется в двух концентрациях для сравнения каких-либо различий, связанных с 10-кратным увеличением воздействия лекарственного средства. Для изучения влияния препарата на взрослых самок комаров, DZNepдобавляется к defibrillated овечьей крови и подается кровь искусственно женщин. Впоследствии, исход препарата на плодовитость рассматривается. Наконец, активность фермента анализ проводят с использованием 5,5'-дитиобис (2-нитробензойной кислоты) (DTNB) в качестве индикатора для определения влияния на DZNep SAH гидролазы ингибирования у взрослых самцов и самок москитов. Хотя этот протокол разработан с малярийного комара Anopheles, gambiae, он может быть легко адаптирована к изучению влияния соединений, представляющих интерес в любых видов комаров или других насекомых. Методы, описанные в этом протоколе не может быть эффективно применено к препарату с ограниченным или нет растворимости в воде или водной среде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько шагов, жизненно важное значение для успешного применения этого протокола. Для личинок анализа, следует проявлять осторожность, чтобы правильно маркировать и повторить каждую концентрацию тест. Randomizing образцов и добавления Определенное количество препарата соответств?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
