A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Insekticid resistens er et stort problem for malaria kontrolprogrammer. Myg tilpasse sig til en bred vifte af ændringer i miljøet hurtigt, hvilket gør malaria styre en allestedsnærværende problem i tropiske lande. Fremkomsten af insekticid resistente populationer berettiger udforskningen af nye target narkotika veje og forbindelser til bekæmpelse af smittebærende myg. Epigenetiske lægemidler er veletablerede i kræftforskning, men ikke meget om deres virkninger på insekter. Denne undersøgelse giver en enkel protokol til at undersøge de toksikologiske virkninger af 3-Deazaneplanocin A (DZNep), en eksperimentel epigenetisk lægemiddel til kræftbehandling på malaria vektor Malariamyg. En koncentrationsafhængig stigning i dødeligheden og fald i størrelse blev observeret i umodne myg udsat for DZNep, mens forbindelsen reduceret frugtbarhed af voksne myg i forhold til at kontrollere behandlinger. Derudover var der en lægemiddel-afhængigt fald i S -adenosylhomocystein (SAH) hydrolase aktivitet i myg efter udsættelse for DZNep forhold til kontrol behandlinger. Disse protokoller give forskeren en enkel, trin-for-trin procedure til vurdering af flere toksikologiske endpoints for en eksperimentel medicin og til gengæld demonstrere en unik multi-prong tilgang for at udforske de toksikologiske virkninger af vandopløselige epigenetiske lægemidler eller forbindelser af interesser mod vektor myg og andre insekter.
Malaria er ansvarlig for det højeste antal insekt dødsfald i verden. Skønsmæssigt 219 mio tilfælde årligt på verdensplan, hvilket resulterer i ca. 660.000 dødsfald, primært i Afrika 1. Trods en fælles indsats malaria programmer, står flere udfordringer. Mens insekticide behandlede myggenet og indendørs sprøjtning formular centrale elementer i programmet, resistens over for insekticider i de lokale befolkninger hindre disse bestræbelser 2. Den hurtige stigning i insekticid resistente myg befolkninger er i vid udstrækning tilskrives evne malaria myg til hurtigt at tilpasse sig ændringer i deres miljø og udnytte forskellige nicher 3,4,5. For at overvinde de eksisterende mekanismer insekticidresistens, er udforskningen af nye insekticid mål og næste generation forbindelser berettiget. En simpel, trin-for-trin-protokol til bestemmelse af effektiviteten af eksperimentelle insekticider på de forskellige stadier af malaria mosquitoes vil i væsentlig grad øge disse bestræbelser.
Farmakologiske undersøgelser af effekter narkotika på cellelinjer og dyremodeller har etableret brugen af epigenetiske lægemidler som et nyttigt redskab til modulering af genetik og fysiologi af celler og organismer. DNA-methylering og histon modifikation er to epigenetiske mekanismer, der påvirker genekspression i flercellede organismer uden at ændre den underliggende DNA-sekvens 6. Indlæg translationelle modifikationer såsom methylering spiller en afgørende rolle i at opretholde cellulær integritet og genekspression, og kan påvirke flere grundlæggende processer 7,8,9. Forskning i nogle insektarter har understreget betydningen af epigenetik i processer, der involverer oogenesen og stamcelle vedligeholdelse 10, samt dosering kompensation 11. Men sådanne aspekter sygdomsvektorer endnu at blive udforsket. Ved hjælp af en forbindelse til at modulere dette system i myg kan give os iseværdigheder i de hidtil ukendte insekticid target pathways. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) er en kendt histon-methyleringsinhibitor, der påvirker forskellige typer af kræft er blevet undersøgt 12,13,14,15,16. DZNep er en stabil vandopløselig epigenetisk lægemiddel, der indirekte inhiberer histon lysin N -methyltransferase (EZH2), en bestanddel af Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) i pattedyrceller. PRC2 spiller en vigtig rolle i reguleringen af væksten af stamceller i flercellede organismer, og histon methylering er et centralt aspekt af PRC2 medieret gendæmpning. I immunokompromitterede mus, har celler forbehandlet med DZNep vist sig at være mindre tumorigene 17. Dette stof er ved at blive brugt til at studere andre sygdomme, såsom ikke-alkoholisk fedtlever, hvor EZH2 er impliceret 18. DZNep er en etableret S -adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase inhibitor 19, 20. Inhiberingen af SAH hydrolase resulterer i enakkumulering af SAH og til gengæld fører til hæmning af methyltransferase aktivitet ved at begrænse tilgængelige methyl donorgrupper. SAH er et aminosyrederivat anvendes af mange organismer, herunder insekter i deres metaboliske veje. En nylig undersøgelse har vist, at DZNep i lave doser kan påvirke diapause og forsinke udviklingen i insekter 21.
Her er en robust protokol til at undersøge virkningerne af en vandopløselig forbindelse på forskellige stadier af myg udvikles. De tre dele i denne protokol omfatter instruktioner til at undersøge virkningerne af en vandopløselig forbindelse på umodne myg, hunner voksne blod-fodring og enzymaktiviteten af voksne mandlige og kvindelige myg. Først DZNep opløst i vand for at studere umodne mosquito udvikling og overlevelse. Dette udføres ved to koncentrationer til at sammenligne eventuelle forskelle, der opstår fra 10 gange stigning i narkotika eksponering. At udforske effekten af lægemidlet på voksen kvindelige myg, DZNeptilsættes til defibrilleres får blod og fodret blodet kunstigt til hunner. Efterfølgende resultatet af lægemidlet på frugtbarhed undersøgt. Endelig er en enzymaktivitet assay udført under anvendelse af 5,5'-dithiobis- (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) som en indikator for at bestemme virkningen af DZNep på SAH-hydrolase hæmning hos voksne mandlige og kvindelige myg. Mens denne protokol er udviklet med en malaria myg, Malariamyg, kan det let tilpasses til at studere virkningerne af forbindelser af interesse på alle arter af myg eller andre insekter. De teknikker, der er beskrevet i denne protokol, kan ikke effektivt anvendes til et lægemiddel med begrænset eller ingen opløselighed i vand eller vandige medier.
Der er flere trin er afgørende for en vellykket gennemførelse af denne protokol. For larver assay, bør man sørge for at mærke og kopiere hver testkoncentration korrekt. Randomisering testprøver og tilsætte den udpegede mængde lægemiddel til respektive testbrønde er en vigtig del af denne eksperimentelle oprettet. Før du tilføjer 2. instar myggelarver til en 96-brønds mikroplade, kan hver larve sættes på et stykke køkkenrulle for 2-3 sek for at fjerne overskydende vand. For at undgå udtørring…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |