המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.
נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.
נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8.
במסמך זה אנו מציגים מבחר של in vivo ו במבחנת טכניקות שלעתים קרובות למימוש לגידול של EPN בתנאי מעבדה. אניn שיטות vivo להרהר מארח חרק לגידול של נמטודות. בדרך כלל, בשלבי בוסר של הזמנות חרקים שונות (כלומר פרפרים, Coleoptera, Diptera, וכו '.) נחשבים מארחים מתאימים. בvivo שיטות נחשבות בדרך כלל לתחזוקה של תרבויות נמטודות במעבדה. שיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר בוחנים ייצור המוני של נמטודות. כמויות גדולות של מארחי חרקים עשויות להידרש לעניין זה דורש יותר זמן ועלויות נוספות הקשורות לגידול החרקים.
יכולה גם להיות מתורבת נמטודות Entomopathogenic במבחנה בכמה כלי תקשורת. בהתאם למטרת המחקר, בשיטות מבחנה עשויה או לשקול ההתאגדות של החיידקים סימביוטיים בתקשורת. במצגת זו, אנו מתארים שתי שיטות נפוצות להפצת EPN. מרכיביה של התקשורת לספק מקור של חומרים מזינים לחיידק סימביוטיבמבחנה שיטות nd מקור סטרולים לנמטודות. מציעות את היתרון הגידול של EPN ללא מארח חרק.
במקור, רבים מכלי התקשורת במבחנה פיתחו שמשו לכפל של EPN כאשר מארחי חרקים מתאימים אינם זמינים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, במבחנה שיטות גידול הפכו עובדים רבים במחקר שמטרתו להבין את הקשר בין mutualistic EPN והחיידקים סימביוטיים 17,19.
הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.
שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמ…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP
Material | Company | Catalog Number | Comments |
For in vivo Infections | |||
100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
500 ml distilled H20 | |||
For Lipid Agar (for 1 L) | |||
100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
Distilled H20,890 ml |