Summary

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

Published: September 22, 2014
doi:

Summary

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

Abstract

נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

Introduction

נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8.

במסמך זה אנו מציגים מבחר של in vivo ו במבחנת טכניקות שלעתים קרובות למימוש לגידול של EPN בתנאי מעבדה. אניn שיטות vivo להרהר מארח חרק לגידול של נמטודות. בדרך כלל, בשלבי בוסר של הזמנות חרקים שונות (כלומר פרפרים, Coleoptera, Diptera, וכו '.) נחשבים מארחים מתאימים. בvivo שיטות נחשבות בדרך כלל לתחזוקה של תרבויות נמטודות במעבדה. שיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר בוחנים ייצור המוני של נמטודות. כמויות גדולות של מארחי חרקים עשויות להידרש לעניין זה דורש יותר זמן ועלויות נוספות הקשורות לגידול החרקים.

יכולה גם להיות מתורבת נמטודות Entomopathogenic במבחנה בכמה כלי תקשורת. בהתאם למטרת המחקר, בשיטות מבחנה עשויה או לשקול ההתאגדות של החיידקים סימביוטיים בתקשורת. במצגת זו, אנו מתארים שתי שיטות נפוצות להפצת EPN. מרכיביה של התקשורת לספק מקור של חומרים מזינים לחיידק סימביוטיבמבחנה שיטות nd מקור סטרולים לנמטודות. מציעות את היתרון הגידול של EPN ללא מארח חרק.

במקור, רבים מכלי התקשורת במבחנה פיתחו שמשו לכפל של EPN כאשר מארחי חרקים מתאימים אינם זמינים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, במבחנה שיטות גידול הפכו עובדים רבים במחקר שמטרתו להבין את הקשר בין mutualistic EPN והחיידקים סימביוטיים 17,19.

הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.

Protocol

.1 בvivo גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים Symboitic הפוך צלחת פטרי פלסטיק 100 x 15 מ"מ ומניח את שני דיסקים של נייר סינון (90 מ"מ) במכסה של הצלחת. לפזר באופן שווה 1 מ"ל של ההשעיה IJ (קטינים מ?…

Representative Results

שיטת גידול in vivo משתמשת חרקים חיים כמארחים לצמיחת נמטודות ורבייה. תאי דלקת הם שיטה יעילה לחשיפת IJS חרקים. זהו השלב היחיד במעגל החיים 'נמטודות שוקטורים בסימביוזת החיידקים ממארח ​​חרק אחד למשנהו. איור 1 מציג את להגדיר עבור תא זיהום, כמו גם את החומרים הדרו…

Discussion

שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP

Materials

Material  Company Catalog Number Comments
For in vivo Infections
100 x 15 Petri Dishes VWR 25384-088
Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose Whatman/VWR 28450-081 Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts Timberline http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG Galleria mellonella are recommended
For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri Dishes VWR 25384-092
Beef Liver, 50 g Locally sourced; butcher or supermarket Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef Kidney, 50 g Locally sourced; butcher or supermarket Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) Acros/VWR 200002-434 any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) HiMedia/VWR 95026-642 any media grade agar can be used
500 ml distilled H2
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri Dishes VWR 25384-088
Nutrient Broth, 8 g BD/VWR 90002-660
Yeast Extract, 5g EMD/VWR EM1.03753.0500
Magnesium Chloride Hexahydrate,  10 ml (0.2g/ml) EMD/VWR EM-MX0045-1
Corn Oil, 4 ml Any brand Locally source; supermarket Any brand of corn oil can be used
Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity Karo Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g HiMedia/VWR 95026-642 any media grade agar can be used
Distilled H20,890 ml

References

  1. Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
  2. Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
  3. Boemare, N., Gaugler, R. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. , (2002).
  4. Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. , 473-488 (2002).
  5. Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
  6. Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).
  7. Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
  8. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
  9. Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
  10. Koppenhöfer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).
  11. Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
  12. Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
  13. Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
  14. Poinar, G. O., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
  15. Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
  16. Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
  17. Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
  18. Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  19. Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).

Play Video

Cite This Article
McMullen II, J. G., Stock, S. P. In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (91), e52096, doi:10.3791/52096 (2014).

View Video