Summary
O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.
Abstract
Nematóides entomopatogênicos (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) têm uma parceria de mutualismo com Gram-negativo proteobactérias gama da família Enterobacteriaceae bactérias. Xenorhabdus estão associados com steinernematids nematóides enquanto Photorhabdus são simbiontes de heterorhabditids. Juntos nemátodos e bactérias formam um complexo insecticida potente que mata uma ampla gama de espécies de insectos numa íntima e específica. Aqui, demonstramos in vivo e in vitro de técnicas vulgarmente utilizadas na criação desses nemátodos em condições de laboratório. Além disso, estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN e também servir de base para outros bioensaios que utilizam esses organismos de investigação. A produção de aposymbiotic nematóides (free-simbiontes) muitas vezes é fundamental para uma profunda e abordagem multifacetada para o estudo da simbiose. Esteprotocolo não requer a adição de antibióticos e pode ser realizada num curto período de tempo com equipamento de laboratório standard. Nemátodos produzidos deste modo são relativamente robusta, embora a sua sobrevivência na armazenagem pode variar dependendo da espécie utilizada. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinado pelo Laboratório de P. da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.
Introduction
Nematóides entomopatogênicos (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e suas bactérias simbiontes, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) são considerados um modelo emergente de animal terrestre-micróbio relações simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. são abrigados como simbiontes no intestino da única etapa de vida livre dos nematóides, também conhecido como o juvenil infecciosa (IJ) ou 3a etapa infecciosa juvenil 8,10,13. O par bactéria nematóide é patogênico para uma ampla gama de insetos e tem sido implementado com sucesso no controle biológico e manejo integrado de pragas em todo o mundo 6,8.
Aqui vamos mostrar uma seleção de in vivo e in vitro técnicas que são frequentemente exercidos com a criação de EPN em condições de laboratório. Eun métodos in vivo contemplar um inseto hospedeiro para a criação dos nematóides. Normalmente, estágios imaturos de várias ordens de insetos (ou seja, Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) São considerados hospedeiros apropriados. Métodos in vivo são geralmente considerados para a manutenção de culturas de nematóides no laboratório. Este método pode não ser apropriado quando se considera a produção em massa dos nematóides. Grandes quantidades de insetos hospedeiros podem ser necessários para este fim exigindo mais tempo e os custos adicionais relacionados com o inseto criação.
Nematóides podem também ser cultivadas in vitro em vários meios de comunicação. Dependendo do objetivo do estudo, métodos in vitro podem ou considerar a incorporação das bactérias simbióticas na mídia. Nesta apresentação, descrevemos dois métodos comumente utilizados para a propagação de EPN. Os componentes dos meios fornecer uma fonte de nutrientes para a bactéria simbiótica umnd uma fonte de esteróis para os nematóides. métodos in vitro oferecem a vantagem da criação de EPN sem um inseto hospedeiro.
Originalmente, muitos dos meios de comunicação in vitro desenvolvido foram utilizados para a multiplicação de EPN quando insetos hospedeiros adequados não estão disponíveis. No entanto, ao longo dos últimos anos, in vitro métodos de criação tornaram-se amplamente utilizados em pesquisas com o objetivo de entender a relação de mutualismo entre EPN e suas bactérias simbióticas 17,19.
As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinados pelo Banco Laboratory, da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.
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Protocol
1. vivo criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias Symboitic
- Inverta a 100 x 15 mm de plástico placa de Petri e colocar dois discos de papel de filtro (90 mm) na tampa da cápsula.
- Distribuir uniformemente 1 ml da suspensão de água IJ (juvenis infectantes) (a uma concentração de 1000-2000 IJ / ml) no papel de filtro.
NOTA: IJs não precisa ser esterilizada por superfície. - Adicionar 10 último larvas do maior mellonella waxmoth Galleria para o prato. O objetivo é fornecer cerca de 100-200 IJs / larva.
- Cobrir a tampa com a parte inferior da placa de Petri (Figura 1) e a placa de Petri rotular. Mencione as seguintes informações: nome da espécie de nematóides (se conhecida); isolar código / designação; armadilha infecção data foi definida.
- Coloque o prato dentro de um saco plástico selado livremente (para conservar a umidade) e mantê-lo no escuro a qualquer temperatura ambiente ou em estufa entre 20-25 ° C. Confira pratos diariamente
NOTA: Darkness facilita a infecção por nematóides, uma vez que imita condições de infecção natural no solo. - Depois de 3-5 dias, remover cadáveres com sinais de infecção de nematóides para uma armadilha Branco modificado 7.
Nota: Se o cheiro pútrido cadáveres, isso pode ser uma indicação de que a cultura não foi bem sucedida e / ou houve contaminação. Definir uma nova câmara de infecção com um novo lote de nematóides e insetos.
2 In vitro criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias simbióticas
- Fígado e rim Agar Método 9,19
- Pique fígado e rim em pedaços pequenos (2 cm de 3 ou menor) e colocar dentro de uma misturadora com NaCl, ágar e 300 ml de água e misturar até que a carne torna-se uma polpa de líquido, pasta grossa ou puré. Em seguida, transferir mistura para um balão de Erlenmeyer de 1 L.
- Adicionar os últimos 200 mL de água para o recipiente misturador e decanta-se quaisquer meios de comunicação para a restanteErlenmeyer. Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C. Após autoclavagem permitir agar para esfriar a tocar antes de derramar.
NOTA: Pipetting do meio não é recomendado porque este meio tende a ter pedaços de carne. - Despeje ~ 20 ml de agar para 5 (ou 6) cm placas de Petri, enquanto agitação mão ou agitando o Erlenmeyer entre derrama para uma mídia mais homogênea. Permitir agar para solidificar e armazenar pratos a 4 ° C até ser necessário
NOTA: Use uma espátula de metal esterilizado-chama para quebrar qualquer grandes pedaços de carne derramado na placa de Petri.
- Lipid Agar Método 9,19
- Prepare ágar lipídico pela mistura de caldo nutriente, ágar e extrato de levedura e despeje a mistura em um frasco de 2 L Erlenmeyer. Adicionar H2O destilada e MgCl2 • 6H 2 O e em autoclave durante 15 minutos a 121 ° C.
- Adicione a mistura estéril de óleo e mistura de xarope de milho de milho e mexa ou agite vigorosamente e, muitas vezes para dispersar as gotículas de óleo uniformemente.
- Despeje ~ 20 ml de ágar sobre a 5 (ou 6) cm placas de Petri e permitir agar solidificar e armazenar em pratos 4 ° C até ser necessário.
- Raia a bactérias simbióticas desejado na placa de agar de lípidos e incubar as placas a 28 ° C durante 24-48 horas.
NOTA: Espalhe 100-200 mL de noite (12-16 horas) LB subcultura. - No dia seguinte, adicionar cerca de 0,4 ml de suspensão de nemátodos esterilizados à superfície (ovos ou juvenis infectantes) e incuba-se as placas à temperatura ambiente, no escuro ou dentro de uma incubadora a 22 ± 3 ° C.
NOTA: Não adicionar mais de 0,4 ml de suspensão de nematóides, uma vez que pode criar um ambiente excessivamente úmido que é desfavorável ao crescimento de nematóides. - Monitorar culturas diária. As culturas deverão produzir uma nova geração de IJ 's em cerca de 12 dias (Figura 2).
- Transferir prato inferior com ágar quando nemátodos são vistos rastejando os lados do prato (Figura 3A) para uma armadilha branco modificado (ver Orozco et al. 12) para colher IJ 's (Figura 3B). Execute esta etapa sob uma capela de fluxo laminar para reduzir a contaminação da mídia.
- Colete IJs da armadilha Branco modificado a emergência e enxaguar IJ suspensão para remover qualquer resíduo médio. Loja IJ em água destilada esterilizada, a 10 ° C (numa incubadora a temperatura fria ou ambiente frio) ou utilizar de imediato, se necessário.
NOTA: Dependendo do objetivo do estudo, semear as placas com tanto nematóides colonizado-simbiontes ou aposymbiotic.
3 In vitro criação de Aposymbiotic (Symbiont-free) entomopatogênicos Nematóides
- Infect 10-20 G. larvas mellonella com IJs das espécies de nematóides desejados (ver secção 1). Após 3 ou 4 dias (neste momento IJ 's deveriam ter amadurecidopara adultos de primeira geração) recolher cadáveres.
NOTA: O tempo até o vencimento e número de fêmeas necessários para obter um número suficiente de ovos varia de acordo com as espécies. Infectar mais G. mellonella larvas se necessário e começar a dissecções, logo no 48 horas após a infecção para avaliar se eles estão em fase de desenvolvimento direita. - Colocar cada cadáver individualmente em uma caixa de Petri com solução salina (tampão M9 18). Dissecar um cadáver, puxando sua cabeça com uma pinça fina ponta.
- Coletar pelo menos 20 grávidas (com ovos dentro) do sexo feminino, com uma agulha fina (em forma de L, de preferência) e coloque-os em um vidro de relógio contendo 10 ml de tampão M9 (Figura 4A).
- Prepara-se uma solução axenizing, considerando os seguintes ingredientes: 6,75 ml de água destilada, 1,25 ml de NaOH 5 N, e 2,25 ml de solução alcalina disponível comercialmente diluída até 3% de hipoclorito.
NOTA: NaOH é uma base de soluções de luvas, óculos e outros adequados de proteçãoroupa deve ser usado.
NOTA: Preparar a solução axenizing fresco de cada vez, como água sanitária degrada à luz. Prepare vários lotes de solução axenizing e realizar a esterilização superficial e colheita de ovos em vários vidros de relógio. - Lavar as fêmeas, pelo menos três vezes com tampão M9 enchimento relógio de vidro com solução tampão e sugando tampão com uma pipeta. Certifique-se que as fêmeas permanecem no vidro de relógio. Repita este passo mais duas vezes.
- Adicionar imediatamente a solução axenizing e permitir que as fêmeas que permanecem nesta solução por não mais de 10-15 minutos. Observar os tecidos de nematóides que começam a desintegrar-se, enquanto os ovos (que são resistentes à solução axenizing) permanecem intactas.
- Interromper manualmente órgãos femininos para acelerar o processo, cortando-as com uma agulha ou um escalpelo (Figura 4B, C). Retire os ovos pipetando-los em 1,5 ml microtubos, evitando a adição de qualquer tecido não dissolvido.
NOTA: Use como mquaisquer microtubos como necessário para recolher ovos e trabalhar rapidamente, como na viabilidade dos ovos irá diminuir ao longo de um período prolongado de exposição à solução axenizing. - Tubos de vórtice por 15 segundos usando o "ajuste de alta velocidade" para remover tecidos mais nematóides anexados aos ovos. Alternativamente, se um vórtice não estiver disponível, pipete subir e descer as soluções várias vezes.
- Ovos de pelotas por centrifugação a cerca de 18.000 g durante 2 min. Aumente a velocidade se os ovos não são suficientes para pellet. Retirar solução axenizing e lavar duas vezes através do enchimento do tubo de microcentrífuga com água destilada estéril e centrifugar mais uma vez a 900 xg durante 1 min.
- Após a última lavagem, ressuspender ovos em 300-500 mL de água destilada estéril e colocá-los em um estéril 3 centímetros de Petri ou esterilizados vidro de relógio. Lembre-se que os ovos já estão esterilizados-superfície, por isso use pipetas estéreis e / ou dicas pippetter e água para manter a limpeza dos ovos.
- Examine os ovos sob um microscópio de dissecação (ampliação 30-50X) para confirmar se eles estão intactos (Figura 4D) e transferi-los para uma placa de 5 cm com agar fígado-rim (ver secção 2.1)
NOTA: Não adicionar mais de 400 mL da suspensão de ovos nas placas como ele vai fazer o agar excessivamente molhado. - Placas de etiqueta com informações adequadas e armazená-los em pé no escuro, a 28 ° C. Eclosão dos ovos deve ser durante a noite evidente.
NOTA: A água pode se condensar na tampa do prato, mas ele vai evaporar depois de 1 ou 2 dias. Neste momento, colocar a cápsula no saco de plástico para reter a humidade do agar e evitar a sua secagem. - Observe pratos periodicamente e descartar todos os pratos que apresentam sinais de fungos ou contaminação bacteriana. Depois de IJ 's são vistas migrar para cima da parede da placa de Petri, remover a tampa e transferir o fundo da placa com agar para uma armadilha branco modificado 12. Considere condições estéreis ao transferir o prato na modified Branco armadilha para evitar a contaminação da mídia exposta.
- Continue monitorando as Armadilhas brancas e colheita IJ, conforme necessário.
NOTA: nemátodos Aposymbiotic irá continuar a migrar para dentro da água do colector de branco durante muitos dias e mesmo semanas.
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Representative Results
O método in vivo criação usa insetos vivos como hospedeiros para o crescimento e reprodução do nematóide. Câmaras de infecção são um método eficiente para expor insetos IJs. Esta é a única etapa no ciclo de vida dos nematóides que os vetores de bactérias simbiontes de um inseto hospedeiro para outro. Figura 1 mostra a configuração para uma câmara de infecção, bem como os materiais necessários para construir esta câmara. In vitro métodos de criação permitir EPN a crescer sem um insecto hospedeiro mas também são implementadas para a criação de aposymbiotic nematóides (livre)-simbiontes. Figura 2 mostra uma placa de agar de lípido com diferentes fases de nematóides. Placas de agar de lípido podem também ser considerados em ensaios de hibridização cruzada, que são necessários para validar a identidade do nematóide baseado no conceito de espécies biológicas. O método de agar de rim fígado foi originalmente descrito por Poinar & Thomas (1966) 14. Este método permite que os nematóides para amadurecer e reproducE sem um insecto hospedeiro e pode ser usado para nemátodos traseiros sem as suas bactérias simbióticas (isto é, produzir nematóides aposymbiotic). Uma desvantagem deste método é que é propenso a contaminação por causa da sua natureza rica, permitindo que as bactérias ou fungos indesejados para crescer. Figura 3A mostra placas de agar de rim e fígado com IJS rastejar sobre o lado da placa. Nesta fase, a porção de fundo da placa de Petri podem ser transferidos para uma armadilha branco modificado. Figura 3B demonstra uma chapa de fígado e rim, com nemátodos Steinernema em uma armadilha branco modificado para a colheita de IJ 's progenitura. Figura 4A mostra um vidro de relógio com prenhe Steinernema fêmeas antes da sua axenization. Figura 4B mostra a ruptura das fêmeas com uma agulha de dissecação. Figura 4C mostra as fêmeas interrompido na solução axenizing. Figura 4D mostra um ovo intactas do nemátodo Steinernemum carpocapsae.
Figura 1 Set up de uma câmara de infecção in vivo para criação de EPN. Linha superior mostra um papel cinco centímetros de Petri e filtro. A linha inferior exibe um prato e filtro de papel 10 centímetros Petri. Número do anúncio de larvas de insetos a cada câmara de infecção.
Figura método agar 2 Lipid para in vitro criação de EPN. A imagem mostra um close-up (ampliação de 20X) de um prato com nematóides adultos desenvolvendo no meio.
Figura 3 fígado e rim placa de ágar. Imagem A da esquerda mostra um prato com crescimento bem sucedido de nematóides. Note nemátodos rastejantes no lado do prato. Imagem B mostra uma placa de ágar fígado-rim colocado em uma armadilha Branco modificados para a colheita de nematóides IJ.
Figura 4 Assista vidro com fêmeas grávidas em axenizing solução. Imagem A mostra fêmeas grávidas na solução axenizing. A imagem B mostra a moagem das fêmeas com uma agulha de dissecação. Imagem C exibe interrompido fêmeas. Imagem D mostra um ovo intacto do nematóide Steinernema carpocapsae.
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Discussion
Usando um hospedeiro adequado é um fator chave para o sucesso na criação vivo da EPN. Normalmente, ambos os steinernematids e heterorhabditids podem se reproduzir e concluir com êxito o ciclo de vida das larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). No entanto, outras espécies de insetos de diferentes famílias e / ou encomendas podem ser considerados. Algumas das espécies nematóides actualmente descritos são conhecidos por ter especificidade para um hospedeiro insecto particular. Por exemplo, S. kushidai e S. scarabaei não são muito virulento para larvas de lepidópteros, e precisa de larvas de coleópteros, como o besouro do escaravelho (Scarabaeidae) para a criação bem-sucedida no laboratório. Outra espécie, S. scapterisci, prefere insetos orthopteran como grilos ou grilos.
Quando um hospedeiro adequado não estiver disponível, ou quando as condições experimentais que requerem, in vitro, os métodos podem ser utilizados para a criação de EPN. Estes métodos utilizam meios que oferecem uma rica fonte de nutrientes para nematóides e suas bactérias simbiontes. Nesta apresentação, são descritos dois tipos de ágar (fígado e rim, e de lípido), que pode ser utilizada para o crescimento e reprodução bem sucedida de EPN com ou sem as bactérias simbióticas.
Os usuários devem estar cientes de que o agar fígado e rim é um anúncio de mídia e, portanto, facilmente contaminada. A técnica asséptica é recomendado no tratamento de ambos os ovos axenized e as placas inoculadas, durante todas as etapas do processo. As placas que estão contaminados com bactérias ou fungos devem ser descartados imediatamente.
Quando criação aposymbiotic Steinernema IJs, deve ser tomado cuidado para lisar corretamente os tecidos de nematóides do sexo feminino, pois elas podem abrigar bactérias Xenorhabdus. Além disso, para validar que IJ são de fato livre de bactérias simbióticas, recomendamos a moagem de uma amostra de IJs recém-colhidas em LB com uma moto de mãor-driven pilão conforme (Heungens et al., 2002) 7 e placa a suspensão em meios NBTA 1. Se as colónias de bactérias encontram-se (após incubação durante a noite) será ou uma indicação de uma técnica axenization pobre ou o resultado de contaminação.
A criação de nemátodos Steinernema aposymbiotic é uma técnica que pode também ser considerada, em uma grande variedade de procedimentos e ensaios. Os leitores devem estar cientes de que o impacto de criação de nematóides Steinernema sem simbiontes ao longo de várias gerações podem ter um impacto sobre a aptidão do nematóide e sobrevivência durante tempos de geração. Alguns estudos sugerem a necessidade de seu emparelhamento em sistemas naturais 5,11,15-17. No entanto, esses estudos foram feitos em um número limitado de espécies e maior exploração é necessária.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão da National Science Foundation IOS-0840932 e 0724978 para IOS-SP da
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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