Summary
Le but de cette présentation est de démontrer in vivo et in vitro techniques pour l'élevage des nématodes entomopathogènes. Dans les méthodes in vivo considèrent l'élevage de ces nématodes avec un insecte hôte, alors que les méthodes in vitro utilisent rich media agar.
Abstract
Les nématodes entomopathogènes (EPN) (Steinernematidae et Heterorhabditidae) ont conclu un partenariat mutualiste avec Gram négatif Gamma-Proteobacteria dans la famille des entérobactéries bactéries. Xenorhabdus sont associés à steinernematids nématodes tout Photorhabdus symbiote de heterorhabditids. Ensemble, les nématodes et les bactéries forment un complexe insecticide puissant qui tue un grand nombre d'espèces d'insectes dans un partenariat intime et spécifique. Ici, nous montrons in vivo et in vitro, des techniques communément utilisées dans l'élevage de ces nematodes dans des conditions de laboratoire. En outre, ces techniques constituent des étapes clés de la mise en place réussie des cultures de l'EPN et constituent également la base pour d'autres essais biologiques qui utilisent ces organismes de recherche. La production de aposymbiotiques nématodes (gratuit symbiotes-) est souvent critique pour une en profondeur et une approche à multiples facettes pour l'étude de la symbiose. Ceprotocole ne requiert pas l'addition d'antibiotiques et peut être réalisé en un court laps de temps avec un équipement de laboratoire standard. Les nématodes produits de cette manière sont relativement robustes, bien que leur taux de survie en stockage variable en fonction de l'espèce utilisée. Les techniques décrites dans cette présentation correspondent à celles décrites par différents auteurs et affiné par le laboratoire de P. Stock, Université d'Arizona (Tucson, AZ, USA). Ces techniques se distinguent de l'ensemble de techniques qui sont utilisés dans la production de masse de ces micro-organismes à des fins de lutte antiparasitaire.
Introduction
Les nématodes entomopathogènes (EPN) Steinernema et Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) et leurs symbiotes bactériens, Xenorhabdus et Photorhabdus spp (entérobactéries) sont considérés comme un modèle émergent de animaux terrestres-microbe relations symbiotiques 2-4,6,10,19. Xenorhabdus et Photorhabdus spp. sont nourri comme symbiotes dans l'intestin de la seule étape sans vie des nématodes, aussi connu comme le mineur infectieux (IJ) ou 3 ème étape infectieux juvénile 8,10,13. La paire bactérie-nématode pathogène pour une large gamme d'insectes et a été appliqué avec succès dans la lutte biologique et les programmes de gestion intégrée des ravageurs dans le monde 6,8.
Ici, nous montrons une sélection in vivo et des techniques in vitro qui sont souvent exercées pour l'élevage des EPN dans des conditions de laboratoire. Jen méthodes in vivo reposent sur un insecte hôte pour l'élevage des nématodes. Habituellement, les stades immatures de divers ordres d'insectes (c.-à-lépidoptères, coléoptères, diptères, etc.) Sont considérés comme des hôtes appropriés. Dans méthodes in vivo sont généralement considérés pour l'entretien des cultures de nématodes dans le laboratoire. Cette méthode peut ne pas convenir lorsque l'on considère la production de masse des nématodes. De grandes quantités d'insectes hôtes peuvent être nécessaires à cette fin exiger plus de temps et des coûts supplémentaires liés à l'élevage d'insectes.
Les nématodes entomopathogènes peuvent également être cultivées in vitro sur plusieurs supports. Selon l'objectif de l'étude; méthodes in vitro ou peut envisager l'incorporation des bactéries symbiotiques dans les médias. Dans cette présentation, nous décrivons deux méthodes couramment utilisées pour la propagation de l'EPN. Les ingrédients des médias sont une source de nutriments pour la bactérie symbiotique unLes méthodes in vitro trouver une source de stérols pour les nématodes. offrent l'avantage de l'élevage de l'EPN sans passer par un insecte.
A l'origine, la plupart des médias in vitro mis au point ont été utilisés pour la multiplication des EPN lorsque les hôtes appropriés d'insectes ne sont pas disponibles. Toutefois, au cours des dernières années, in vitro méthodes d'élevage sont devenus largement utilisés dans la recherche visant à comprendre la relation de mutualisme entre EPN et leurs bactéries symbiotiques 17,19.
Les techniques décrites dans cette présentation correspondent à celles décrites par différents auteurs et affinée par la Banque de laboratoire, Université de l'Arizona (Tucson, AZ, USA). Ces techniques se distinguent de l'ensemble de techniques qui sont utilisés dans la production de masse de ces micro-organismes à des fins de lutte antiparasitaire.
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Protocol
1 in vivo Élevage de Nématodes entomopathogènes avec leurs bactéries Symboitic
- Inverser une boîte de Petri en plastique de 100 x 15 mm et de placer deux disques de papier filtre (90 mm) dans le couvercle de la boîte.
- Répartir uniformément 1 ml de l'IJ (juvéniles infectieux) la suspension de l'eau (à une concentration de 1000-2000 IJ / ml) sur le papier filtre.
REMARQUE: JI n'ont pas besoin d'être stérilisés en surface. - Ajouter 10 dernier stade larvaire de la plus grande waxmoth Galleria mellonella à plat. L'objectif est de fournir environ 100-200 JI / larve.
- Couvrir le couvercle avec le fond de la boîte de Pétri (figure 1) et l'étiquette de la boîte de Pétri. Mentionner les informations suivantes: nom de l'espèce de nématodes (s'il est connu); isoler code / désignation; infection de la date piège tendu.
- Placer le plat dans un sac plastique scellé de façon lâche (pour conserver l'humidité) et le maintenir dans l'obscurité à la température ambiante soit ou dans un incubateur entre 20-25 ° C. Vérifiez plats tous les jours
REMARQUE: Ténèbres facilite l'infection par les nématodes, car il imite les conditions d'infection naturelles dans le sol. - Après 3-5 jours, enlever les cadavres avec des signes d'infection par les nématodes à un piège blanc modifié 7.
NOTE: Si les cadavres odeur putride, ce peut être une indication que la culture n'a pas réussi et / ou il y avait contamination. Définir une nouvelle chambre de l'infection par un nouveau lot de nématodes et les insectes.
2 in vitro Élevage de Nématodes entomopathogènes avec leurs bactéries symbiotiques
- Foie-rein Agar Méthode 9,19
- Hacher le foie et les reins en petits morceaux (2 cm 3 ou moins) et placer dans un mélangeur avec du NaCl, agar et 300 ml d'eau et mélanger jusqu'à ce que la viande devient une pâte liquide, pâte épaisse ou de la purée. Ensuite, transférer le mélange dans un ballon de 1 L Erlenmeyer.
- Ajouter les 200 derniers ml d'eau dans le récipient du mélangeur et décanter tous les morceaux dans laErlenmeyer. Autoclave pendant 15 min à 121 ° C. Après autoclavage permet agar refroidir à toucher avant de couler.
REMARQUE: pipetage de milieu n'est pas recommandé car ce milieu a tendance à avoir des morceaux de viande. - Verser ~ 20 ml de gélose sur 5 (6) ou des boîtes de Pétri cm tout en agitant à la main ou en agitant le flacon Erlenmeyer entre déverse pour un support plus homogène. Laisser la gélose se solidifier et plats de magasins à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire
REMARQUE: Utilisez une spatule métallique flambé pour briser les gros morceaux de viande versé dans la boîte de Pétri.
- Lipidique Agar Méthode 9,19
- Préparer un milieu de gélose de lipides en mélangeant le bouillon nutritif, la gélose et l'extrait de levure et verser le mélange dans un flacon Erlenmeyer de 2 litres. Ajoutez de l'eau distillée 2 O et MgCl 2 • 6H 2 O et autoclave pendant 15 min à 121 ° C.
- Ajouter la préparation stérile d'huile et le sirop de maïs maïs mélange et remuer ou agiter vigoureusement et souvent à disperser les gouttelettes d'huile uniformément.
- Verser ~ 20 ml de gélose sur un 5 (ou 6) cm des boîtes de Pétri et laisser la gélose se solidifier et plats de magasins à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
- Streak le souhaite bactéries symbiotiques sur la plaque de gélose de lipides et incuber les plaques à 28 ° C pendant 24-48 h.
REMARQUE: Étaler 100-200 pi de nuit (12-16 h) LB sous-culture. - Le lendemain, ajouter environ 0,4 ml de surface stérilisée suspension de nématodes (œufs ou juvéniles infectieux) et incuber les plaques à température ambiante dans l'obscurité ou dans un incubateur à 22 ± 3 ° C.
NOTE: Ne pas ajouter plus de 0,4 ml de suspension de nématodes, car il peut créer un environnement excessivement humide qui est défavorable à la croissance des nématodes. - Surveiller les cultures tous les jours. Les cultures doivent produire une nouvelle génération de JI dans environ 12 jours (figure 2).
- Transfert plat fond avec de l'agar quand nématodes sont vus ramper les côtés du plat (figure 3A) à un piège blanc modifié (voir Orozco et al. 12) de récolter JI (figure 3B). Effectuez cette étape sous une hotte à flux laminaire pour réduire la contamination des médias.
- Recueillir JI du piège blanc modifié sur l'émergence et rincer IJ suspension pour enlever les débris moyen. Magasin IJ dans de l'eau distillée stérilisée à 10 ° C (dans un incubateur à basse température ou une chambre froide) ou utiliser immédiatement si nécessaire.
REMARQUE: En fonction de l'objectif de l'étude, épépiner les plaques avec soit des nématodes symbiotes colonisés ou aposymbiotiques.
3. in vitro Élevage de aposymbiotiques (Symbiont-gratuit) Nématodes entomopathogènes
- Infecter 10-20 G. larves mellonella avec JI des espèces de nématodes souhaités (voir section 1). Après 3 ou 4 jours (en ce moment JI aurait mûripour adultes de la première génération) recueillir des cadavres.
REMARQUE: Le temps de la maturité et le nombre de femelles nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d'œufs varie selon les espèces. Infecter plus G. mellonella larves si nécessaire et commencer dissections dès le post-infection de 48 h à déterminer si elles sont en phase de développement droite. - Placer chaque cadavre individuellement dans une boîte de Pétri avec une solution saline (tampon M9 18). Disséquer un cadavre en tirant sa tête avec une pince fine pointe de.
- Prélever au moins 20 gravide (avec des œufs à l'intérieur) les femmes avec une aiguille fine (en forme de L de préférence) et placez-les dans un verre de montre contenant 10 ml de tampon M9 (figure 4A).
- Préparer une solution de axenizing en considérant les ingrédients suivants: 6,75 ml d'eau distillée, NaOH 1,25 ml 5 et 2,25 ml disponible dans le commerce d'eau de Javel diluée à 3% d'hypochlorite.
REMARQUE: NaOH est une solution basique gants, des lunettes et autres mesures appropriées de protectionLes vêtements doivent être portés.
NOTE: Préparer une solution de axenizing frais à chaque fois, comme l'eau de Javel se dégrade à la lumière. Préparer plusieurs lots de solution de axenizing et effectuer la stérilisation de surface et la récolte des œufs dans plusieurs verres de montre. - Rincer les femelles au moins trois fois avec du tampon M9 remplissage verre de montre avec la solution tampon et le tampon aspirant avec une pipette. Assurez-vous que les femelles restent dans le verre de montre. Répétez cette étape deux fois.
- Ajouter immédiatement la solution de axenizing et femelles permettent de rester dans cette solution pendant pas plus de 10 à 15 min. Observer les tissus de nématodes commençant à se désintégrer pendant que les oeufs (qui sont résistants à la solution de axenizing) restent intacts.
- Manuellement perturber le corps des femmes pour accélérer le processus, en les coupant avec une aiguille ou un scalpel (figure 4B, C). Retirer les œufs en les pipetage dans 1,5 ml microtubes, en évitant l'ajout de tout tissu non dissous.
REMARQUE: Utiliser comme mdes microtubes comme nécessaire pour recueillir les œufs et travailler rapidement, comme la viabilité des oeufs diminue sur une période prolongée d'exposition à la solution de axenizing. - tubes Vortex pendant 15 secondes en utilisant le réglage "haut débit" à supprimer encore des tissus de nématodes attachés aux œufs. Par ailleurs, si un tourbillon n'est pas disponible, pipette de haut en bas la solution plusieurs fois.
- Œufs granulés par centrifugation à environ 18 000 g pendant 2 min. Augmenter la vitesse si les œufs ne font pas suffisamment culot. Retirer la solution de rinçage et axenizing deux fois en remplissant le microtube avec de l'eau distillée stérile et on centrifuge encore une fois à 900 x g pendant 1 min.
- Après le dernier lavage, remettre en suspension les œufs dans 300-500 ul d'eau distillée stérile et les placer dans une boîte de Pétri 3 cm stérile ou verre de montre stérilisé. Rappelez-vous que les œufs sont maintenant stérilisés en surface, afin d'utiliser des pipettes stériles et / ou des conseils de pippetter et de l'eau pour maintenir la propreté des œufs.
- Examiner œufs sous un microscope à dissection (30-50X de grossissement) pour confirmer qu'ils sont intacts (figure 4D) et de les transférer sur une plaque de 5 cm avec de l'agar foie-rein (voir section 2.1)
NOTE: Ne pas ajouter plus de 400 pi de la suspension d'oeuf sur les plaques car il fera l'agar excessivement humide. - Les étiquettes de marquage des informations appropriées et conservez-les debout dans l'obscurité à 28 ° C. L'éclosion des œufs devrait être évident nuit.
NOTE: L'eau peut se condenser sur le couvercle de la boîte, mais il s'évapore après 1 ou 2 jours. A cette époque, placez le plat dans un sac en plastique pour conserver l'humidité de l'agar-agar et éviter son dessèchement. - Observez plats périodiquement et jetez tous les plats qui présentent des signes de contamination fongique ou bactérienne. Une fois JI sont considérés migration jusqu'à la paroi de la boîte de Pétri, retirez le couvercle et transférer la capsule fond avec de l'agar à un piège blanc modifié 12. Tenir compte des conditions stériles lors du transfert de l'antenne dans la Modified piège blanc pour éviter toute contamination du milieu exposé.
- Continuer à surveiller les pièges blancs et récolte IJ selon les besoins.
REMARQUE: les nématodes aposymbiotiques continueront à migrer dans l'eau du piège blanc pendant plusieurs jours, voire des semaines.
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Representative Results
La méthode d'élevage in vivo utilise des insectes vivants comme hôtes pour la croissance et la reproduction des nématodes. chambres d'infection sont une méthode efficace pour exposer les insectes JI. C'est la seule étape du cycle de vie des nématodes vecteurs les bactéries symbiotiques d'un insecte hôte à un autre. Figure 1 montre la mise en place d'une chambre de l'infection ainsi que les matériaux nécessaires pour construire cette chambre. Méthodes in vitro d'élevage permettent EPN à se développer sans un insecte hôte, mais sont également mis en place pour l'élevage de aposymbiotiques nématodes (gratuit symbiotes-). Figure 2 montre une plaque de gélose lipidique avec différents stades de nématodes. des plaques de gélose de lipides peuvent également être envisagées dans des tests d'hybridation croisée qui sont nécessaires afin de valider l'identité de nématodes basé sur le concept d'espèce biologique. La méthode de la gélose de rein de foie a été décrite à l'origine par Poinar et Thomas (1966) 14. Cette méthode permet aux nématodes à maturité et reproe sans un insecte hôte et peut être utilisée pour les nématodes arrière sans leurs bactéries symbiotiques (c.-à-produire des nématodes aposymbiotiques). Un inconvénient de cette méthode est qu'elle est sujette à la contamination à cause de leur nature riche, ce qui permet des bactéries ou des champignons indésirables de se développer. Figure 3A montre des plaques de gélose foie-rein avec IJS rampant sur le côté de la plaque. A ce stade, la partie inférieure de la boîte de Pétri peut être transférée à un piège blanc modifié. Figure 3B montre une plaque foie-rein par des nématodes Steinernema dans un piège blanc modifié pour la récolte de JI progéniture. Figure 4a montre un verre de montre avec gravide Steinernema femelles avant leur axenization. figure 4B affiche la perturbation des femelles avec une aiguille de dissection. figure 4C montre les femelles perturbé dans la solution de axenizing. figure 4D montre un oeuf intact du nématode Steinernemun carpocapsae.
Figure 1: Mise en place d'une chambre d'infection pour l'élevage in vivo de l'EPN. Rangée du haut montre un papier de 5 cm de boîte de Pétri et le filtre. La rangée du bas affiche un plat et le papier filtre 10 cm de Pétri. Numéro de l'avis de larves d'insectes ajouté à chaque chambre de l'infection.
Figure 2 lipides méthode de gélose pour l'élevage in vitro de l'EPN. L'image montre un gros plan (20X) d'un plat avec des nématodes adultes se développant sur le milieu.
Figure 3 foie-rein agar plaque. L'image A gauche montre un plat avec une croissance réussie de nématodes. Notez nématodes rampant sur le côté de la boîte. Image B montre une plaque de gélose foie-rein placé dans un piège Blanc modifié pour la récolte des nématodes IJ.
Figure 4. Montre verre avec des femelles gravides dans axenizing solution. L'image A montre les femelles gravides dans la solution de axenizing. L'image B montre le broyage des femelles avec une aiguille à dissection. Image C affiche perturbé les femmes. Image D montre un oeuf intact du nématode Steinernema carpocapsae.
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Discussion
L'utilisation d'un hôte convenable est un facteur clé pour la réussite dans l'élevage vivo de l'EPN. Habituellement, les deux steinernematids et heterorhabditids peuvent se reproduire et compléter avec succès leur cycle de vie dans les larves de la teigne de la cire plus, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Cependant, d'autres espèces d'insectes de familles différentes et / ou des commandes peuvent être envisagées. Quelques-unes des espèces de nématodes actuellement décrits sont connus pour avoir une spécificité pour un insecte hôte particulier. Par exemple, S. kushidai et S. scarabées ne sont pas très virulent pour les larves de lépidoptères, coléoptères et les larves ont besoin, comme les larves de scarabée scarabée (Scarabaeidae) pour l'élevage de succès dans le laboratoire. Une autre espèce, S. scapterisci, préfère les insectes orthoptères tels que grillons ou courtilières.
Quand un hôte approprié n'est pas disponible ou si les conditions l'exigent expérimentales, des méthodes in vitro peut être utilisé pour l'élevage des EPN. Ces méthodes utilisent les médias qui offrent une riche source de nutriments pour les nématodes et de leurs symbiotes bactériens. Dans cet exposé, nous avons décrit deux types de gélose (foie-rein et des lipides) qui peut être utilisé pour la croissance et la reproduction de succès EPN avec ou sans leur bactéries symbiotiques.
Les utilisateurs doivent être conscients que l'agar foie-rein est rich media et est donc facilement contaminé. Technique stérile est recommandé dans le traitement de deux œufs axenized et les plaques inoculées pendant toutes les étapes de la procédure. Les plaques qui sont contaminés par des bactéries ou des champignons doivent être jetés immédiatement.
Lorsque l'élevage aposymbiotiques Steinernema JI, il faut veiller à lyser correctement les tissus de nématodes femelles, car ils pourraient contenir des bactéries Xenorhabdus. Aussi, pour valider que IJ sont en effet exempts de bactéries symbiotiques, nous vous recommandons le broyage d'un échantillon de JI fraîchement récoltées dans LB avec une moto à mainr axée pilon par (Heungens et al., 2002) 7 et la plaque de la suspension sur un support NBTA 1. Si les colonies de bactéries se trouvent (après incubation d'une nuit) il sera soit une indication d'une technique de axenization pauvre ou le résultat d'une contamination.
L'élevage des nématodes Steinernema aposymbiotiques est une technique qui peut également être pris en compte dans un large éventail de procédures et expériences. Les lecteurs doivent être conscients que l'impact de l'élevage nématodes Steinernema sans symbiotes sur plusieurs générations peut avoir un impact sur la condition physique et la survie des nématodes sur les temps de production. Quelques études suggèrent la nécessité de leur appariement dans les systèmes naturels 5,11,15-17. Cependant, ces études ont été réalisées sur un nombre limité d'espèces et une exploration plus poussée est nécessaire.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres de la Banque laboratoire: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson et Sam-Kyu Kim pour leurs contributions à l'amélioration de plusieurs de ces protocoles. Ce travail a été financé en partie par la subvention National Science Foundation IOS-0840932 et 0724978 pour IOS SP Stock
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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