Vivo में और Entomopathogenic नेमाटोड के इन विट्रो पालन में (Steinernematidae और Heterorhabditidae)
Summary
इस प्रस्तुति का लक्ष्य vivo में और entomopathogenic नेमाटोड के पालन के लिए इन विट्रो तकनीक में प्रदर्शित करने के लिए है. इन विट्रो तरीकों अमीर अगर मीडिया का उपयोग जबकि में विवो तरीकों, एक कीट मेजबान के साथ इन नेमाटोड के पालन पर विचार करें.
Abstract
Photorhabdus heterorhabditids की symbionts हैं जबकि Entomopathogenic नेमाटोड (EPN) (Steinernematidae और Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Xenorhabdus बैक्टीरिया steinernematids नेमाटोड के साथ जुड़े रहे हैं परिवार में ग्राम नकारात्मक गामा Proteobacteria साथ पारस्परिक साझेदारी है. साथ में नेमाटोड और बैक्टीरिया एक अंतरंग और विशिष्ट साझेदारी में कीड़ों की प्रजाति की एक विस्तृत श्रृंखला को मारता है कि एक शक्तिशाली कीटनाशक जटिल रूप में. इस के साथ साथ, हम vivo में और आमतौर पर प्रयोगशाला परिस्थितियों में इन नेमाटोड के पालन में इस्तेमाल विट्रो तकनीक में प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, इन तकनीकों EPN संस्कृतियों के सफल स्थापना के लिए महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं और यह भी अनुसंधान के लिए इन जीवों का उपयोग करने वाले अन्य bioassays के लिए आधार बनेगी. aposymbiotic (symbiont मुक्त) नेमाटोड का उत्पादन अक्सर सहजीवन का अध्ययन करने के लिए एक में गहराई और बहुमुखी दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण है. इसप्रोटोकॉल एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यकता नहीं है और मानक प्रयोगशाला के उपकरण के साथ समय की एक छोटी राशि में पूरा किया जा सकता है. भंडारण में उनकी उत्तरजीविता इस्तेमाल किया प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, हालांकि इस तरह से उत्पादित नेमाटोड, अपेक्षाकृत मजबूत कर रहे हैं. इस प्रस्तुति में विस्तृत तकनीक पी शेयर की प्रयोगशाला, एरिजोना विश्वविद्यालय (Tucson, AZ, संयुक्त राज्य अमरीका) द्वारा विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित और परिष्कृत उन के अनुरूप हैं. इन तकनीकों में कीट प्रबंधन प्रयोजनों के लिए इन जीवों का बड़े पैमाने पर उत्पादन में किया जाता है कि तकनीक के शरीर से अलग कर रहे हैं.
Introduction
Entomopathogenic नेमाटोड (EPN) Steinernema और Heterorhabditis एसपीपी. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) और उनके बैक्टीरियल symbionts, Xenorhabdus और Photorhabdus एसपीपी (Enterobacteriaceae) स्थलीय पशु सूक्ष्म जीव सहजीवी संबंधों 2-4,6,10,19. Xenorhabdus और Photorhabdus एसपीपी की एक आकस्मिक मॉडल माना जाता है. भी संक्रामक किशोर (आई जे) या 3 चरण किशोर 8,10,13 संक्रामक रूप में जाना जाता नेमाटोड का केवल मुक्त रहने वाले चरण की आंत में symbionts, के रूप में harbored रहे हैं. जीवाणु-निमेटोड जोड़ी कीड़े की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए रोगजनक है और सफलतापूर्वक जैविक नियंत्रण और एकीकृत कीट प्रबंधन कार्यक्रम दुनिया भर में 6,8 में लागू किया गया है.
इस के साथ साथ हम vivo में और अक्सर प्रयोगशाला परिस्थितियों में EPN के पालन के लिए प्रयोग कर रहे हैं कि इन विट्रो तकनीकों में से एक चयन दिखा. मैंएन विवो तरीकों नेमाटोड के पालन के लिए एक कीट मेजबान मनन. आमतौर पर, विभिन्न कीट आदेश (यानी लेपिडोप्टेरा, Coleoptera, Diptera, आदि.) के अपरिपक्व चरणों उपयुक्त मेजबान माना जाता है. तरीकों आमतौर पर प्रयोगशाला में निमेटोड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए माना जाता है में विवो. नेमाटोड का बड़े पैमाने पर उत्पादन पर जब इस विधि उपयुक्त नहीं हो सकता. कीट मेजबान की बड़ी मात्रा में अधिक समय और कीट पालन से संबंधित अतिरिक्त लागत की मांग इस उद्देश्य के लिए आवश्यक हो सकता है.
Entomopathogenic नेमाटोड भी कई मीडिया पर इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है. अध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करता है, इन विट्रो विधियों में मीडिया में सहजीवी जीवाणु के समावेश पर विचार कर सकते हैं या. इस प्रस्तुति में, हम EPN के प्रचार के लिए दो अधिक इस्तेमाल किया विधियों का वर्णन. मीडिया की सामग्री सहजीवी जीवाणु एक के लिए पोषक तत्वों का एक स्रोत प्रदानएन डी नेमाटोड के लिए एक sterol स्रोत. इन विट्रो विधियों एक कीट मेजबान बिना लाभ EPN के पालन की पेशकश.
उपयुक्त कीट मेजबान उपलब्ध नहीं हैं जब मूल रूप से विकसित इन विट्रो मीडिया के कई EPN के गुणन के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, पिछले कुछ वर्षों में, इन विट्रो पालन के तरीकों में व्यापक रूप से EPN और उनके सहजीवी जीवाणु 17,19 के बीच पारस्परिक संबंधों को समझने के लिए लक्ष्य अनुसंधान में कार्यरत हो गए हैं.
इस प्रस्तुति में विस्तृत तकनीक शेयर प्रयोगशाला, एरिजोना (टक्सन, AZ, संयुक्त राज्य अमरीका) विश्वविद्यालय द्वारा विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित और परिष्कृत उन के अनुरूप हैं. इन तकनीकों में कीट प्रबंधन प्रयोजनों के लिए इन जीवों का बड़े पैमाने पर उत्पादन में किया जाता है कि तकनीक के शरीर से अलग कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक उपयुक्त मेजबान का उपयोग EPN की विवो पालन में सफल के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. आमतौर पर, दोनों steinernematids और heterorhabditids पुन: पेश कर सकते हैं और सफलतापूर्वक अधिक से अधिक मोम कीट, गैलेरिया मेल्लोनेल्ला (ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों शेयर प्रयोगशाला के अतीत के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं: मिंग मिन ली, कॅथ्रीन Plichta, विक्टोरिया मिरांडा थॉम्पसन और सैम Kyu किम इन प्रोटोकॉल से कई के सुधार के लिए उनके योगदान के लिए. यह काम सपा शेयर करने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-0840932 और IOS-0724978 के हिस्से में वित्त पोषित किया गया
Materials
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| For in vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H20 | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H20,890 ml |
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N., Gaugler, R. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. , 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).
