In vivo och in vitro Uppfödning av entomopatogena Nematoder (Steinernematidae och Heterorhabditidae)
Summary
Målet med denna presentation är att visa in vivo och in vitro tekniker för uppfödning av entomopatogena nematoder. In vivo-metoder anser uppfödning av dessa nematoder med en insekt värd, medan de metoder in vitro utnyttjar rika agar media.
Abstract
Entomopatogena nematoder (EPN) (Steinernematidae och Heterorhabditidae) har en mutualistisk partnerskap med gramnegativa Gamma-Proteobacteria i familjen Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bakterier förknippade med steinernematids nematoder medan Photorhabdus är symbionter av heterorhabditids. Tillsammans nematoder och bakterier bildar en potent insekticid komplex som dödar ett stort antal insektsarter i en intim och specifik partnerskap. Häri visar vi in vivo och in vitro tekniker som vanligen används vid uppfödning av dessa nematoder under laboratorieförhållanden. Dessutom är dessa metoder utgör viktiga steg för en framgångsrik etablering av EPN kulturer och även ligga till grund för andra biologiska testsystem som utnyttjar dessa organismer för forskning. Produktionen av aposymbiotic (symbiont fritt) nematoder är ofta avgörande för en djupgående och mångfacetterad metod för studier av symbios. Dettaprotokollet inte kräver tillsats av antibiotika och kan göras på en kort tid med standard laboratorieutrustning. Nematoder som produceras på detta sätt är relativt robust, även om deras efterlevande i lager kan variera beroende på vilken art som används. De tekniker som beskrivs i denna presentation motsvarar de som beskrivs av olika författare och förfinats av P. Stock laboratorium, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Dessa tekniker är skilda från kroppen av tekniker som används vid massproduktion av dessa organismer för växtskydd ändamål.
Introduction
Entomopatogena nematoder (EPN) Steinernema och Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) och deras bakterie symbionter, Xenorhabdus och Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) anses en framväxande modell av markdjur mikrob symbiotiska förhållanden 2-4,6,10,19. Xenorhabdus och Photorhabdus spp. är hyste som symbionter i tarmen hos den enda fritt levande skede av nematoder, även känd som den smitt juvenil (IJ) eller 3: e stadiet smittsam juvenil 8,10,13. Bakterien-nematoden paret är patogen för ett brett spektrum av insekter och har framgångsrikt genomförts i biologisk bekämpning och integrerat växtskydd program världen över 6,8.
Häri visar vi ett urval av in vivo och in vitro-tekniker som ofta utnyttjas för uppfödning av EPN under laboratorieförhållanden. In vivo-metoder begrunda en insekt värd för uppfödning av nematoderna. Vanligtvis är omogna stadier av olika insekts order (dvs Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, osv.) Anses vara lämpliga värdar. In vivo metoder brukar anses för underhåll av nematoder kulturer i labbet. Denna metod kanske inte passar när man överväger massproduktion av nematoderna. Stora mängder insekts värdar kan krävas för detta ändamål kräver mer tid och extra kostnader i samband med insektsodling.
Entomopatogena nematoder kan också odlas in vitro i flera medier. Beroende på målet för undersökningen; i vitro-metoder kan eller överväga att införliva de symbiotiska bakterier i media. I den här presentationen, beskriver vi två vanliga metoder för förökning av EPN. Ingredienserna i medierna ger en källa till näringsämnen för symbiotiska bakterien and en sterol källa för nematoderna. In vitro-metoder erbjuder fördelen uppfödning av EPN utan en insekt värd.
Ursprungligen många av medierna in vitro utvecklades användes för förökning av EPN när lämpliga insekts värdar är inte tillgängliga. Men under de senaste åren, har uppfödnings in vitro-metoder blivit allmänt används i forskning för att förstå mutualistisk förhållandet mellan EPN och deras symbiotiska bakterier 17,19.
De tekniker som beskrivs i denna presentation motsvarar de som beskrivs av olika författare och finslipa Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Dessa tekniker är skilda från kroppen av tekniker som används vid massproduktion av dessa organismer för växtskydd ändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av en lämplig värd är en nyckelfaktor för en framgångsrik in vivo uppfödning av EPN. Vanligtvis kan både steinernematids och heterorhabditids reproducera och fullfölja sin livscykel i larver av större vax mal, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae). Däremot kan andra insektsarter från olika familjer och / eller beställningar vägas. Några av de för närvarande beskrivna nematodart är kända att ha specificitet för ett särskilt insektsvärden. Exempelvis S. kushidai</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka tidigare medlemmar i Stock lab: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson och Sam-Kyu Kim för deras bidrag till att förbättra många av dessa protokoll. Detta arbete har finansierats delvis av National Science Foundation IOS-0840932 och IOS-0724978 till SP Stock
Materials
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| For in vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H20 | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H20,890 ml |
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N., Gaugler, R. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. , 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).
