Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

dUTP Terminal transferase deoxynucleotidyl (TDT) תיוג ניק הסוף (TUNEL) הוא התהליך של שימוש באנזים TDT לצרף dUTP 3 'מסתיים כפול ודנ"א חד-גדילים שוברים 12,23. שיטת TUNEL לגילוי נזק אפופטוזיס ו- DNA דווחה לראשונה לפני למעלה מ -20 שנים על ידי et al גבריאלי. 1,12,24. זה מאז העריך ומותאם בהכנות רקמות שונות 7,23,27,40. TUNEL נעשה שימוש כדי ללמוד מוות מושרה איסכמיה תא של הנוירונים 6,14,29 וcardiomyocytes 43,44, מוות של תאים עצביים הפעלת יתר רעיל 30,31, וכסמן ביולוגי לטיפול בדלקת פרקים 39. כמו כן, שמש כגורם מנבא וסמן תאים סרטניים בסרטן בבני אדם שונים 2,3,15,32,37,38,42.

שיטות אלטרנטיביות קיימות לנזק לדנ"א וגילוי מוות של תאים, אבל יש להם אתגרים ואזהרות טכניים. סופג דרום עשוי לשמש לquantifנזק y DNA בlysates רקמות השלם 7,9-11, אך שיטה זו אינו מספקת רזולוציה ברמה התאית וקשה לכמת. Assay השביט הוא שיטה מבוססת תאים חלופי שדורשת חילוץ גרעינים השתמרו מתאי 4,20,28,36. למרות assay השביט עובד היטב בתאים מבודדים בתרבית, זה הרבה יותר קשה להכין גרעינים שלמים מרקמת שריר שלד 8,21. כמו עם כתם דרום, assay השביט אינו מספק מידע תא מסוג ספציפי מhomogenate רקמת שריר כולו. חלופה נוספת לשיטת TUNEL היא אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד DNA חד-גדילי 25,33,41 או נגד חלבונים המשתתפים במסלולי תגובת נזק ל- DNA ומוות של תאים (לדוגמא p53, H2AX, וcaspases) 13,17,22,40. שיטות המבוססים על נוגדנים אלה נדרשים אפיון יסודי של נוגדנים וספציפיות נוגדן מצוין להניב יחס אות ל- רקע גבוה. גם כאשר מפרטנוגדני ific קיימים, הם עשויים לדרוש denaturation של חלבון המטרה באמצעות הליכי אחזור אנטיגן 34,35. כפי שאנו דנים כאן, אחזור אנטיגן בתוצאות רקמת שריר גבוה בלתי מתקבל על הדעת autofluorescence. בניגוד לשיטות חלופיות, TUNEL משיג גילוי נזק ל- DNA עם אות גבוהה ורקע נמוך, סגוליות מעולה שיכול להיבדק עם פקדים פשוטים חיוביים ושליליים, חדירת רקמה טובה שאינו דורשים אחזור אנטיגן, ורזולוציה ברמה תאית. בנוסף, שיטת TUNEL לוקחת בערך 4 שעות כדי להשלים, ואילו בדרך כלל שיטות חלופיות דורשות incubations הלילה.

אנחנו לומדים מוות של תאי שריר שלד במודל עכבר של ניוון שרירים (SMA) 10 שנוצר על ידי Hsieh-לי ועמיתים 16. כדי לכמת תאים אפופטוטיים בשריר, פיתחנו שיטה של ​​הכנת רקמה, צביעה, וquantitation שעובדת וחסונה על פני skele שונהקבוצות שרירים טל בנקודות זמן התפתחותיים שונות בעכברים. אנו משתמשים בערכת TUNEL תיוג זמינה מסחרי ותוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרי. יש לנו גם השתמשתי בהצלחה assay TUNEL בשילוב עם מכתים immunofluorescent בחוט השדרה 10.

השיטות שתוארו כאן הן שימושיות לחוקרים שרוצים להעריך פתולוגיה רקמה, מנגנונים של מחלה, מנגנונים של הזדקנות, והתפתחותית (לפני ואחרי לידה) מוות של תאים בשריר שלד. טכניקת TUNEL שימושית במיוחד עבור מחקרים של נזק לדנ"א ותיקון ומוות של תאים במערכות מודל שבו רק קבוצת משנה של תאים הוא רזולוציה רמה מושפעת וסלולרית היא הכרחית.

וידאו זה מתאר לנתיחה, עיבוד רקמות, חתך, ותיוג TUNEL הקרינה מבוססת של שרירי שלד עכבר. הוא גם מתאר שיטה של ​​quantitation אות TUNEL חצי אוטומטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות 26. הפרוטוקול (MO13M391) אושר על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג'ונס הופקינס.

קורבן 1. ילודי עכבר, Dissection, וקיבוע

  1. להקריב את העכבר בילוד משאיפת CO 2.
  2. מנותק מייד hindlimb מעל הברך. עד שיום כ 7 לאחר הלידה, עצמות הרגל רכות מספיק כדי לחתוך דרך במספריים מעבדה גדולים או סכין חד ולאחר מכן קטע על cryostat.
  3. הנח את hindlimb ב 10 מיליליטר של paraformaldehyde 4% קרים כקרח שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בצינור 15 מיליליטר.
  4. טבילה לתקן hindlimb בparaformaldehyde ל4-24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. רקמה עוברית דורשת כמה שעות בלבדים של קיבעון.
    1. הימנע מקיבעון יותר מ 24 שעות, מכיוון שהדבר עלול להפחית את יעילות assay TUNEL.
  5. Cryoprotect hindlimb ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז.
    1. לשנות paraformaldehyde לסוכרוז 10% ב- PBS באותו הצינור 15 מיליליטר, דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. שינוי לסוכרוז 30% ב- PBS, דגירה הלילה ב 4 ° C או עד כיורים hindlimb לחלק התחתון של הצינור. רקמה ניתן להשאיר בסוכרוז% 30 לתקופה ארוכה יותר, ובלבד שסוכרוז כבר מסונן סטרילי.

2. רקמות הטבעה

  1. מלא שכותרתו חצי דרך עובש הטבעה עם ההטבעה בינונית.
  2. הנח hindlimb על גבי מדיום ההטבעה, עם הצד החתוך הקרוב ככל האפשר לקיר אחד של העובש. סמן את הכיוון של hindlimb בצד החיצוני של העובש.
    1. להטביע כמה hindlimbs ולחתוך באותו הבלוק. עם זאת, חשוב להבטיח כי כל היןdlimbs בבלוק מכוון מקביל זה לזה כדי לקבל חלקים ברמות תואמות לאורך הציר של הגפיים.
  3. לכסות hindlimbs עם ההטבעה בינונית. אם hindlimbs Shift לחוץ בזמן השפיכה הבינוני, מחדש מכוונים אותם עם מלקחיים קהים שקצהו או קיסם.
  4. לאפשר הטמעה בינונית לחדור את הרקמה בטמפרטורת חדר למשך לפחות 15 דקות.
  5. תבניות מקום ישירות על קרח יבש או באיזופנטאן על קרח יבש להקפיא הטבעה בינונית. הקפד לשמור על רמת התבניות בכל העת ולהימנע מהסטה של ​​הרקמה המוטבעת.
  6. שמור תבניות קפוא ב -80 ° C עד מוכן לחתוך, לתקופה של עד מספר חודשים.

3. איברים Cryosectioning Embedded

  1. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ל-20 ° C, טמפרטורת אובייקט ל-18 מעלות צלזיוס; להתאים טמפרטורת אובייקט למטה לפי צורך.
  2. לאזן את גוש הרקמה בתוך חדר cryostat לפחות 30 דקות. טמפ 'בלוק הנכוןerature הוא קריטי לאיכות סעיף.
  3. לחתוך חלקים רוחביים בעובי של 10 מיקרומטר או פחות. חלקים עבים יותר לא חדרו באופן מלא על ידי חומרים כימיים TUNEL. השתמש בצלחת אנטי-רול, להבים, וזווית להב (בדרך כלל 5 מעלות) מומלצים לcryostat.
  4. לאסוף חלקים על gelatin- או שקופיות זכוכית vectabond מצופים בטמפרטורת חדר. הנח מייד לתיבה להחליק על קרח יבש. שמור את תיבת השקופיות במכל נפרד עם קרח יבש ממוקם ליד cryostat בהישג יד.
    1. לחתוך חלקים רוחביים סידוריים דרך ציר הגפה הארוך, דילוג 100-200 מיקרומטר. לאסוף לפחות 3 חלקים סמוכים בכל רמת סדרתי.

4. TUNEL Assay על סעיפים Hindlimb באמצעות ערכה זמינה מסחרי (בכל הצעדים בטמפרטורת חדר אלא אם צוין)

  1. להפשיר שקופיות עם חלקים לטמפרטורת חדר ולילה יבש או בסוף השבוע.
  2. רעננותם סעיפים על ידי immersinשקופיות g בPBS עבור 2 x 10 דקות בצנצנת Coplin. יבש עם מעבדה לנגב, הסרת כמה שיותר נוזל סביב הסעיף ככל האפשר.
  3. חלקי Permeabilize
    1. השתמש באחת שאינו מפרקי חלבונים, מגיב מבוסס saponin מסחרי או 0.5% Tween20 ו0.05% Triton X100 בPBS.
    2. מניחים את השקופית לתוך תא לחות. תא לחות פשוט הוא תיבת קצה פיפטה ריקה עם מכסה הדוק, עם הוסיפו מספיק מים כדי לכסות את החלק התחתון של התיבה.
    3. מספיק מגיב פיפטה לשקופית כדי לכסות את הסעיף (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). אל פיפטה ישירות על הסעיף, כפי שתסיסה חוזרת ונשנית עלולה לגרום לסעיף להרים את השקופית.
    4. בעזרת מלקחיים קהים שקצהו, למקם את המלבן קטן של parafilm על גבי הסעיף להתפזר הירידה של מגיב ולכסות את הסעיף לחלוטין. אם כל בועות יוצרות תחת parafilm, בעדינות להרים אותו, יבש, ולהחיל מחדש.
    5. דגירה שקופיות עם permeabiliמגיב zation עבור שעה 1 בתא לחות מכוסה. אם חלקים מתחילים להמריא מהשקופיות, זמן permeabilization עשוי להיות מופחת עד 30 דקות.
    6. לשטוף שקופיות בPBS בדקות 2 x 5 צנצנת Coplin. המלבנים parafilm צריכים לצוף למעלה ולאחר מכן ניתן להסיר ומבוטל.
    7. באמצעות מעבדה לנגב, לייבש כמה שיותר נוזל סביב הסעיפים ככל האפשר.
  4. תיוג הפסקת DNA בתיווך TDT
    1. בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ 1x TDT תיוג, תיוג חיץ מספיק פיפטה לשקופית כדי לכסות קטע רקמה (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. לחלופין, לטבול את השקופית במאגר תיוג TDT בצנצנת coplin.
    2. עקוב אחר הוראות ערכה לעשות תערובת תיוג TDT. הערכה כוללת קובלט, מגנזיום, מנגן וקטיונים; קטיון מנגן עובד היטב במגוון רחב של רקמות, כולל שרירי שלד, Tiss מערכת עצביםUES, כבד, עור, ועצם.
    3. לביקורת חיובית, להוסיף DNase (שכותרתו "nuclease" בערכה) לתערובת תיוג TDT. לחלופין, טרום לטפל סעיף בקרה חיובי עם DNase במאגר nuclease עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות ערכה. שמור על פתרון DNase וחתכים שטופל DNase מסעיפים ניסיוניים אחרים כדי למנוע זיהום צולב.
    4. לביקורת שלילית, להשמיט אנזים TDT מתערובת התיוג.
    5. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר חיץ תיוג TDT משקופית ככל האפשר. תערובת תיוג פיפטה TDT לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    6. בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ תחנת 1x. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר תערובת תיוג TDT מהשקופיות, ולהוסיף 200-300 חיץ תחנת μl כדי לכסות את קטע הרקמה, דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. אל ternatively, לטבול את השקופית במאגר תחנה בצנצנת Coplin.
    7. שטוף את שקופיות דקות 2 x 2 בPBS. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS מהשקופית ככל האפשר.
  5. תיוג פלורסנט
    1. עקוב אחר הוראות ערכה להכנת פתרון תיוג והעמסת לתייג dNTPs בהפסקות DNA. פתרון פיפטה לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות למשך 20 דקות.
    2. שקופית לשטוף עבור 2 דקות ב PBS בצנצנת Coplin. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהשקופיות.
    3. לדלל Hoechst 33258 גרעיני כתם עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ופיפטה לשקופית (100-200 μl מספיק לכסות סעיף). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות.
    4. לשטוף 3x במשך 5 דקות בPBS.
    5. Coverslip עם antifade תקשורת הרכבה הקרינה ולאטום קצוות עם לק.
> 5 רכישת jove_title ". דיגיטלית תמונה

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי עם DAPI, FITC, ומסנני טקסס אדומים (או שווה ערך). השתמש במטרה גבוהה יותר הגדלה (20X או 40X) כדי לוודא שהתיוג היה מוצלח וגרעינים (שלמים או מקוטעים) תויגו. מטרת 10X מספיק כדי לכמת את puncta TUNEL-החיובי.
  2. לאסוף תמונות של צביעת Hoechst, מכתים TUNEL, ואות autofluorescent כשלושה ערוצים בצבעים מלאכותיים נפרדים בשילוב בתמונה אחת. אם תווית fluorophore TUNEL היא ירוקה, אות autofluorescent תמונה במסנן האדום, ולהפך.
    1. שמור את כל הגדרות ההדמיה שווה בין השקופיות לthresholding וquantitation שלאחר מכן. עבור כל מסנן, זמנים מוגדרים מראש וחשיפת שיא, רווח, וbinning (לא binning הוא הטוב ביותר); לא להשתמש בהגדרות חשיפה או רווח אוטומטיות.
    2. השתמש בניסוי וטעייה כדי למצוא הגדרות חשיפה ורווח שיהיה ללכוד הטוב ביותר בטווח של intensities בכל השקופיות המוכתמות. ודא שאין פיקסלים רוויים בתמונות שנרכשו, כquantitation הטיה רצון זה.
  3. קח תמונות של כל קבוצת השרירים של עניין. זה עשוי לדרוש מספר רב של תמונות ש" תפור "ביחד.

ניתוח 6. תמונה

  1. להשתמש בתוכניות ניתוח תמונה זמינות מסחרי כדי לנתח תמונות דיגיטליות של מכתים TUNEL. ניתוח באמצעות תוכנה מסחרית מוצג כאן. לחלופין, ImageJ התוכנה החופשי מNIH ניתן להשתמש כדי לנתח מכתים TUNEL.
  2. כתם סעיף סמוך לסעיף מוכתם TUNEL עם hematoxylin ו eosin (H & E) ולקחת תמונה דיגיטלית מלא קטע עם מיקרוסקופ brightfield קונבנציונלי. השתמש בתמונה זו H & E בשילוב עם אטלס האנטומיה 5,18,19 לאתר את המבנים אנטומיים שיש לכמת.
  3. עם ערוץ TUNEL כבוי, להתחקות באופן ידני את קווי המתאר של האזור שיש לכמת, באמצעותHoechst וערוצי autofluorescence להדרכה. להמיר את האזור איתר לתוך מסכה (סט של פיקסל נבחר מרכז להיות מנותח).
  4. הפעל את ערוץ TUNEL. שימוש בעוצמת thresholding פונקציה בתכנית ניתוח תמונה, לקבוע את הסף התחתון שלא לכלול את כל אות autofluorescence.
  5. להחיל את אותן הגדרות סף לכל התמונות בסט המחקר. המרת בחירות thresholded למסכות.
  6. עבור כל תמונה, לשלב את מסכת אזור השריר ומסכת TUNEL. מסכת השילוב החדשה תייצג אות TUNEL בתוך אזור השריר לייחס רק.
  7. לבצע quantitation מסכה על מסכת שילוב לקבוע מספר האובייקטים ומתנגדים אזור של אות TUNEL בתוך אזור השריר איתר. לבצע את זה באמצעות פונקצית החלקיקים Analyzer בImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם כתמים מוצלחים, אות TUNEL החיובי צריכה להיות בהירה מספיק כדי לבודד מautofluorescence על ידי קביעת סף עוצמה. אובייקטי TUNEL החיוביים בהגדלה נמוכה עשויים להופיע ברים סדירים בהירים כמו בשרירי שלד (איור 1 א). עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, כמה חפצי TUNEL חיובי עם המורפולוגיה אפופטוטיים הקלאסית יש לשים לב, אם סוג המוות של תאים המעורבים הוא אפופטוזיס (איור 1). הבקרה החיובית (DNase הוסיף) צריכה להפגין אות TUNEL החיובי בשפע, מפוזרת באופן אחיד על פני כל הרקמות בסעיף (איור 1 ג). הבקרה השלילית (אנזים TDT הושמט מתגובה) אמורה להניב רקע בעצימות נמוכות ואות autofluorescent בלבד (1D איור). עור מספק שליטה פנימית חיובית בסעיפי רגל כולה, כפי שרקמה זו יש שיעור גבוה של אפופטוזיס הנורמלי (איור 1 א).

דם אדוםתאים, עצם, ותאי האנדותל יכולים לתרום אות autofluorescent משמעותית (איור 2). מומלץ תמונה כל קטע בערוץ נפרד ללא תיוג ניאון כדי להבטיח autofluorescence כי הוא לא טועה לאיתות חיובית TUNEL. אות TUNEL חיובי אמיתית צריכה להיות בעוצמה גבוהה בהרבה מautofluorescence, כך שיכולים להיות המבודד על ידי קביעת סף עוצמת תמונה (איור 2 א, בשורה אמצעית). לחלופין, ערוץ autofluorescent עשוי להיות מופחת באופן דיגיטלי מערוץ TUNEL להניב אות TUNEL-חיובי (איור 2 א, שורה תחתונה).

שיטת תיוג TUNEL המתוארת כאן נעשתה שימוש כדי לכמת מוות של תאי שריר שלד במודל של עכברים של SMA 10. תיוג TUNEL מצביע על עלייה במספר הפרופילים אפופטוטיים בשרירי רגליים מעכברי SMA ישנים 5 ימים, בהשוואה לבקרת littermate (איור 3 א). העלייה באפופטוזיס היאלכימות בשיטה שתוארה לעיל, מצביע על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית במספר קבוצות שרירים (איור 3).

איור 1
איור 1: תיוג TUNEL נציג של שרירי hindlimb העכבר. () TUNEL שכותרת סעיף רוחבי של hindlimb העכבר מראה tibialis שרירים, שוקה, ועור קדמי. ת"א - tibialis קדמי, FDL - longus digitorum המכופף, EDL - longus digitorum פושטי. ירוק - TUNEL, כחולים - גרעינים, אדומה - אות autofluorescent. קווים מקווקווים להתוות תחומים שרירים כדי לכמת. העור סמוך שרירי hindlimb מספק שליטה פנימית חיובית לתיוג TUNEL. בר סולם = 200 מיקרומטר. תמונות ההגדלה גבוהה (B) נציג זיהוי מבני TUNEL-החיובי (ירוק) בעוברי יום 13 עכבר שרירי שלד כגרעינים אפופטוטיים. בר סולם = 10 מיקרומטר. A ו- B שונה מFayzullina ומרטין 2,014 10. (C) רוחבי סעיף של hindlimb עכבר TUNEL שכותרתו לאחר טיפול DNase לשמש כביקורת חיובית. רוב הגרעינים תיוג TUNEL בהיר. בר סולם = 50 מיקרומטר. (ד) סעיף רוחבי של אותו hindlimb העכבר כפי שמוצג בC (חצי סמוך לסעיף בC) TUNEL שכותרתו עם אנזים TDT הושמט כדי לשמש כביקורת שלילית. אין אות TUNEL חיובית בהירה; את האות הירוק רק הוא autofluorescence כפי שזוהה על ידי colocalization עם אות במסלול האדום. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2 "fo: = תוכן רוחב" "src =" 6in / קבצים / ftp_upload / 52,211 / "width =" 600 52211fig2highres.jpg "/>
איור 2: autofluorescence רקמות יש לקחת בחשבון ולא נכלל בניתוח quantitation תיוג TUNEL. (א) סעיף עכבר hindlimb רוחבי עם תיוג TUNEL וautofluorescence: תמונה מקורית (שורה העליונה), אותה תמונה עם ספים מתואמים (בשורה אמצעית), ואותה תמונה עם autofluorescence ערוץ (אדום) שנגרע (בשורה תחתונה). קביעת ערכי סף מבטל תא האדום ביותר בדם וautofluorescence תא האנדותל, אך לא את חפץ הצביעה (ראש החץ, בשורה אמצעית). חיסור ערוץ גם מבטל את חפץ הצביעה (ראש החץ, בשורה תחתונה). ירוק - TUNEL, אדום - autofluorescence, כחולים - גרעינים. בר סולם = 100 מיקרומטר. מלבן אפור משרטט אזור המוגדל בB. (ב) תמונה בהגדלה גבוהה יותר של פנל autofluorescence אדום ב. תאי דם אדומים וכמה תאי האנדותל (חיצים), וTissautofluoresce ue חפץ צביעה (ראש חץ) בשני מסנני הקרינה האדומים וירוקים. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תיוג TUNEL תערוכות מוות של תאים בשריר השלד של עכברי SMA ילוד שרירי hindlimb תחתון מעכברי SMA ביום הלידה 5 תויגו על ידי שיטת TUNEL () תיוג TUNEL תערוכות פרופילים אפופטוטיים מרובים בקבוצות שרירים מרובות בעכבר SMA.. שריר (מימין) בהשוואה לשליטה littermate (משמאל). ירוק - TUNEL, כחולים - Hoechst (גרעינים), אדום - autofluorescence. קווים מקווקווים להתוות אזורי השריר לכמת. ת"א - קדמי tibialis, FDL - חפירה מכופףlongus itorum, EDL - longus digitorum פושטי. ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר תיוג TUNEL. (ב) היה לכמת כאזור פיקסל הכולל של אות TUNEL המנורמל לאזור פיקסל הכולל של שרירים. אמצעי ± סטיות התקן מוצגים, n = 4 - 5 עכברים. משמעות סטטיסטי בין SMA ובקרה לכל קבוצת שרירים (אחד זנב מבחן t): * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. נתון זה שונה מFayzullina ומרטין 2,014 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה לאיתור ולכמותית לנתח אפופטוזיס הקשורים נזק ל- DNA בשרירי שלד עכבר מתואר. ההליך כולל קצירת רקמה, צביעת TUNEL, רכישת תמונה דיגיטלית, וניתוח תמונה. אספקה ​​היסטולוגית משותפת וכלים נחוצים, וערכת TUNEL מסחרית מיוחדת היא הכרחית. פריטי הציוד הגדולים החיוניים הדרושים הם מערכת מחשב לניתוח תמונה cryostat, מיקרוסקופ epifluorescent עם יכולת תמונה דיגיטלית, ו.

הנסיין צריך להיות מודע לבעיות פוטנציאליות. autofluorescence רקמות הוא דאגה העיקרית בתחום ההדמיה הקרינה. בבעלי החיים unperfused, שנותר תאי דם אדומים יתרום אות autofluorescent גבוהה למדי. תאי האנדותל יכולים להיות גם autofluorescent באופן משמעותי. לכן, חשוב לוודא כי autofluorescence הוא לא טועה לאות TUNEL-חיובית. הערכה זו מושגת בקלות על ידי לקיחת תמונה בערוץ ללא fluorophore, שישמש להשוואה וחיסור אפשרי מהערוץ TUNEL-החיובי. בדרך זו, שיטת TUNEL הקרינה מבוססת עדיפה על שיטות מיקרוסקופיה brightfield colorimetric שאינו מציעות בקרה פנימית לצביעת רקע.

קיבעון רקמות יהיה השפעות משמעותיות על ההצלחה של תיוג TUNEL. עדיף לצמצם את זמן קיבוע בparaformaldehyde, שלא יעלה על 24 שעות. רקמה עוברית וילוד תדרוש פעמים קיבעון קצרות יותר באופן משמעותי מאשר 24 שעות.

כאשר תיוג TUNEL הוא מוצלח, אות TUNEL החיובי צריכה להיות הרבה יותר גבוהה מאשר autofluorescence רקע, כך אות שניתן לבודד בקלות על ידי gating עוצמת הסף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. אחזור Antigen שימוש בפרוטוקול הרגיל של חימום במאגר ציטראט 27,35 עשויים לשפר מעט אות TUNEL נמוכה אם זמן חימום למינימום (5 דקות), אבל לפני הטיפול זה עשרds להפחית אות TUNEL אם חימום להארכה לתקופות ארוכות יותר (למשל 20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס). אחזור Antigen יגדיל autofluorescence רקע ותוצאות חיוביים שגויות, ובכך עשוי לשלול רווחים כלשהם ביחס אות לרעש מאות TUNEL מוגבר.

מדידות אות TUNEL חייבת להיות מנורמלות או לאזור השריר הכולל ונרשמת או למספר הגרעינים לאזור ונרשמת. בגלל TUNEL מודד גרעינים אפופטוטיים, הנורמליזציה האידיאלית תהיה גרעינים כולל. עם זאת, גם בסעיפים דקים יחסית (10 מיקרומטר) שריר, myofibers והגרעינים הם כה רבים וצפוף כל כך מקרוב, שזה בלתי אפשרי לספור באופן אוטומטי גרעינים צבעוניים Hoechst על ידי אלגוריתמי thresholding והפרדת חלקיקים. ספירה ידנית היא גם מאוד עתיר עבודה ולא מדויקת. החלופה אפשרית היא לנרמל לסך אזור שריר.

Assay TUNEL, בשימוש עם עיבוד רקמות מתאיםטכניקות ובקרות חיוביות ושליליות, היא שיטה מהירה יחסית, לשחזור, כמותי לאיתור נזק ל- DNA ומוות של תאים ברקמה. ניתן להשתמש בו כדי לאשר אפופטוזיס כמנגנון הפתולוגי, לזהות סוגים מושפעים תא, ועל מנת להעריך את יעילותם של טיפולים רפואיים. הליך זה יהיה בעל ערך לחוקרים בתחומי מחלות שלד שריר ופציעה, כוללים SMA, ALS, ניוון שרירים, מיופתיה מושרה רעלן, ולממש את הפיסיולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

פיזיולוגיה גיליון 94 TUNEL הקרינה שרירי שלד נזק ל- DNA ניתוח תמונה היסטולוגיה SMA מחלה הנוירון מוטורי
זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter