This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.
टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TDT) dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL के) dUTP को तीन संलग्न करने के लिए TDT एंजाइम का उपयोग करने की प्रक्रिया है 'डबल और एकल असहाय डीएनए 12,23 टूट के समाप्त होता है। Apoptosis और डीएनए की क्षति का पता लगाने के लिए TUNEL के विधि प्रथम Gavrieli एट अल। 1,12,24 से 20 साल पहले सूचना मिली थी। इसके बाद से मूल्यांकन किया और विभिन्न ऊतक तैयारी 7,23,27,40 में अनुकूलित किया गया है। TUNEL के न्यूरॉन्स 6,14,29 और cardiomyocytes 43,44 के ischemia के प्रेरित कोशिका मृत्यु, excitotoxic neuronal सेल मौत 30,31 अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और गठिया के इलाज 39 में एक बायोमार्कर के रूप में की गई है। यह भी विभिन्न मानव के कैंसर 2,3,15,32,37,38,42 में एक शकुन कारक है और ट्यूमर सेल मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
वैकल्पिक तरीकों का डीएनए की क्षति और कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए मौजूद हैं, लेकिन वे तकनीकी चुनौतियों और निरंतर है। दक्षिणी सोख्ता quantif करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैY डीएनए पूरे ऊतक lysates 7,9-11 में नुकसान है, लेकिन इस विधि सेलुलर स्तर के संकल्प प्रदान करते हैं और जिसका अंदाजा लगाना मुश्किल है नहीं करता है। धूमकेतु परख कोशिकाओं 4,20,28,36 से संरक्षित नाभिक निकालने की आवश्यकता है कि एक वैकल्पिक सेल आधारित पद्धति है। धूमकेतु परख सुसंस्कृत अलग कक्षों पर अच्छी तरह से काम करता है, यह कंकाल की मांसपेशी ऊतक 8,21 से बरकरार नाभिक तैयार करने के लिए और अधिक कठिन है। दक्षिणी धब्बा साथ के रूप में, धूमकेतु परख एक पूरे मांसपेशी ऊतक homogenate से सेल प्रकार विशिष्ट जानकारी प्रदान नहीं करता है। TUNEL के विधि करने के लिए एक अन्य विकल्प के एकल असहाय डीएनए 25,33,41 के खिलाफ या डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया और कोशिका मृत्यु रास्ते में (जैसे p53, H2AX, और caspases) 13,17,22,40 भाग लेने कि प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunohistochemistry है। इस तरह की एंटीबॉडी आधारित विधियों एक उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात उपज के लिए एंटीबॉडी का पूरी तरह से लक्षण वर्णन और उत्कृष्ट एंटीबॉडी विशिष्टता की आवश्यकता होती है। यहां तक कि जब कल्पनाific एंटीबॉडी वे प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं 34,35 के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन की विकृतीकरण आवश्यकता हो सकती है, मौजूद है। हम यहाँ पर चर्चा के रूप में, अस्वीकार्य उच्च autofluorescence में मांसपेशियों के ऊतकों परिणामों में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति। वैकल्पिक तरीकों के विपरीत, TUNEL के सरल सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, अच्छा ऊतक पैठ प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है कि, और सेलुलर स्तर के संकल्प के साथ परीक्षण किया जा सकता है कि एक उच्च संकेत और कम पृष्ठभूमि, उत्कृष्ट विशिष्टता के साथ डीएनए की क्षति का पता लगाने को प्राप्त होता है। वैकल्पिक तरीकों आमतौर पर रातोंरात incubations की आवश्यकता होती है, जबकि इसके अलावा, TUNEL के विधि, को पूरा करने के बारे में चार घंटे लगते हैं।
हम Hsieh ली और उनके सहयोगियों ने 16 से उत्पन्न किया गया है कि रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के 10 में से एक माउस मॉडल में कंकाल की मांसपेशी कोशिका मृत्यु का अध्ययन। मांसपेशी में apoptotic कोशिकाओं यों, हम विभिन्न skele भर में मजबूती के साथ काम करता है कि ऊतक तैयारी, धुंधला, और quantitation का एक तरीका विकसित किया हैचूहों में विभिन्न विकासात्मक समय बिंदुओं पर ताल मांसपेशी समूहों। हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TUNEL के लेबलिंग किट और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। हम भी सफलतापूर्वक रीढ़ की हड्डी 10 में Immunofluorescent धुंधला के साथ संयोजन में TUNEL के परख का इस्तेमाल किया है।
यहाँ वर्णित विधि कंकाल की मांसपेशी में ऊतक विकृति, रोग के तंत्र, उम्र बढ़ने के तंत्र, और विकास (पूर्व और प्रसवोत्तर) कोशिका मृत्यु का आकलन करना चाहते हैं जो जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होते हैं। TUNEL के तकनीक कोशिकाओं का केवल एक सबसेट प्रभावित और सेलुलर स्तर संकल्प आवश्यक है जहां मॉडल प्रणाली में डीएनए की क्षति और मरम्मत और कोशिका मृत्यु के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
यह वीडियो विच्छेदन, ऊतक प्रसंस्करण, सेक्शनिंग, और माउस कंकाल की मांसपेशी की प्रतिदीप्ति आधारित TUNEL के लेबलिंग का वर्णन है। यह भी अर्द्ध स्वचालित TUNEL के संकेत quantitation की एक विधि का वर्णन है।
एक विधि का पता लगाने और मात्रात्मक वर्णन किया गया है माउस कंकाल की मांसपेशी में डीएनए की क्षति जुड़े apoptosis के विश्लेषण करने के लिए। प्रक्रिया ऊतक कटाई, TUNEL के धुंधला, डिजिटल छवि अधिग्रहण, और छवि विश्लेषण भ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02.
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline | Electron Microscopy Sciences | 19202 | For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used. |
O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for cryosectioning. |
Cryostat | Leica | CM 3050S | A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used. |
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Slides from any supplier may be used. |
Gelatin | Sigma | G-9391 | Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased. |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) | Sigma | 243361 | Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum. |
Vectabond tissue adhesion reagent | Vector Labs | SP-1800 | Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead. |
Tween20 | Sigma | P9416 | A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used. |
Triton X100 | Sigma | T8787 | A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used. |
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit | Trevigen | 4812-30-K | Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling. |
DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used. |
DNase-free water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water from any supplier may be used. |
Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact. |
Parafilm M | multiple | 807 | Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers. |
Fluorescent microscope with digital camera | – | – | Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used. |
Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media from any supplier may be used. |
glass coverslips, No.1 thickness | Brain Research Labs | 2222-1 | Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22×22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections. |
Nail polish | Ted Pella | 114-8 | Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging. |