Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Detektion og analyse af DNA-skader i Mouse Skeletmuskel Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP nick endemærkning (TUNEL) er den proces, ved hjælp af TdT enzym til at fastgøre dUTP til 3'-enderne af dobbelt og enkelt-strenget DNA bryder 12,23. TUNEL metode til påvisning af apoptose og DNA-skader blev først rapporteret mere end 20 år siden af Gavrieli et al. 1,12,24. Det er siden blevet vurderet og optimeret i forskellige vævspræparater 7,23,27,40. TUNEL er blevet anvendt til at undersøge iskæmi-induceret celledød af neuroner 6,14,29 og cardiomyocytter 43,44, excitotoksisk neuronal celledød 30,31, og som biomarkør i arthritis behandling 39. Det er også blevet brugt som en prognostisk faktor og tumorcellemarkøren i forskellige humane cancere 2,3,15,32,37,38,42.

Der findes alternative metoder til DNA-skader og celledød afsløring, men de har tekniske udfordringer og forbehold. Southern blotting kan anvendes til quantify DNA-skader i hele væv lysater 7,9-11, men denne metode giver ikke cellulært niveau opløsning og er vanskelig at kvantificere. Kometen assay er en alternativ celle-baserede metode, der kræver at udvinde bevarede kerner fra celler 4,20,28,36. Selvom comet assay fungerer godt på dyrkede isolerede celler, er det langt mere vanskeligt at fremstille intakte kerner fra skeletmuskelvæv 8,21. Som med Southern blot, er kometen assay ikke celle-typespecifikke oplysninger fra en hel muskel vævshomogenat. Et andet alternativ til TUNEL metode er immunhistokemi ved anvendelse af antistoffer mod enkeltstrenget DNA 25,33,41 eller mod proteiner, der deltager i DNA beskadigelse respons og celledødsveje (f.eks p53, H2AX og caspaser) 13,17,22,40. Sådanne antistof-baserede fremgangsmåder kræver grundig karakterisering af antistoffer og fremragende antistofspecificitet til opnåelse af et højt signal-til-baggrund-forholdet. Selv når specSp ec ifik antistoffer eksisterer, kan de kræve denaturering af målproteinet via antigen modtagelsesprocedurerne 34,35. Som vi diskuterer her, antigen hentning i muskelvæv resulterer i uacceptabelt høj autofluorescens. I modsætning til de alternative metoder, TUNEL opnår DNA-skader detektion med et højt signal og lav baggrund, fremragende specificitet, der kan testes med enkle positive og negative kontroller, god vævspenetration, der ikke kræver antigen hentning og cellulært niveau opløsning. Desuden TUNEL metode tager omkring 4 timer at gennemføre, mens alternative metoder kræver typisk overnattende inkubationer.

Vi studerer skeletmuskel celledød i en musemodel af spinal muskulær atrofi (SMA) 10, der blev genereret af Hsieh-Li og kolleger 16. For at kvantificere apoptotiske celler i musklen, har vi udviklet en fremgangsmåde til vævspræparat, farvning og kvantificering, der virker robust over forskellige SkeleTal muskelgrupper på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter i mus. Vi bruger en kommercielt tilgængelig TUNEL-mærkning kit og kommercielt tilgængelig billedanalyse software. Vi har også med held anvendt TUNEL assay i kombination med immunfluorescensfarvning i rygmarven 10.

De her beskrevne metoder er nyttige for forskere, der ønsker at vurdere væv patologi, mekanismer på sygdom, mekanismer for aldring og udviklingsmæssige (præ- og postnatal) celledød i skeletmuskulatur. TUNEL teknik er især nyttig til undersøgelser af DNA-skader og reparation og celledød i modelsystemer, hvor kun en undergruppe af celler påvirkes og celleniveau opløsning er nødvendig.

Denne video beskriver dissektion, vævsbehandling, sektionering og fluorescens-baserede TUNEL mærkning af mus skeletmuskulatur. Det beskriver også en metode til halvautomatisk TUNEL signal kvantificering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr, der er beskrevet i denne protokol blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Institutes of Health 26. Protokollen (MO13M391) blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg.

1. Neonatal Mouse Sacrifice, Dissektion og fiksering

  1. Ofre en neonatal mus af CO 2 indånding.
  2. Umiddelbart afbrød bagbenet over knæet. Indtil ca. postnatal dag 7 benet knogler er bløde nok til at skære igennem med store laboratorie saks eller skarp kniv og efterfølgende afsnit om en kryostat.
  3. Placer bagbenet i 10 ml iskold 4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltopløsning (PBS) i et 15 ml rør.
  4. Immersion fastsætte bagbenet i paraformaldehyd i 4-24 timer ved 4 ° C. Fostervæv kræver kun flere times af fiksering.
    1. Undgå fiksering længere end 24 timer, da det kan reducere TUNEL assay effektivitet.
  5. Cryoprotect bagbenet ved at nedsænke det i sucroseopløsning.
    1. Skift paraformaldehyd til 10% sucrose i PBS i samme 15 ml rør, inkuberes natten over ved 4 ° C.
    2. Skift til 30% saccharose i PBS, inkuberes natten over ved 4 ° C eller indtil bagbenet synker til bunden af ​​røret. Væv kan efterlades i 30% saccharose i en længere periode, forudsat at saccharose er sterilfiltreret.

2. Tissue Indlejring

  1. Fyld en mærket indlejring skimmel halvvejs med indlejringsmedium.
  2. Placer bagben oven på indlejringsmediet, med snittet side så tæt som muligt på den ene væg af støbeformen. Marker orienteringen af ​​bagbenet på ydersiden af ​​formen.
    1. Integrer flere bagben og skæres i den samme blok. Det er imidlertid vigtigt at sikre, at alle hindlimbs i blokken er orienteret parallelt med hinanden for at få sektioner på matchende niveauer langs aksen af ​​lemmet.
  3. Dæk baglemmer med indlejringsmedium. Hvis bagben skift mens hælde mediet, re-orientere dem med stumpe spids pincet eller en tandstikker.
  4. Tillad indlejringsmedium at infiltrere væv ved stuetemperatur i mindst 15 min.
  5. Placer forme direkte på tøris eller isopentan på tøris til at fryse indlejringsmedium. Sørg for at holde forme niveau på alle tidspunkter og undgå forskydning af den integrerede væv.
  6. Hold frosne støbeforme ved -80 ° C indtil den er klar til at skære i op til flere måneder.

3. Cryosectioning Embedded Lemmer

  1. Indstil kryostatkammeret temperatur til -20 ° C, objekt temperatur til -18 ° C; justere objekt temperaturen ned som nødvendigt.
  2. Ækvilibrer vævsblokken inde i kryostatkammeret for mindst 30 min. Korrekt blok tempratur er afgørende for kvalitet sektion.
  3. Skær tværgående sektioner med en tykkelse på 10 um eller mindre. Tykkere sektioner vil ikke blive fuldt gennemtrænges af TUNEL reagenser. Brug snitstrækkerpladen, knive og kniv vinkel (typisk 5 °) anbefales til kryostaten.
  4. Saml sektioner onto gelatin- eller vectabond-coatede objektglas ved stuetemperatur. Umiddelbart ind i en dias kasse på tøris. Hold slide boksen i en separat beholder med tøris placeret nær kryostaten inden for rækkevidde.
    1. Skær tværgående serielle snit gennem den lange akse af benet, spring 100-200 um. Saml mindst 3 tilstødende sektioner ved hver serielle niveau.

4. TUNEL-analysen på bagben Sektioner anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit (alle trin ved stuetemperatur, medmindre bemærket)

  1. Optø dias med sektioner til stuetemperatur og tørre natten over eller i løbet af weekenden.
  2. Rehydrér sektioner ved immersing dias i PBS i 2 x 10 minutter i en Coplin-skål. Tør med en lab tørre, fjerner så meget væske omkring afsnittet som muligt.
  3. Permeabiliserer sektioner
    1. Brug enten en ikke-proteolytisk, saponin-baserede kommercielle reagens eller 0,5% Tween 20 og 0,05% Triton X100 i PBS.
    2. Placer dias i et fugtigt kammer. En simpel fugtighedskammer er en tom pipettespids kasse med et stramt låg, med lige nok vand til at dække bunden af ​​kassen.
    3. Pipette nok reagenset på dias til at dække sektion (50 pi er tilstrækkelig til neonatale mus lemmer). Bør ikke opsuges direkte på afsnittet, som gentagne agitation kan forårsage det afsnit, der løftes af dias.
    4. Ved stump spids pincet, placere en lille rektangel af parafilm oven afsnittet at sprede dråbe reagens og fuldstændigt dækker sektion. Hvis der bobler dannes under parafilm, forsigtigt løfte det ud, tør, og genanvende.
    5. Inkuber dias med permeabilining reagens i 1 time i en overdækket fugtighedskammer. Hvis dele begynder at løfte fra slide, kan permeabilization tid nedsættes til 30 minutter.
    6. Vask slides i PBS i en Coplin-skål 2 x 5 min. Parafilmen rektangler skal flyde til toppen og kan derefter fjernes og kasseres.
    7. Ved hjælp af en lab Udvisk, tør så meget væske omkring afsnittene som muligt.
  4. TdT-medieret DNA break mærkning
    1. Følg kit instruktioner for at gøre 1x TdT mærkning buffer, pipette nok mærkning buffer på objektglasset for at dække vævssnittet (50 pi er tilstrækkelig til neonatale mus lemmer). Inkuber i fugtighedskammeret i 5 min. Alternativt nedsænkes dias i TDT mærkning buffer i en Coplin-skål.
    2. Følg kit instruktioner for at gøre TdT mærkning mix. Sættet indeholder cobalt, magnesium og mangan kationer; mangan kation fungerer godt på en række forskellige væv, herunder skeletmuskel, nervesystemet Tissdier, lever, hud og knogler.
    3. For en positiv kontrol tilsættes DNase (mærket "nuklease" i sættet) til TdT mærkning mix. Alternativt præ-behandling af en positiv kontrol sektion med DNase i nuclease buffer i 1 time ved 37 ° C, ifølge kittets instruktioner. Hold DNase opløsning og DNase-behandlede sektioner væk fra andre eksperimentelle afsnit for at undgå krydskontaminering.
    4. For en negativ kontrol, udelade TdT enzym fra mærkning mix.
    5. Brug en lab Udvisk at fjerne så meget TdT mærkning buffer fra slide som muligt. Pipette TdT mærkning mix på objektglasset (50 pi per afsnit), dække med en ny rektangel parafilm og inkuber i fugtigt kammer ved 37 ° C i 1 time.
    6. Følg kit instruktioner for at gøre 1x stopbuffer. Brug en lab tørre for at fjerne TdT mærkning mix fra objektglasset, og tilføj 200-300 pi stopbuffer at dække vævssnittet og inkuberes i fugtigt kammer i 5 min. Al ternatively, nedsænkes dias i stop-buffer i en Coplin-skål.
    7. Vask objektglasset 2 x 2 minutter i PBS. Brug en lab Udvisk at fjerne så meget PBS fra slide som muligt.
  5. Fluorescerende mærkning
    1. Følg kit instruktioner for at forberede fluoresceinmærkning løsning at mærke dNTP'er ved DNA pauser. Pipette opløsningen på glideren (50 pi per afsnit), dække med en ny rektangel parafilm og inkuber i fugtighedskammeret i 20 minutter.
    2. Vask slide i 2 min i PBS i en Coplin-skål. Brug en lab Udvisk at fjerne så meget PBS som muligt fra slide.
    3. Fortynd Hoechst 33258 nukleare plet til 1 ug / ml i PBS og pipette på objektglasset (100-200 pi er tilstrækkelig til at dække afsnit). Inkuber i fugtighedskammeret i 5 min.
    4. Vask 3x i 5 minutter i PBS.
    5. Dækglasset med antiblegemiddel fluorescens monteringsmedie og forsegle kanterne med neglelak.
jove_title "> 5. Digital Image Acquisition

  1. Anskaf billeder ved hjælp af en konventionel fluorescerende mikroskop med DAPI, FITC og Texas Red filtre (eller tilsvarende). Brug en højere målsætning forstørrelse (20X eller 40X) for at kontrollere, at mærkningen var vellykket, og kerner (intakte eller fragmenterede) blev mærket. En 10X mål er tilstrækkelig til kvantificering af TUNEL-positive puncta.
  2. Saml billeder af Hoechst farvning, TUNEL farvning, og autofluorescerende signal som tre separate falske farvekanaler kombineret i ét billede. Hvis TUNEL fluorofor etiketten er grøn, image autofluorescerende signal i rødt filter, og omvendt.
    1. Hold alle billeddiagnostiske indstillinger svarende mellem dias til efterfølgende tærskel og kvantificering. For hvert filter, forudindstillede og optage eksponeringstider, gain, og binning (ingen binning er bedst); Brug ikke eksponering eller forstærkning automatisk.
    2. Brug trial-and-error at finde eksponering og forstærkning, der bedst indfanger forskellige Intensiteterne på tværs af alle farvede objektglas. Sørg for, at der ikke er nogen mættede pixels i de tilkøbte billeder, da dette vil skævhed kvantificering.
  3. Tag billeder af hele muskel gruppe af interesse. Dette kan kræve flere billeder, der skal "sys" sammen.

6. Image Analysis

  1. Brug kommercielt tilgængelige billede analyseprogrammer til at analysere digitale billeder af TUNEL farvning. Analyse ved hjælp af kommerciel software er vist her. Alternativt kan den gratis software ImageJ fra NIH blive brugt til at analysere TUNEL farvning.
  2. Farv en sektion ved siden af ​​TUNEL-farvede sektion med hematoxylin og eosin (H & E) og tage en fuld-sektion digitalt billede med en konventionel brightfield mikroskop. Brug denne H & E billede i kombination med en anatomi atlas 5,18,19 at spore de anatomiske strukturer, der skal kvantificeres.
  3. Med TUNEL kanal slukket, manuelt spore omridset af området, der skal kvantificeres ved hjælp afHoechst og autofluorescens kanaler for vejledning. Konverter spores område i en maske (et sæt udvalgte pixel koordinater skal analyseres).
  4. Tænd TUNEL kanal. Brug af intensiteten tærsklingsrutine funktion i billedet analyseprogram, skal du indstille den nedre at udelukke alle autofluorescens signal.
  5. Anvende den samme tærskel indstilling for alle billeder i studiet sættet. Konverter tærskelværdisammenlignede markeringer i masker.
  6. For hvert billede, kombinere musklen området masken og TUNEL maske. Den nye kombination maske vil repræsentere TUNEL signal inden den spores muskel eneste område.
  7. Udfør maske kvantificering på kombinationen maske til at bestemme antallet af objekter og objekt område af TUNEL signal inden det spores muskel-området. Udfør dette ved hjælp af Particle Analyzer funktion i ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med vellykket farvning, bør TUNEL-positive signal være lyse nok til at isolere fra autofluorescens ved at indstille intensitet tærskler. TUNEL-positive ting ved lav forstørrelse kan fremstå som lyse uregelmæssige fragmenter i skeletmuskulatur (figur 1A). Men ved højere forstørrelse, bør observeres nogle TUNEL-positive objekter med klassiske apoptotisk morfologi, hvis celledød typen involveret er apoptose (figur 1B). Den positive kontrol (DNase tilføjet) bør udvise rigelige TUNEL-positive signal, fordelt ensartet over alle væv i afsnittet (figur 1C). Den negative kontrol (TdT enzym udeladt fra reaktion) bør give lav intensitet baggrund og autofluorescerende signalet (figur 1D). Hud giver en intern positiv kontrol i hele benafsnit, da dette væv har en høj normal apoptose (figur 1A).

Red Bloodceller, knogler og endotelceller kan bidrage signifikant autofluorescerende signal (figur 2). Det er tilrådeligt at billedet hver sektion i en separat kanal uden fluorescerende mærkning for at sikre, at autofluorescens ikke forveksles med positiv TUNEL signalering. Ægte TUNEL-positive signal bør have meget højere intensitet end autofluorescens, således at det kan isoleres ved at sætte billede intensitet tærskler (figur 2A, midterste række). Alternativt kan autofluorescerende kanal digitalt fratrækkes TUNEL kanal til opnåelse TUNEL-positive signal (figur 2A, nederste række).

TUNEL mærkning her beskrevne fremgangsmåde er blevet anvendt til at kvantificere skeletmuskel celledød i en musemodel af SMA 10. TUNEL mærkning viser en stigning i antallet af apoptotiske profiler i benmusklerne fra 5 dage gamle SMA mus sammenlignet med kuld kontroller (figur 3A). Stigningen i apoptosekvantificerbar ved fremgangsmåden beskrevet ovenfor, hvilket indikerer statistisk signifikante forskelle i flere muskelgrupper (figur 3B).

Figur 1
Figur 1: Repræsentativ TUNEL mærkning af muse bagbenenes muskler. (A) TUNEL-mærket tværsnit af muse bagben viser tibialis anterior muskel, skinneben og hud. TA - tibialis anterior, FDL - flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Green - TUNEL, blå - kerner, rød - autofluorescerende signal. Stiplede linjer afgrænse muskelområder for kvantificering. Hud tilstødende bagbenenes muskler giver en intern positiv kontrol for TUNEL mærkning. Skala bar = 200 um. (B) Repræsentative stor forstørrelse billeder identificerer TUNEL-positive strukturer (grøn) i embryonale dag 13 mus skeletmuskel som apoptotiske kerner. Scale bar = 10 um. A og B modificeret fra Fayzullina og Martin 2014 10. (C) tværsnit af muse bagben TUNEL-mærket efter DNase-behandling for at tjene som en positiv kontrol. De fleste kerner har lyst TUNEL mærkning. Scale bar = 50 um. (D) tværsnit af samme mus bagben som vist i C (semi-tilstødende afsnit i C) TUNEL-mærket med TdT enzym udeladt for at tjene som en negativ kontrol. Der er ingen lys TUNEL-positive signal; den eneste grønne signal er autofluorescens som påvist ved colokalisering med signal i den røde kanal. Scale bar = 50 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

2 "FO: indhold-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2: Tissue autofluorescens skal behandles og udelukkes fra kvantificering, når man analyserer TUNEL mærkning. (A) mus bagben tværsnit med TUNEL mærkning og autofluorescens: originale billede (øverste række), samme billede med justerede tærskelværdier (midterste række), og samme billede med autofluorescens (rød) kanal trækkes (nederste række). Tærskling eliminerer mest røde blodlegemer og endotelceller autofluorescens men ikke farvningen artefakt (pilespids, midterste række). Kanal subtraktion eliminerer også farvning artefakt (pilespids, nederste række). Green - TUNEL, rød - autofluorescens, blå - kerner. Scale bar = 100 um. Grå rektangel skildrer område forstørret i B. (B) Højere forstørrelse billede af rød autofluorescens panel i A. Røde blodlegemer og nogle endotelceller (pile), og en Tissue farvning artefakt (pilespids) autofluoresce i både rød og grøn fluorescens filtre. Scale bar = 50 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3: TUNEL mærkning viser celledød i skeletmuskulatur af neonatale SMA mus Lavere bagbenenes muskler fra SMA mus ved postnatal dag 5 blev mærket af TUNEL metoden (A) TUNEL mærkning viser flere apoptotiske profiler på flere muskelgrupper i SMA mus.. muskel (højre) sammenlignet med kuld kontrol (venstre). Green - TUNEL, blå - Hoechst (kerner), rød - autofluorescens. Stiplede linjer afgrænse de muskelområder kvantificerede. TA - tibialis anterior, FDL - flexor graveitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Scale barer = 200 um. (B) TUNEL mærkning blev kvantificeret som total pixel areal på TUNEL signal normaliseret til total pixel areal af muskel. Middel ± standardafvigelser er vist, n = 4 - 5 mus. Statistisk signifikans mellem SMA og kontrol for hver muskel gruppe (en-halet t-test): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Dette tal er blevet ændret fra Fayzullina og Martin 2014 10. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En metode til at påvise og kvantitativt analysere DNA-beskadigelse-associeret apoptose i mus skeletmuskel er beskrevet. Proceduren omfatter væv høst, TUNEL farvning, billedoptagelse digitalt, og billedanalyse. Fælles histologiske leverancer og værktøjer er nødvendige, og en særlig kommerciel TUNEL kit er nødvendig. De væsentlige store udstyrsdele nødvendige er en kryostat, epifluorescerende mikroskop med digital billedbehandling kapacitet, og et computersystem til billedanalyse.

Forsøgslederen skal være opmærksom på potentielle faldgruber. Tissue autofluorescens er et stort problem i fluorescens billeddannelse. I unperfused dyr, vil resterende røde blodlegemer bidrage temmelig høj autofluorescerende signal. Endotelceller kan også betydeligt autofluorescerende. Derfor er det vigtigt at bekræfte, at autofluorescens ikke forveksles med TUNEL-positive signal. Denne vurdering udføres let ved at tage et billede i en kanal uden fluorophore, der skal anvendes til sammenligning og eventuel subtraktion fra TUNEL-positive kanal. På denne måde fluorescens-baserede TUNEL metode er overlegen i forhold til kolorimetriske brightfield mikroskopi metoder, der ikke giver en intern kontrol for baggrundsfarvning.

Vævsfiksering vil få væsentlig indvirkning på succes TUNEL mærkning. Det er bedst at minimere fiksering tid i paraformaldehyd, ikke overstige 24 timer. Embryonale og neonatal væv kræver fikseringstidspunkter betydeligt kortere end 24 timer.

Når TUNEL mærkning er vellykket, skal TUNEL-positive signal være meget højere end baggrund autofluorescens, således at signalet kan let isoleres ved intensitet tærskel gating anvendelse af billedanalyse-software. Antigen hentning bruger standard-protokol til opvarmning i citratbuffer 27,35 kan let forbedre lav TUNEL signal, hvis opvarmningstid holdes på et minimum (5 min), men denne forbehandling tids at reducere TUNEL signal, hvis opvarmning er forlænget i længere perioder (f.eks 20 min ved 95 ° C). Antigen hentning vil øge baggrund autofluorescens og falske positiver, og kan således ophæve eventuelle gevinster i signal-støj-forhold fra øget TUNEL signal.

Tunel signalmålinger skal normaliseres enten den samlede muskelområdet kvantificeret eller til antallet af kerner pr område kvantificeret. Fordi TUNEL måler apoptotiske kerner, vil den ideelle normalisering være total kerner. Men selv i relativt tynde (10 uM) muskel sektioner, de myofibre og kerner er så talrige og pakket så tæt, at det er umuligt at automatisk at tælle Hoechst-farvede kerner af tærsklingsparametre og partikelseparation algoritmer. Manuel optælling er også meget arbejdskrævende og unøjagtig. Den realistisk alternativ er at normalisere den samlede muskel-området.

TUNEL assay anvendes med passende vævsbehandlingteknikker og positive og negative kontroller, er en forholdsvis hurtig, reproducerbar, kvantitativ metode til påvisning af DNA-skader og celledød i væv. Det kan anvendes til at bekræfte apoptose som en patologisk mekanisme, til at identificere de berørte celletyper, og for at vurdere effektiviteten af ​​terapeutiske behandlinger. Denne procedure vil være af værdi for forskere inden for skeletmuskulatur sygdom og skade, herunder SMA, ALS, muskelsvind, toksin-induceret myopati, og motion fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

Fysiologi TUNEL fluorescens skeletmuskulatur DNA-skader billedanalyse histologi SMA motor neuron sygdom
Detektion og analyse af DNA-skader i Mouse Skeletmuskel<em&gt; In Situ</em&gt; Brug af TUNEL Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter