マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
マウスおよびヒト食道筋線維芽細胞は、酵素消化を介して生成されます。新生児（8-12日齢）マウス食道は、収穫みじん切り、洗浄し、そして25分間、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる酵素消化に供される。人間の食道切除標本は、固有筋層と外膜を剥奪され、残りの粘膜はミンチされ、最大6時間、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素消化にかけた。培養した細胞は、α-SMAおよびビメンチンを発現させ、全く弱いかデスミンを発現する。培養条件は、上皮、造血、または内皮細胞の成長に貢献しない。培養物の純度は、さらに潜在的な汚染造血および内皮細胞の細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー評価によって確認される。記載された技術は、簡単であり、非hematopoieitc、非内皮間質細胞の一貫した生成をもたらす。この技術の制限事項の使用に固有のものである分子生物学の研究で初代培養、 すなわち 、避けられないばらつきが異なるマウスまたはヒトを越えて確立の文化の中で発生しました。初代培養は、しかし細胞株に比べて、生体内の状態をより代表反映している。これらの方法はまた、群間の比較を可能にする、研究者に異なる臨床および実験条件からストロマ細胞を単離し、培養する能力を提供する。特徴付け食道間質細胞はまた、食道疾患における上皮 – 間質相互作用を調査する機能的研究に用いることができる。
Introduction
上皮-間質相互作用は、粘膜の再生、修復、線維症、および発癌1,2-含む胃腸管の様々な機能の調節に関与する。これらの相互作用は、最高の小腸および結腸において研究されており、同様に食道粘膜障害3において役割を果たし得る。腸および結腸の間質細胞と呼ばれる筋線維芽細胞の亜集団は、組織損傷、炎症の媒介に関与し、4,5を修復することが実証されている。遠位の胃腸管では、これらの紡錘形細胞が上皮及び固有層の間の界面での基底膜に隣接して配置されており、α-SMAおよびビメンチン陽性の、汎サイトケラチン陰性、及び弱陽性またはデスミン陰性5として定義される。
食道ストロマ厳密セルラーまたは分子レベルで特徴付けられていない。ネズミの食道における私たちの仕事は、デを持って扁平上皮6に時折下にある、食道間質におけるα-SMAおよびビメンチン細胞monstrated。上皮-間質相互作用は、そのような胃食道仲介傷害6と好酸球性食道炎3として食道粘膜障害に関係している。線維性狭窄はまた、胃腸線維症の病因に関与していた食道の傷害および間質細胞の既知の合併症である。これらの細胞の単離は、錯乱シグナル伝達経路を調査するために必要な研究を達成するのに役立ちます。
この投稿は、これらの相互作用を媒介するシグナル伝達経路に関する知識の既存のギャップに対処することができるように、α-SMA陽性の、ビメンチン陽性の筋線維芽細胞の初代培養を確立するために必要な技術を提供する。記載された技術が正常初代マウス結腸筋線維芽細胞7及びfurtheを確立するために、著者らによって使用されているRは、マウス6と人間の筋線維芽細胞のような食道間質細胞の確立のために適合した。
】ここで我々は、将来の機能研究に使用する前に、マウスまたはヒト食道から確立これらの培養を確立し、特徴づけるために必要な条件について説明します。培養物を増殖させ、最大で15継代のために利用することができる。以下に概説する方法を経由して一次培養物の単離と確立は、筋線維芽細胞表現型を有する間質細胞を生成します。 、正のビメンチン-SMA、α、およびデスミン弱陽性または陰性、及びサイトケラチン陰性であった。この表現型は3負または粘膜筋板6のα-SMA陽性の、ビメンチン陰性表現型α-SMA、主にビメンチン陽性である食道線維芽細胞の表現型とは区別される。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織のサイズに適合さミンチ消化時間で、マウスまたはヒト組織を使用するときに初代培養生成のための技術は、一般的に類似している。マウス組織での経験は、上記の方法を使用して一貫して一次培養物の確立に成功をもたらすことを示唆している。プロトコル内の重要なステップは、手術器具の滅菌を含む組織培養の標準的な滅菌技術に従って。マウスの年齢も重要なステップです。 8?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
References
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