Summary

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Published: January 18, 2015
doi:

Summary

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Abstract

Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all'uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell'uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.

Introduction

Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi 1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea 3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l'infiammazione e la riparazione di 4,5. Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basale all'interfaccia tra l'epitelio e lamina propria e sono definiti come α-SMA e vimentina positivo, pan-citocheratina negative, e debolmente positivo o negativo desmina 5.

Lo stroma esofagea non è stato rigorosamente caratterizzato a livello cellulare o molecolare. Il nostro lavoro in esofago murino ha demonstrated α-SMA cellule e vimentina nello stroma esofageo, di tanto in tanto soggiacenti alla epitelio squamoso 6. Interazioni epiteliali-stromale sono stati implicati in alterazioni della mucosa esofagea quali gastro-esofageo danno mediato 6 e esofagite eosinofila 3. Stenosi fibrotiche sono anche una complicanza nota di cellule stromali e lesioni esofagee sono stati implicati nella patogenesi della fibrosi gastrointestinale. L'isolamento di queste cellule aiuterà compiere gli studi necessari per indagare vie di segnalazione squilibrati.

Questa presentazione fornisce le tecniche necessarie per stabilire colture primarie di α-SMA positive, miofibroblasti positivi vimentina tale che le lacune esistenti nella conoscenza per quanto riguarda le vie di segnalazione che mediano queste interazioni possono essere affrontati. La tecnica descritta è stata utilizzata con successo dagli autori per stabilire miofibroblasti primari murini colon 7 e further adattato per l'istituzione di murine 6 e cellule stromali esofagee miofibroblasti come umani.

Qui descriviamo le condizioni necessarie per realizzare e caratterizzare queste culture stabilite dal mouse o esofago umano prima dell'uso in studi funzionali futuri. Le culture possono essere coltivate e utilizzate fino a 15 passaggi. Isolamento e la creazione di colture primarie tramite le modalità descritte di seguito genera cellule stromali con fenotipo miofibroblasti; α-SMA, vimentina positivo, e debolmente positivo o negativo per la desmina, e citocheratina negativo. Questo fenotipo è distinto dal fenotipo del fibroblasto esofageo che è prevalentemente vimentina positivo, α-SMA negative 3 o α-SMA positive, vimentina fenotipo negativo della muscolaris mucosae 6.

Protocol

Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee. Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board. 1. Ottenere Mouse o Esofago umano Ottenere …

Representative Results

Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l'intera…

Discussion

Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L'età dei topi è anche un passaggio cr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors have nothing to disclose.

Materials

Name
Tissue culture reagents
HBSS  Sigma Aldrich H6648
dispase  GIBCO, Invitrogen  17105-041
collagenase XI  Sigma-Aldrich  C9407 
DMEM  GIBCO, Invitrogen  11965-092
sorbitol  Sigma-Aldrich S1876
FBS Sigma) F42442
transferrin  Roche 10-652-202-001
trypsin/EDTA  Corning 25-052-Cl
epidermal growth factor  Sigma-Aldrich E9644
trypsin/EDTA  Corning  25-052-Cl
Reagents for immunostaining
goat serum Sigma Aldrich G9023
Mouse mAB to α-SMA  abcam ab7817
Rabbit pAB to vimentin  abcam ab45939
Cy2 conjugated Goat anti Rabbit  Jackson ImmunoResearch 111-225-144
DAPI  sigma-aldrich D8417
CD31 conjugated to eFluor 450  ebiosciences 48-0319-410
CD90 conjugated to APC  ebiosciences  17-0909-41 
Annexin V and 7AAD  BD Pharmigen 559763
mouse Fc block for CD16/CD32  BD Pharmigen 2136662
Equipment
5 ml tube  eppendorf 30108310
Motic AE31 inverted microscope Motic AE31 inverted microscope Motic AE31 inverted microscope
Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators
4-well chamber slides  Thermo Scientific 177437
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf Centrifuge 5810R
Olympus Vacuum-Driven Filter System  Genesee Scientific  25-227
Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope  Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) 
6 well plates  Corning 3516
T25 Flasks  TRP  90026
T75 Flasks  Corning 43064
Dissection Scissors Dissection Scissors Dissection Scissors
Dissection Forceps Dissection Forceps Dissection Forceps
Single Tipped Q-Tips  Kendall 540500
T75 Flasks Corning 43064
Software
Metamorph software (Molecular Devices) Molecular Devices
FACSCAlibur  BD Bioscience 
FACSVerse BD Bioscience

References

  1. Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
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  9. Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
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Cite This Article
Gargus, M., Niu, C., Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215, doi:10.3791/52215 (2015).

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