Abstract
Hier beschrijven we een werkwijze voor de constructie van een eenmalig gebruik "injectrode" met behulp van commercieel toegankelijk en betaalbaar parts. Een indringende systeem ontwikkeld dat het mogelijk maakt voor de injectie van een geneesmiddel bij het opnemen elektrofysiologische signalen van de getroffen neuronale populatie. Deze werkwijze is eenvoudig en economisch alternatief voor commerciële oplossingen. Een glazen pipet werd gemodificeerd door het te combineren met een injectienaald en een zilveren filament. De injectrode wordt aan commerciële micro-pomp voor drug delivery bevestigd. Dit resulteert in een techniek die real-time farmacodynamiek feedback verschaft door middel van multi-unit extracellulaire signalen afkomstig van de plaats van geneesmiddelafgifte. Als een proof of concept, namen we de neuronale activiteit van de superieure colliculus uitgelokt door lichtflitsen bij ratten, gelijktijdig met de levering van geneesmiddelen door de injectrode. De injectrode opnamecapaciteit maakt de functionele karakterisering van de injectie website ten gunste van nauwkeurige controle over de lokalisatie van drug delivery. De toepassing van deze werkwijze zich ook veel verder gaat dan hier getoond, de keuze van de chemische stof in het injectrode geladen is groot, onder tracering merkers voor anatomische experimenten.
Introduction
De inactivatie van corticale gebieden en subcorticale kernen van belang bij de studie van functionele relaties tussen verschillende hersenstructuren 2-4. Recente literatuur loss-of-function chemische of cryogene technieken toegepast om de rol van hersenstructuren 2,5 bestuderen. Met betrekking tot farmacologische micro-injecties kunnen kleine hoeveelheden geneesmiddelen worden toegediend in een gebied van de hersenen met een geregelde snelheid tegelijk de bijkomende schade aan het omringende weefsel 6,7. Deze techniek kan worden gebruikt om specifieke agonisten, inverse agonisten of antagonisten te leveren aan het effect van verschillende farmacologische doelwitten op neuronale -activiteit. Dergelijke effecten kunnen ook worden bestudeerd door het meten van veranderingen in neuronale reacties van verafgelegen plaatsen, waardoor onderzoekers om de relatie tussen verschillende corticale en subcorticale structuren bestuderen.
Hier tonen we het samenstel van een inrichting, het injectrode, staat both opnemen elektrofysiologische signalen en leveren geringe hoeveelheden geneesmiddelen op de doellocatie. We tonen de mogelijkheden van dit systeem door het injecteren GABA, een gemeenschappelijke remmer van neuronale activiteit in de rat superior colliculus. Deze regio is gevoelig voor visuele stimulatie, die ons toeliet om visueel opgeroepen multiunit activiteit gebruiken om injectrode lokalisatie bevestigen. De omkeerbaarheid van de inactivatie werd beoordeeld door het herstel van de normale neuronale activiteit na het einde van GABA injectie.
De bewakingsmogelijkheden meerdere eenheden activiteit van de injectieplaats maakt fijnafstemming van de injectiesnelheden en volumes nodig gewenste farmacodynamische respons. Daarom is een voordeel van deze techniek is het mogelijk beperking van de weefselbeschadiging veroorzaakt door microperfusion, aangezien de kleinste effectieve hoeveelheden geïnjecteerd. De voorgestelde protocol biedt een kostenefficiënte methode voor het genereren van de wegwerp hardware necessary voor het uitvoeren van experimenten waarbij geneesmiddelafgifte en lokale neuronale activiteit opname gewenst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad voor de Bescherming van Dieren en de ethische review board van de Université de Montréal.
1. Vergadering van de opname-injectie Pipette
- Trek een ongeveer 7 cm lange glazen capillair (1 mm buitendiameter) met een pipet trekker.
- Breek het topje van de capillaire en controleer de opening onder een lichtmicroscoop. Controleer of de inwendige diameter tussen 30 urn tot 40 urn.
- Plaats een 7 cm lange zilveren draad in het glazen capillair met ongeveer 1 cm uitsteekt uit de niet-tapse uiteinde van de glazen pipet.
- Buig de overtollige filament loodrecht op het glas capillair.
- Breng een druppel van flexibele kunststof lijm op de as van een 30 G injectienaald.
- Plaats een 30 G hypodermische naald in de glazen pipet volgens het schema in figuur 1
- Voeg een tweede coating van lijm om een goede afdichting van de verbinding tussen de glazen pipet en de injectienaald waarborgen.
- Laat de pipet drogen met de punt naar boven gedurende ongeveer 12 uur tot goede uitharding van de lijm te garanderen. Het uiteindelijke resultaat wordt getoond in figuur 2.
Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd op acute experimenten en sterilisatie van de pipetpunt is niet vereist.
2. Animal Voorbereiding
- Plaats de rat in een anesthesie doos.
- Veroorzaken anesthesie via 4% isofluraan gedurende 5-10 min.
- Leg het dier op een stereotaxische tafel met verwarmingselement en rectale sonde naar een lichaamstemperatuur van 37 ° C te handhaven. Gebruik een neuskegel aan anesthesie met 2% isofluraan te behouden. Bevestig het hoofd van de rat met behulp van oor bars en tanden houder.
- Breng oogzalf of oogdruppels, waarvan 1% Atropine daalt om te helpen bij pupilverwijding bevatten. Om uitdroging te vermijden, dien smeren druppelis ongeveer elke 30 minuten.
- Scheer het hoofd en reinig deze met 10% povidonjood.
- Voor plaatselijke verdoving, injecteer 0,5 ml van 2% lidocaïne onder de hoofdhuid 2-3 plaatsen verheffende de huid en de tip van de naald.
- Bevestig adequaat niveau van anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen en het observeren van het gebrek aan beweging. Bovendien bewaken de hartslag zodat het binnen normale waarden (300 tot 400 slagen / min).
- Incise de hoofdhuid in een rechte lijn langs het gemiddelde met een # 10 scalpel zowel de coronale en sagittale hechtingen bloot.
- Onthul de Lambda en Bregma punten door op vernietiging van het weefsel dat bedekt de schedel met een chirurgische spatel.
- Niveau de schedel, zodat Bregma en Lambda posities zijn op hetzelfde vlak.
- Om het referentiepunt te stellen, gebruik dan een stereotaxische apparaat met een gemonteerde glazen buis in te stellen recht boven Bregma. Dit zal de "nul" voor de antero-posterior en medial-laterale metingen coördinaten.
- Stel het punt van belang door het verplaatsen van de stereotaxisch monteren om de gewenste coördinaten, let op de stereotaxische coördinaten en trek een vierkant rond het doelgebied die markeert waar de craniotomie zal worden uitgevoerd.
- Gebruik een chirurgische boor met een gesteriliseerde boor langs de gemarkeerde plein langzaam zonder druk om langzaam te verwijderen de botmateriaal. Wees voorzichtig te lang in hetzelfde gebied niet te boren, omdat warmte produceert en veroorzaken laesies op de cortex.
- Wanneer het bot afgrenzing van de craniotomie voldoende dun is geworden, verwijder voorzichtig de craniale deel met een pincet om de cortex bloot.
- Vaak irrigeren de blootgestelde cortex met kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel uitdroging te voorkomen.
OPMERKING: Dura mater verwijderen behoeft de rat de punt van de injectrode stevig genoeg te dringen.
3. Vullen en Plaatsing van het injectiesysteem
- Vul het5-10 ul injectiespuit door aspiratie met minerale olie.
- Vul de injectienaald met de vaste glazen pipet met een oplossing van 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) en 300 uM γ-aminoboterzuur (GABA) of een oplossing van 2% lidocaïne met 0,5% CSB 9. Verdun alle oplossingen met een zoutoplossing.
- Bij een overvloedige stof vullen met een gewone injectiespuit en met de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen technieken om de vorming van luchtbellen te vermijden.
- Bij duurdere stoffen, gebruik van minerale olie aan de injectrode vullen en het chemische middel kan vervolgens door afzuigen worden ingevoerd. Aangezien het dichtheidsverschil tussen minerale olie en water relatief hoog, deze stof is een goede kandidaat voor het injecteren van waterige oplossingen.
Opmerking: Een kleurstof kan worden toegevoegd om de scheiding tussen beide vloeistoffen te bevestigen.
- Om de injectie pipet te vullen, vul een 1 ml spuit met de oplossing door aspiratie en dan langzaam injecteren van de oplossingin de injectiepipet.
- Besteed zorgvuldige aandacht voor lekken in de regio's in figuur 1 aangegeven door zwabberen deze gebieden schoon en het observeren van lekkages door verdere injecteren van de oplossing langzaam met de spuit.
- Verwijder de spuit 1 ml. Wanneer u dit doet, moet u lichte druk houden op de plunjer, zodat het vacuüm niet de oplossing van de injectie pipet verwijderen.
- Vul de injectiespuit met minerale olie door aspiratie en bevestig deze stevig aan de gevulde injectie pipet, dan voorzichtig weg te vegen alle overtollige oplossing uit de verzamelde injectrode met gaas.
- Controleer of de punt niet wordt geblokkeerd door injectie van een zeer klein volume, voldoende om een druppeltje vormt aan het uiteinde van de glazen pipet zien.
- Monteer de injectrode op de micropomp systeem en ervoor zorgen dat het goed is bevestigd.
- Positie voorzichtig injectrode tip op het doel coördinaten en laat de punt aan het oppervlak van de cortex.
- Langzaam de injectrode met de stereotaxische inrichting de beoogde structuur (superior colliculus in dit geval) met de juiste anatomische coördinaten.
- Bedek de blootgestelde cortex met warme agar om weefsel uitdroging te voorkomen.
4. Injectie en omkeerbare inactivatie
- Stel de micro-injectie pomp te injecteren 400 tot 800 nl 40 nl / min en druk op Uitvoeren om de injectie te starten. Merk op dat de piek tarief zal verminderen tijdens de injectie te tonen.
Opmerking: In de experimentele opstelling, neurale activiteit herstelde binnen een uur na het einde van GABA levering. Elk gekalibreerd mechanische inrichting kan worden gebruikt om druk uit te oefenen op de micro-injectie spuit om de injectie te voeren. - Na de overname van de elektrofysiologische gegevens, euthanaseren met een door de lokale Animal Ethics Gemeenschap erkende methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De constructie van de injectrode is weergegeven in figuur 1. A silver wire (C) wordt toegevoerd aan een glazen pipet (D) met een gedeelte van de draad gebogen en buiten uitsteekt uit de opening. Een 30 G naald (B) is bevestigd en afgedicht aan de opening van de glazen pipet met lijm. Nadat de pipet werd gevuld met de substantie injectie, wordt een glazen micro injectiespuit (A) aan de naald. Het is belangrijk dat er een goede afdichting wanneer de micro injectiespuit verbindt met de naald (E) en waarbij de zilverdraad uitsteekt uit de glazen pipet (F). Figuur 2 toont een foto van wat de injectrode lijkt na voltooiing van de montage.
Visueel opgewekte meervoudige activiteit werden verkregen in de superieure colliculus na een 300 msec knipperen om de contralaterale oog als weergegeven in figuur 3. Na de injectie van GABA, spiking activiteit in reactie op een stimulus flash onderdrukt. visueelopgeroepen multiunit activiteit meestal terug tussen de 45 tot 60 minuten na de injectie heeft opgehouden.
Figuur 4 illustreert de inrichting van de micro-injectie systeem. De injectiepomp controller kan de gebruiker de instellingen voor injectie. Een veer elektrische connector verbindt de zilveren draad die uitsteekt uit de glazen pipet. De connector leidt tot een hoofd podium met de grond en referentie-elektroden en vervolgens aangesloten op een versterker. Een analoog / digitaal (A / D) interface wordt gebruikt om de elektrofysiologische data verwerven en een luidspreker wordt gebruikt voor aanvullende audio monitoring van neuronale activiteit.
Figuur 1. Schematische weergave van de injectrode samenstel A micro spuit (A) aan de opname-injectiepipet die bestaan uit een 30 G h gehechtypodermic naald (B) gehecht aan een zilverdraad (C) in een glazen pipet (D). Regio omcirkeld (E - F) hoogtepunt gebieden die gevoelig zijn voor lekken kunnen zijn.
Figuur 2: Een foto van de geconstrueerde pipet met behulp van een 30 G naald (B), waterdichte lijm (F), een zilveren draad (C) en een glazen pipet (D).
Figuur 3: Een illustratie van het remmende effect van de injectie van GABA (300 uM) op visueel opgewekte multi-eenheid activiteit in de superieure colliculus, pijlen geven flash onset. Elektrischal signalen werden gefilterd met een banddoorlaatfilter ligt tussen 30 en 3000 Hz.
Figuur 4: Schematische weergave van de totale micro-injectiesysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De voorgestelde protocol werd ontworpen om de uitdagingen als gevolg van de huidige omkeerbare inactivatie methoden op te lossen. Specifiek, dit project gericht op het verfijnen van de gebruikte chemische micro-injecties van stoffen moduleren neurale activiteit, vooral in diepe hersenstructuren methoden. Een technische uitdaging die uit dit type opstelling is dat beide probes wordt colocalized in dezelfde beperkte ruimte in vivo teneinde nauwkeurige opnames leiden op de injectieplaats. Dit probleem kan worden overwonnen door gebruik inrichtingen, zoals de hier gepresenteerde, die in staat zijn spuiten en opname op dezelfde plaats zijn. Alternatieve methoden omvatten het gebruik van apparaten op basis van gasdruk pulsen. Dergelijke hulpmiddelen zijn al vele jaren verkrijgbaar, maar het gebruik van een samendrukbaar tussenproduct reduceert de controle injectiesnelheden en volumes, twee parameters die belangrijk besturen om reversibel te verzekeren zijn. Andere werkwijzen zoals iontoforetische injectie systems zijn ook beschikbaar, maar de diffusie dynamica van de vloeistof verschillende versus bolusinjectie, waardoor het potentiële bereik van inactivering. Deze werkwijzen hebben het voordeel van het hebben van een bolvormig diffusiepatroon tegenstelling tot de elliptische patroon dat voor micro-injecties 7. Derhalve moet de keuze van de inactivatiewerkwijze gepland volgens het doelgebied en proefopzet. Hoewel commerciële alternatieven bestaan, het voorgestelde protocol verschaft een kostenefficiënte wijze bewaken de farmaceutische levering stof evenals waardoor een hoge mate van voorbeeld. Zulke vrijheid in de crafting van de injectie-inrichting is voorstander van een groot scala aan experimentele flexibiliteit en tuning voor de specifieke toepassing contexten.
Met betrekking tot het voorgestelde protocol, de kritische stap is het proces van het vullen van de glazen pipet. Luchtbellen moeten worden vermeden, zoals luchtcompressie de monitoring van geïnjecteerd zal makenvolumes hardnekkige. Een minimale weerstand moet worden gevoeld bij het handmatig duwen vloeistof door de pipet bevestigde vrije stroming in het systeem. Afwezigheid van vloeistof met handmatige injectie kan een lek in het systeem of onjuiste pipet preparaat resulteert in een gehinderd tip geven. De impedantie van de pipet moet worden gemeten om de gewenste elektrofysiologische registratie verkrijgen (LFP, evoked potentials, meerdere eenheden activiteit, etc.), als grotere tips maten resulteert in lagere impedanties.
Als de injectie succesvol is, een volume van 400 tot 800 nl van 300 pM GABA oplossingen of 2% lidocaïne-oplossing voldoende te heffen spiking activiteit. Om een idee van de injectie te verspreiden in ruimte en tijd, kan agar worden gesimuleerd zenuwweefsel. De verspreiding van de injectie kan dan gemakkelijk worden waargenomen met een CSB oplossing. Na simulaties, is het essentieel om injectie histologisch verspreiden gekenmerkt door het gebruik of kleurstoffen zoals CSB, door middel van autoradiografie met radioactief gemerkt drugs of met behulp van metabolische benaderingen zoals glucose autoradiografie indirecte proxies om de activering of inactivatie van neurale activiteit 1 meten.
Het is ook belangrijk op te merken dat snel injecties (≥100 nl / min) zal waarschijnlijk resulteren in letsels maken volledige omkeerbaarheid onbereikbaar. Een groot voordeel van de voorgestelde protocol is de mogelijke integratie van de injectiesysteem met software die zouden feedback-controle van de injectiesnelheid voor een bepaalde neuronale activiteit. Een dergelijke implementatie zou kunnen onderzoekers concentreren op de inactivering (of activatie) parameters dan op technische parameters zoals injectiesnelheden of volumes en levert alleen de juiste hoeveelheid geneesmiddel voor de beschouwde toepassing. Dit zou probe verplaatsing te minimaliseren door het optimaliseren van de benodigde drug volume, zorgen voor meer tijd-gevoelige controle van de drug delivery, gunst reproduceerbaarheid en alow direct-gepaarde vergelijking van gegevens.
Deze techniek combineert een systeem voor stof aflevering en registratie van elektrofysiologische signalen. We toonden de werkzaamheid ervan met behulp van de opnamecapaciteit van onze pipet om functioneel te lokaliseren de superieure colliculus door het induceren van treinen van multi-unit-activiteit met behulp van flash stimuli 11. Tijdens inactivatie, multi-unit activiteit afgenomen en geleidelijk hersteld na de injectie te compenseren. Reversible inactiveringstechnieken, zoals de hier gepresenteerde bieden belangrijke voordelen tegenover mechanische of chemische laesies technieken die afwezig of slecht 3 terugwinning verschaffen. Omkeerbare inactiveringstechnieken versterken van de statistische significantie van experimenten sinds gepaarde vergelijkingen mogelijk 3, zodat er geen individuele verschillen. We hebben een kostenefficiënte en aanpasbare techniek die precieze controle mogelijk maakt over de duur van de afgifte van een substantie en de robuuste ontwikkeldesonderen van een doel cerebrale gebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
