Abstract
نحن هنا تصف طريقة لبناء واحدة في استخدام "injectrode" باستخدام الأجزاء التي يمكن الوصول تجاريا وبأسعار معقولة. وتم تطوير نظام التحقيق الذي يسمح لحقن المخدرات في حين تم تسجيل الإشارات الكهربية من السكان الخلايا العصبية المتضررة. وهذه الطريقة توفر بديلا بسيط واقتصادي للحلول التجارية. تم تعديل ماصة الزجاج عن طريق الجمع بين ذلك مع إبرة تحت الجلد وخيوط الفضة. يتم إرفاق injectrode إلى مضخة محقنة مكروية تجارية لتسليم المخدرات. هذه النتائج في الاسلوب الذي يوفر في الوقت الحقيقي الدوائية ردود الفعل من خلال وحدة متعددة إشارات الخلية التي تنشأ من موقع تسليم المخدرات. كدليل على المفهوم، سجلنا نشاط الخلايا العصبية من أكيمة متفوقة التي تسببها ومضات من الضوء في الفئران، بالتزامن مع تسليم المخدرات من خلال injectrode. وتسمح القدرة على تسجيل injectrode توصيف وظيفي للينجموقع ection صالح مراقبة دقيقة على توطين إيصال الدواء. تطبيق هذه الطريقة يتجاوز كثيرا ما يتجلى هنا، حيث أن اختيار مادة كيميائية تحميلها في injectrode واسعة، بما في ذلك تتبع علامات للتجارب التشريحية.
Introduction
وتثبيط المناطق القشرية ونوى شبه القشرية مهم في دراسة العلاقات الوظيفية بين الهياكل الدماغ المختلفة 2-4. وقد استخدمت الأدبيات الحديثة الخسارة من وظيفة كيميائية أو تقنيات المبردة لدراسة دور هياكل الدماغ 2،5. فيما يتعلق إبر دقيقة جدا الدوائية، يمكن أن تدار كميات صغيرة من المخدرات إلى منطقة الدماغ بمعدل تسيطر عليها مع التقليل من الأضرار الجانبية إلى 6،7 الأنسجة المحيطة بها. هذه التقنية يمكن استخدامها لتقديم منبهات محددة، منبهات عكسية أو الخصوم لدراسة تأثير أهداف الدوائية المختلفة على نشاط الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن هذه الآثار دراستها عن طريق قياس التغيرات في الاستجابات العصبية من أماكن بعيدة، مما يسمح للباحثين لدراسة العلاقات بين مختلف الهياكل القشرية وتحت القشرية.
هنا، علينا أن نظهر تجميع جهاز، وinjectrode، قادرة على بوعشر تسجيل الإشارات الكهربية وتقديم كميات صغيرة من المخدرات في الموقع المستهدف. علينا أن نظهر قدرات هذا النظام عن طريق حقن GABA، مثبط مشترك من نشاط الخلايا العصبية في الفئران أكيمة متفوقة. هذه المنطقة حساسة للالتحفيز البصري، مما أتاح لنا استخدام أثار بصريا النشاط المتعددة الوحدات لتأكيد injectrode الترجمة. وجرى تقييم حالة العكس من التعطيل من خلال استرداد نشاط الخلايا العصبية العادية بعد انتهاء الحقن GABA.
القدرة على مراقبة نشاط وحدة متعددة من موقع الحقن يسمح لضبط معدلات الحقن والكميات اللازمة لتحقيق الاستجابة الدوائية المرجوة. ومن هنا، فإن الاستفادة من هذه التقنية هو إمكانية الحد من تلف الأنسجة التي تسببها تروية دقيقة، حيث يتم حقن كميات أصغر فعالة. وينص البروتوكول المقترح وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد لزم الامر الأجهزة المتاحY لإجراء التجارب حيث هو المطلوب تسليم المخدرات وتسجيل نشاط الخلايا العصبية المحلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيهات المجلس الكندي لحماية الحيوانات واستعراض مجلس أخلاقيات جامعة مونتريال: ملاحظة.
1. جمعية ماصة تسجيل حقن
- سحب على الزجاج الشعرية حوالي 7 سم (1 مم القطر الخارجي) باستخدام مجتذب ماصة.
- كسر غيض من الشعرية والتحقق من فتحة تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن القطر الداخلي بين 30 ميكرون إلى 40 ميكرون.
- اضافة الى وجود 7 سم سلك الفضة طويلة في الزجاج الشعرية مع ما يقرب من 1 سم جاحظ من نهاية غير مدبب من ماصة الزجاج.
- ثني خيوط الزائد متعامد على الزجاج الشعرية.
- تطبيق قطرة من مرونة لاصقة من البلاستيك على رمح من إبرة تحت الجلد 30 G.
- ادخال ابرة تحت الجلد 30 G في ماصة الزجاج وفقا لالخطط المعروضة في الشكل 1
- إضافة طبقة ثانية من الغراء لضمان ختم الصحيح من تقاطع بين ماصة الزجاج وإبرة تحت الجلد.
- ترك ماصة لتجف مع طرف تواجه التصاعدي لنحو 12 ساعة لضمان علاج مناسب من الغراء. تظهر النتيجة النهائية في الشكل 2.
ملاحظة: يتم هذا الإجراء على التجارب الحادة والتعقيم من طرف ماصة غير مطلوب.
2. إعداد الحيوان
- وضع الفئران في مربع التخدير.
- حمل التخدير باستخدام 4٪ الأيزوفلورين لمدة 5 إلى 10 دقيقة.
- وضع الحيوان على طاولة التجسيمي مع سادة التدفئة والتحقيق المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية. استخدام مخروط الأنف للحفاظ على التخدير مع 2٪ الأيزوفلورين. تأمين رأس فأر باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
- تطبيق العيون مرهم أو قطرة العين، والتي تشمل 1٪ الأتروبين قطرات للمساعدة في اتساع حدقة العين. لمنع جفاف، وتطبيق التشحيم قطرةق تقريبا كل 30 دقيقة.
- حلق الرأس وتنظيفه مع 10٪ بوفيدون اليود.
- لتخدير موضعي، حقن 0.5 مل من 2٪ ليدوكائين تحت فروة الرأس في 2-3 المواقع من خلال رفع البشرة وإدخال رأس الإبرة.
- تأكيد مستوى كاف من التخدير عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميها، ومراعاة قلة الحركة. بالإضافة إلى ذلك، رصد معدل ضربات القلب لضمان وجوده ضمن القيم الطبيعية (300-400 نبضة / دقيقة).
- شق فروة الرأس في خط مستقيم على طول المتوسط مع # شفرة 10 مشرط لفضح كل من الغرز الاكليلية والسهمي.
- الكشف عن لامبدا وBregma نقاط عن طريق دفع جانبا الأنسجة التي تغطي الجمجمة مع ملعقة الجراحية.
- مستوى الجمجمة بحيث Bregma وامدا مواقع على نفس الطائرة.
- لتعيين نقطة مرجعية، استخدام جهاز التجسيمي مع أنبوب زجاجي لنصرة تعيينها الحق فوق Bregma. وستكون هذه هي "صفر" لل-انتيرو الخلفي وميدتنسق القياسات الاتحاد العالمي للتعليم الأطراف.
- تعيين نقطة من الفائدة عن طريق تحريك التجسيمي جبل لالإحداثيات المطلوبة، لاحظ الإحداثيات التجسيمي ورسم مربع حول المنطقة المستهدفة الذي يصادف حيث سيتم إجراء حج القحف.
- استخدام الحفر الجراحية مع تدريبات تعقيمها على طول ساحة ملحوظ ببطء من دون ضغوط لإزالة ببطء المواد العظام. يجب الحرص على عدم حفر وقتا طويلا في نفس المنطقة، كما أنه سيتم إنتاج الحرارة ويسبب تقرحات على القشرة.
- عندما العظام ترسيم حج القحف قد تصبح رقيقة بما فيه الكفاية، وإزالة بعناية القسم الجمجمة مع ملاقط لفضح القشرة.
- ري في كثير من الأحيان القشرة يتعرض مع الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي لمنع جفاف الأنسجة.
ملاحظة: إزالة جافية غير ضرورية على الفئران كما غيض من injectrode هو قوي بما فيه الكفاية لاختراق.
3. التعبئة و تركيب نظام حقن
- ملء5-10 ميكرولتر محقنة مكروية بواسطة الشفط مع الزيوت المعدنية.
- شغل الإبرة تحت الجلد مع ماصة زجاجية ثابتة بمحلول مكون من 0.5٪ شيكاغو السماء الزرقاء (ديوان الخدمة المدنية) و 300 ميكرومتر-γ الغاما حمض (GABA) أو محلول 2٪ ليدوكائين مع 0.5٪ ديوان الخدمة المدنية 9. تمييع كل الحلول بمحلول ملحي.
- في حالة وجود مادة وفيرة، وملء باستخدام حقنة العادية واستخدام التقنيات الوقائية المعتادة لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- في حالة المواد أكثر تكلفة، واستخدام الزيوت المعدنية لملء injectrode ويمكن بعد ذلك قدم وكيل الكيميائي بواسطة الطموح. كما الفرق بين كثافة الزيوت المعدنية والمياه مرتفع نسبيا، وهذا الجوهر هو مرشح جيد لحقن المحاليل المائية.
ملاحظة: يمكن إضافة صبغة لتأكيد الفصل بين كل من السوائل.
- لملء ماصة الحقن، وملء حقنة 1 مل مع الحل بواسطة الشفط ثم حقن ببطء الحلفي ماصة الحقن.
- إيلاء اهتمام دقيق للكشف عن التسربات في المناطق المشار إليها في الشكل رقم 1 عن طريق المسح هذه المناطق نظيفة ومراقبة التسرب عن طريق زيادة ضخ المحلول ببطء مع الحقنة.
- إزالة حقنة 1 مل. عند القيام بذلك، تأكد للحفاظ على الضغط الخفيف على المكبس ذلك أن الفراغ لا يزيل الحل من ماصة الحقن.
- ملء محقنة مكروية مع الزيوت المعدنية بواسطة الطموح ونعلق عليه بقوة لحقن ماصة شغلها، ثم يمسح بعناية بعيدا أي حل الزائدة من injectrode تجميعها مع الشاش.
- تحقق من أن طرف لا يتم حظر عن طريق حقن كمية صغيرة جدا، يكفي أن نرى قطرة صغيرة في تشكيل غيض من ماصة الزجاج.
- تحميل injectrode على النظام MICROPUMP وتأكد من أنه ثابتة بشكل جيد.
- وضع بعناية غيض injectrode في إحداثيات الهدف وخفض تلميح إلى سطح القشرة.
- انخفاض ببطء injectrقصيدة باستخدام جهاز التجسيمي إلى هيكل الهدف (أكيمة متفوقة في هذه الحالة) باستخدام إحداثيات التشريحية المناسبة.
- تغطية قشرة يتعرض مع أجار الدافئ لمنع جفاف الأنسجة.
4. حقن والتعطيل عكوس
- ضبط مضخة microinjection لحقن 400-800 NL في 40 نيكولا لانغ / دقيقة، ثم اضغط تشغيل لبدء الحقن. ملاحظة أن معدل ارتفاع تظهر لحد من خلال الحقن.
ملاحظة: في الإعداد التجريبية، تعافى النشاط العصبي في غضون ساعة بعد انتهاء تسليم GABA. أي جهاز ميكانيكي معايرة يمكن استخدامها للضغط على حقنة microinjection من أجل إجراء الحقن. - بعد الحصول على البيانات الكهربية، الموت ببطء باستخدام أسلوب معتمد من قبل الحيوان أخلاقيات المجتمع المحلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح بناء injectrode في الشكل 1. الأسلاك الفضية (C) تغذي ماصة الزجاج (D) مع جزء من عازمة الأسلاك وجاحظ الخروج من الافتتاح. وترد إبرة 30 G (B) ومختومة إلى افتتاح ماصة الزجاج مع الغراء. بعد أن تم شغلها ماصة مع مادة الحقن، ويتم إرفاق حقنة الزجاج الصغيرة (A) إلى الإبرة. فمن المهم أن هناك ختم جيدة حيث يربط حقنة صغيرة مع إبرة (E) وحيث سلك الفضة يبرز من ماصة الزجاج (F). يبين الشكل 2 صورة ما تبدو مثل injectrode بعد الانتهاء من التجمع.
تم الحصول عليها أثار بصريا النشاط المتعددة الوحدات في أكيمة متفوقة بعد 300 مللي ثانية فلاش للعين المقابل كما هو موضح في الشكل (3). وعند حقن GABA، ارتفاعه النشاط استجابة لحافز فلاش تم قمعها. بصرياأثار النشاط المتعددة الوحدات عاد عادة بين 45-60 دقيقة بعد توقف الحقن.
ويوضح الشكل (4) والإعداد لنظام microinjection. وحدة تحكم مضخة حقن يسمح للمستخدم لتحديد إعدادات للحقن. A موصل كهربائي الربيع يربط السلك الفضي الذي يبرز من ماصة الزجاج. الموصل يؤدي إلى مرحلة الرأس مع أقطاب الأرض، وإشارة وثم توصيله إلى مكبر للصوت. يتم استخدام التناظرية / الرقمية (A / D) واجهة للحصول على بيانات الكهربية، ويستخدم اللغة لرصد الصوت مكمل للنشاط الخلايا العصبية.
ويرد التمثيل التخطيطي للجمعية injectrode A حقنة صغيرة (A) إلى ماصة تسجيل الحقن التي تتكون من 30 G H: الرقم 1.إبرة ypodermic (B) انضمت إلى سلك الفضة (C) داخل ماصة الزجاج (D). حلقت مناطق (E - F) تسليط الضوء على المناطق التي قد تكون عرضة للتسرب.
الشكل 2: صورة شخصية للماصة شيدت باستخدام إبرة 30 G (B)، لاصق الغراء للماء (F)، سلك الفضة (C) وماصة الزجاج (D).
الرقم 3: مثال على تأثير مثبط للحقن GABA (300 ميكرومتر) على أثار بصريا النشاط متعددة الوحدات في أكيمة متفوقة، والسهام تشير إلى بداية فلاش. كهربائيتم تصفيتها إشارات آل باستخدام فلتر الفرقة تمرير يقع بين 30 و 3000 هرتز.
الرقم 4: التمثيل التخطيطي للنظام حقن الصغرى كاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تصميم البروتوكول المقترح لمواجهة التحديات الناجمة عن أساليب التعطيل عكسها الحالية. على وجه التحديد، يهدف هذا المشروع إلى تحسين الطرق المستخدمة للإبر دقيقة جدا الكيميائية للمواد تحوير النشاط العصبي، وخاصة في هياكل الدماغ العميقة. وثمة تحد تقني الناشئة من هذا النوع من الإعداد هو الحاجة لكلا تحقيقات أن colocalized في نفس مساحة محدودة في الجسم الحي من أجل استخلاص التسجيلات دقيقة في موقع الحقن. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام الأجهزة، مثل تلك التي قدمت هنا، والتي هي قادرة على كل من الحقن وتسجيل في نفس الموقع. وتشمل وسائل بديلة لاستخدام الأجهزة القائمة على البقول ضغط الغاز. وكانت هذه الأدوات المتاحة لسنوات عديدة، ولكن استخدام انضغاط المتوسط يقلل من السيطرة على معدلات الحقن ومجلدات، معلمتين التي تعتبر مهمة للسيطرة على لضمان العودة إلى الوراء. وسائل أخرى مثل الحقن iontophoretic الصورةystems ق وتتوفر أيضا، ولكن ديناميكية انتشار السائل مختلفة مقابل حقن البلعة، والحد من نطاق المحتمل للتعطيل. هذه الأساليب لديها ميزة وجود نمط انتشار كروية بدلا من نمط بيضاوي الشكل لاحظ مقابل الحقن الدقيقة 7. وبالتالي، ينبغي التخطيط اختيار طريقة تعطيل وفقا للمنطقة المستهدفة والتصميم التجريبي. على الرغم من وجود البدائل التجارية، ويوفر البروتوكول المقترح بطريقة فعالة من حيث التكلفة لمراقبة تسليم المواد الصيدلانية، وكذلك السماح للحصول على درجة عالية من التخصيص. هذه الحرية في صياغة جهاز الحقن تفضل طائفة واسعة من المرونة التجريبية وضبط للسياقات تطبيق معين.
فيما يتعلق البروتوكول المقترح، فإن الخطوة الحاسمة هي عملية ملء ماصة الزجاج. وينبغي تجنب فقاعات الهواء، وضغط الهواء سيجعل رصد حقنأحجام مستعصية على الحل. وينبغي أيضا أن يرى مقاومة ضئيلة جدا عند الضغط يدويا السائل من خلال ماصة، مؤكدا التدفق الحر في النظام. غياب السائل مع حقن اليدوي قد تشير إلى وجود تسرب في النظام أو إعداد ماصة غير صحيحة مما أدى إلى ورود معلومات المتعسرة. وينبغي أيضا قياس مقاومة ماصة من أجل الحصول على النوع المطلوب تسجيل الكهربية (LFP، أثار إمكانات والنشاط متعددة الوحدات، وما إلى ذلك)، وأكبر الأحجام نصائح سيؤدي إلى ممانعات أقل.
إذا كان حقن ناجحا، وبلغ حجم التداول 400-800 NL من الحل ميكرومتر GABA 300 أو حل يدوكائين 2٪ غير كافية لإلغاء ارتفاعه النشاط. لديك فكرة عن حقن تنتشر في المكان والزمان، أجار يمكن استخدامها لمحاكاة النسيج العصبي. انتشار الحقن ومن ثم يمكن ملاحظتها بسهولة مع حل ديوان الخدمة المدنية. بعد المحاكاة، فمن الضروري أن تميز حقن نشر تشريحيا من خلال استخدام سو الأصباغ مثل ديوان الخدمة المدنية، من خلال تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام المخدرات أو رديولبلد باستخدام نهج الأيضية مثل تصوير الإشعاع الذاتي الجلوكوز وكلاء غير مباشر لقياس تفعيل أو تثبيط النشاط العصبي 1.
ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن حقن سريعة (≥100 نيكولا لانغ / دقيقة) سيؤدي على الأرجح في الآفات مما يجعل العودة إلى الوراء كاملة غير قابلة للتحقيق. والميزة الرئيسية لالبروتوكول المقترح هو إمكانية دمج نظام حقن مع البرامج التي من شأنها السيطرة على ردود الفعل على معدل الحقن لتحديد مستوى نشاط الخلايا العصبية. ومن شأن هذا التنفيذ تسمح للباحثين للتركيز على تعطيل (أو التنشيط) معلمات بدلا من التركيز على المعايير الفنية مثل معدلات الحقن أو وحدات التخزين بينما كان يلقى فقط على كمية مناسبة من الدواء لتطبيق النظر فيها. وهذا من شأنه تقليل التحقيق النزوح طريق الاستفادة المثلى من حجم المخدرات المطلوبة، والسماح لمزيد الحساسة للوقت السيطرة على تسليم المخدرات، لصالح استنساخ وجميعمقارنة آه المباشرة يقترن البيانات.
هذا الأسلوب يجمع بين نظام لتسليم مادة وتسجيل الإشارات الكهربية. نحن أثبتت فعاليتها باستخدام القدرة على تسجيل ماصة جهدنا لتحديد موقع وظيفيا أكيمة متفوقة عن طريق حفز القطارات من النشاط وحدة متعددة باستخدام فلاش المحفزات 11. خلال تثبيط النشاط متعددة الوحدات تضاءلت وتعافى تدريجيا بعد الحقن تعويض. تقنيات تعطيل عكسية، مثل تلك المعروضة هنا، وتوفر مزايا كبيرة على الآفات الميكانيكية أو الكيميائية التقنيات التي توفر الانتعاش غياب أو ضعف +3. تقنيات تثبيط عكسها تعزز دلالة إحصائية من التجارب منذ مقارنات يقترن ممكنة 3، وبالتالي القضاء على الفروق الفقهي. قمنا بتطوير تقنية فعالة وقابلة للتخصيص التكاليف التي يسمح مراقبة دقيقة على مدى فترة تسليم المواد وقويةتحقق من منطقة دماغية الهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
