Abstract
Nous décrivons ici une méthode pour la construction d'un usage unique "injectrode" en utilisant des pièces commercialement accessibles et abordables. Un système de palpage est développé qui permet l'injection d'un médicament lors de l'enregistrement de signaux électrophysiologiques à partir de la population neuronale affectée. Cette méthode offre une alternative simple et économique à des solutions commerciales. Une pipette de verre a été modifié en le combinant avec une aiguille hypodermique et un filament d'argent. Le injectrode est attaché à la pompe de microseringue commerciale pour la livraison de la drogue. Cela se traduit par une technique qui fournit en temps réel par réaction de la pharmacodynamique à unités multiples signaux extracellulaires provenant du site d'administration de médicament. Comme une preuve de concept, nous avons enregistré l'activité neuronale du colliculus supérieur provoquée par des éclairs de lumière chez les rats, en concomitance avec la livraison de médicaments à travers la injectrode. La capacité d'enregistrement d'injectrode permet la caractérisation fonctionnelle de la injsite de réflexion favorisant un contrôle précis sur la localisation de l'administration de médicaments. L'application de cette méthode étend également bien au-delà ce qui est démontré ici, comme le choix de la substance chimique chargé dans le injectrode est vaste, y compris le tracé des marqueurs pour les expériences anatomiques.
Introduction
L'inactivation des aires corticales et les noyaux sous-corticales est important dans l'étude des relations fonctionnelles entre les différentes structures cérébrales 4.2. La littérature récente a employé des techniques cryogéniques chimique ou la perte de fonction d'étudier le rôle des structures cérébrales 2,5. En ce qui concerne les micro-injections pharmacologiques, de petites quantités de médicaments peuvent être administrés dans une région du cerveau à une vitesse contrôlée, tout en minimisant les dommages collatéraux au tissu environnant de 6,7. Cette technique peut être utilisée pour délivrer des agonistes spécifiques, agonistes inverses ou antagonistes pour étudier l'effet des différentes cibles pharmacologiques sur l'activité neuronale. Ces effets peuvent également être étudiés en mesurant les changements dans les réponses neuronales à partir d'emplacements éloignés, permettant aux chercheurs d'étudier les relations entre les différentes structures corticales et sous-corticales.
Ici, nous démontrons l'assemblage d'un appareil, le injectrode, capable de boe l'enregistrement de signaux électrophysiologiques et délivrer de petites quantités de drogues à l'emplacement cible. Nous démontrons les capacités de ce système en injectant GABA, un inhibiteur de l'activité neuronale commune, chez le rat colliculus supérieur. Cette région est sensible à la stimulation visuelle, qui nous a permis d'utiliser l'activité multiunit évoqué visuellement pour confirmer injectrode localisation. La réversibilité de l'inactivation a été évaluée par la récupération de l'activité neuronale normale après la fin de l'injection GABA.
La capacité de surveiller l'activité multi-unité à partir du site d'injection permet le réglage fin des débits d'injection et les volumes nécessaires pour atteindre la réponse pharmacodynamique souhaitée. Par conséquent, un avantage de cette technique est le potentiel de limitation de dommages aux tissus causés par microperfusion, étant donné que les volumes effectifs plus petits sont injectés. Le protocole proposé offre une méthode rentable pour générer le nécessa matériel jetabley pour les expériences conducteurs où la livraison de la drogue et de l'enregistrement de l'activité neuronale locale est souhaitée.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec les directives du Conseil canadien pour la protection des animaux et de la commission d'examen d'éthique de l'Université de Montréal.
1. Assemblée de la pipette d'enregistrement injection
- Tirer un capillaire en verre d'environ 7 cm de long (diamètre externe 1 mm) à l'aide d'un extracteur de pipette.
- Casser l'embout du capillaire et vérifier l'ouverture sous un microscope optique. Assurez-vous que le diamètre interne est compris entre 30 um à 40 um.
- Insérer un long fil d'argent de 7 cm dans le capillaire de verre avec environ 1 cm en saillie à partir de l'extrémité non effilée de la pipette en verre.
- Plier l'excès filament perpendiculairement au capillaire de verre.
- Appliquer une goutte de colle de matière plastique souple sur l'arbre d'une aiguille hypodermique 30 G.
- Insérer une aiguille hypodermique 30 G dans la pipette en verre selon les schémas présentés sur la figure 1
- Ajouter un deuxième revêtement de colle pour assurer une bonne étanchéité de la jonction entre la pipette en verre et l'aiguille hypodermique.
- Laissez sécher la pipette avec la pointe vers le haut pendant environ 12 heures pour assurer le bon durcissement de la colle. Le résultat final est représenté sur la Figure 2.
NOTE: Cette procédure est effectuée sur des expériences et la stérilisation de la pointe de la pipette aigus est pas nécessaire.
2. Préparation des animaux
- Placez le rat dans une boîte d'anesthésie.
- Induire une anesthésie à l'aide de 4% d'isoflurane pendant 5 à 10 min.
- Placez l'animal sur une table stéréotaxique avec coussin chauffant et sonde rectale pour maintenir une température corporelle de 37 ° C. Utilisez un cône de nez pour maintenir l'anesthésie avec 2% d'isoflurane. Fixez la tête du rat en utilisant des barres de l'oreille et porte-dents.
- Appliquer une pommade ou collyres ophtalmiques, qui comprennent 1% gouttes d'atropine pour aider à la dilatation de la pupille. Pour prévenir la sécheresse, appliquer baisse de lubrifications environ toutes les 30 min.
- Raser la tête et le nettoyer avec 10% de povidone-iode.
- Pour l'anesthésie locale, d'injecter 0,5 ml de lidocaïne 2% sous le cuir chevelu en 2-3 endroits en soulevant la peau et l'insertion de la pointe de l'aiguille.
- Confirmez niveau adéquat d'anesthésie en effectuant une pincée d'orteil et en observant l'absence de mouvement. En outre, surveiller la fréquence cardiaque à assurer qu'elle est à l'intérieur des valeurs normales (300 à 400 battements / min).
- Inciser le cuir chevelu en ligne droite le long de la médiane avec un n ° 10 lame de scalpel pour exposer à la fois les sutures frontal et sagittal.
- Révéler les points de Lambda et Bregma en écartant le tissu qui recouvre le crâne avec une spatule chirurgicale.
- Niveau de sorte que le crâne positions Bregma et lambda sont sur le même plan.
- Pour définir le point de référence, utiliser un appareil de stéréotaxie avec un tube de verre monté pour le mettre juste au-dessus Bregma. Ce sera le «zéro» pour l'antéro-postérieur et medcoordonne les mesures ial-latérales.
- Réglez le point d'intérêt en déplaçant la monture stéréotaxique les coordonnées nécessaires, notez les coordonnées stéréotaxiques et dessiner un carré autour de la zone cible qui marque où le craniotomie sera effectuée.
- Utilisez une perceuse chirurgicale avec une perceuse stérilisée long de la place marquée lentement sans pression pour retirer lentement la matière osseuse. Veillez à ne pas percer trop longtemps dans la même zone, car il va produire de la chaleur et provoquer des lésions sur le cortex.
- Lorsque l'os délimitant la craniotomie est devenue suffisamment mince, retirez soigneusement la section crânienne avec des pincettes pour exposer le cortex.
- Foire irriguer le cortex exposée avec du liquide céphalo-rachidien artificiel pour éviter la dessiccation du tissu.
NOTE: mater élimination Dura est inutile sur le rat que la pointe de l'injectrode est suffisamment solide pour pénétrer.
3. Remplir et le montage du système d'injection
- Remplissez le5-10 ul microseringue par aspiration avec de l'huile minérale.
- Remplissez l'aiguille hypodermique avec la pipette en verre fixe avec une solution de 0,5% de Chicago Blue Sky (CSB) et 300 um γ-aminobutyrique (GABA) ou une solution de lidocaïne 2% avec 0,5% CSB 9. Diluer toutes les solutions avec une solution saline.
- Dans le cas d'une substance abondante, remplissez aide d'une seringue régulière et utiliser les techniques habituelles de précaution pour éviter la formation de bulles d'air.
- Dans le cas des substances les plus chers, utiliser de l'huile minérale pour remplir le injectrode et l'agent chimique peut alors être introduit par aspiration. Comme la différence de densité entre l'huile minérale et de l'eau est relativement élevée, cette substance est un bon candidat pour l'injection de solutions aqueuses.
REMARQUE: Un colorant peut être ajouté à confirmer la séparation entre les deux liquides.
- Pour remplir la pipette d'injection, de remplir une seringue de 1 ml avec la solution par aspiration, puis injecter lentement la solutiondans la pipette d'injection.
- Prêtez une attention particulière pour les fuites dans les régions indiquées dans la figure 1 en frottant ces lieux propres et en observant les fuites en injectant plus lentement la solution avec la seringue.
- Retirez la seringue de 1 ml. Ce faisant, être sûr de garder une légère pression sur le piston de sorte que le vide ne supprime pas la solution de la pipette d'injection.
- Remplissez la microseringue avec de l'huile minérale par aspiration et l'attacher fermement à la pipette d'injection remplie, puis essuyer soigneusement tout excès de solution de la injectrode assemblé avec de la gaze.
- Vérifiez que la pointe ne soit pas bloqué par injection d'un volume très faible, assez pour voir une petite goutte de formation à la pointe de la pipette de verre.
- Montez le injectrode sur le système de micro-pompe et vérifier qu'il est bien fixé.
- Positionner soigneusement la pointe de injectrode les coordonnées de la cible et de réduire la pointe à la surface du cortex.
- Lentement abaisser le injectrOde à l'aide de l'appareil de stéréotaxie à la structure cible (colliculus supérieur dans ce cas) en utilisant les coordonnées anatomiques appropriées.
- Couvrir le cortex exposée avec de l'agar chaud pour éviter la dessiccation du tissu.
4. Injection et inactivation réversible
- Régler la pompe de micro-injection pour injecter 400 à 800 nl à 40 nl / min et appuyez sur Exécuter pour démarrer l'injection. Notez que le taux de pic connaîtront une réduction lors de l'injection.
NOTE: Dans la configuration expérimentale, l'activité neuronale récupéré moins d'une heure après la fin de la prestation de GABA. Tout dispositif mécanique calibré peut être utilisé pour appliquer une pression sur la seringue de micro-injection afin de procéder à l'injection. - Après l'acquisition des données électrophysiologiques, euthanasier en utilisant une méthode approuvée par la Communauté locale éthique animale.
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Representative Results
La construction de la injectrode est illustré sur la figure 1. Un fil d'argent (C) est introduit dans une pipette en verre (D) avec une portion pliée du fil et faisant saillie hors de l'ouverture. Une aiguille de 30 G (B) est fixé et scellé à l'ouverture de la pipette en verre avec de la colle. Après la pipette a été rempli avec la substance d'injection, un micro-seringue en verre (A) est fixé à l'aiguille. Il est important qu'il y ait une bonne étanchéité lorsque le micro seringue communique avec l'aiguille (E) et où le fil d'argent saillie à partir de la pipette de verre (F). La figure 2 représente une photographie de ce que le injectrode ressemble après avoir terminé l'assemblage.
Activité multiunit Visuellement évoqué ont été obtenus dans le colliculus supérieur suit un flash msec 300 à l'oeil controlatéral comme illustré dans la figure 3. Lors de l'injection de GABA, dopage activité en réponse à un stimulus flash a été supprimée. visuellementactivité multiunit évoqué retourné généralement entre 45 à 60 minutes après l'injection a cessé.
La figure 4 illustre la configuration du système de micro-injection. Le contrôleur de pompe d'injection permet à l'utilisateur de spécifier les paramètres pour l'injection. Un connecteur électrique à ressort relie le fil d'argent qui fait saillie à partir de la pipette en verre. Le connecteur conduit à un étage de tête avec des électrodes de masse et de référence et ensuite branché sur un amplificateur. Un convertisseur analogique / numérique (A / D) interface est utilisée pour acquérir les données électrophysiologiques, et un haut-parleur est utilisé pour la surveillance audio complémentaire de l'activité neuronale.
Figure 1:. Représentation schématique de l'ensemble de injectrode Un micro seringue (A) est fixé à la pipette d'enregistrement-injection qui se composent d'un 30 G hypodermic aiguille (B) collé sur un fil d'argent (C) à l'intérieur d'une pipette en verre (D). Régions encerclées (E - F) zones de hautes lumières qui peuvent être sensibles à des fuites.
Figure 2: Une photo de la pipette construit en utilisant une aiguille 30 G (B), de l'adhésif colle imperméable à l'eau (F), un fil d'argent (C) et une pipette en verre (D).
Figure 3: Une illustration de l'effet inhibiteur de l'injection de GABA (300 M) sur l'activité multi-unité évoqué visuellement dans le colliculus supérieur, flèches indiquent éclair apparition. Électriqueal signaux ont été filtrés en utilisant un filtre passe-bande située entre 30 et 3000 Hz.
Figure 4: Représentation schématique du système de micro-injection complète.
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Discussion
Le protocole proposé a été conçu pour résoudre les défis découlant de méthodes d'inactivation réversible actuelles. Plus précisément, ce projet vise à affiner les méthodes utilisées pour les micro-injections de substances chimiques modulant l'activité neuronale, en particulier dans les structures profondes du cerveau. Un défi technique émergente de ce type de configuration est la nécessité pour les deux sondes pour être colocalisés dans le même espace restreint in vivo afin d'en tirer des enregistrements précis sur le site d'injection. Ce problème peut être surmonté en utilisant des dispositifs tels que celui présenté ici, qui sont capables à la fois de l'injection et l'enregistrement sur le même site. D'autres méthodes comprennent l'utilisation de dispositifs basés sur des impulsions de pression de gaz. Ces outils sont disponibles depuis de nombreuses années, mais l'utilisation d'un intermédiaire compressible réduit le contrôle sur les taux et les volumes d'injection, deux paramètres qui sont importants pour contrôler pour assurer la réversibilité. D'autres méthodes telles que l'injection iontophorétique systems sont également disponibles, mais la dynamique de diffusion du liquide sont différents par rapport à l'injection en bolus, la réduction de la gamme de potentiel d'inactivation. Ces méthodes ont l'avantage d'avoir un motif de diffusion sphérique, par opposition à la configuration elliptique observé pour les micro-injections 7. Par conséquent, le choix de la méthode d'inactivation doit être planifiée en fonction de la région cible et la conception expérimentale. Même si des alternatives existent commerciales, le protocole proposé fournit une manière rentable de surveiller l'administration d'une substance pharmaceutique ainsi que de permettre un haut degré de personnalisation. Cette liberté dans l'élaboration du dispositif d'injection favorise une large gamme de flexibilité expérimentale et tuning pour des contextes spécifiques de l'application.
En ce qui concerne le protocole proposé, l'étape critique est le processus de remplissage de la pipette en verre. Les bulles d'air doivent être évitées, comme la compression de l'air rendra la surveillance des injectévolumes insolubles. Une résistance très minime devrait également être ressentie lorsque l'on pousse manuellement le liquide à travers la pipette, confirmant ainsi la libre circulation dans le système. Une absence de liquide avec injection manuelle peut indiquer une fuite dans le système ou de la préparation de la pipette incorrecte résultant en une pointe obstrué. L'impédance de la pipette devrait également être mesurée afin d'obtenir l'enregistrement électrophysiologique de type désiré (LFP, potentiels évoqués, l'activité multi-unité, etc.), que les grandes tailles Conseils se traduira par des impédances inférieures.
Si l'injection est réussie, un volume de 400 à 800 nl d'une solution 300 uM de GABA ou de la solution de lidocaïne à 2% est suffisant pour abolir l'activité de dopage. Pour avoir une idée de l'injection réparties dans l'espace et le temps, l'agar peut être utilisé pour simuler les tissus nerveux. La propagation de l'injection peut alors être facilement observé avec une solution CSB. Après simulations, il est essentiel pour caractériser l'injection répandre histologiquement par l'utilisation of colorants tels que CSB, par autoradiographie en utilisant des médicaments radiomarqués ou en utilisant des approches métaboliques tels que le glucose autoradiographie procurations indirects pour mesurer l'activation ou l'inactivation de l'activité neuronale 1.
Il est également important de noter que les injections rapides (≥100 nl / min) entraînera probablement des lésions faisant réversibilité totale inaccessible. Un avantage majeur du protocole proposé est le potentiel de l'intégration du système d'injection avec un logiciel qui serait rétroaction contrôler le débit d'injection pour un niveau d'activité neuronale ensemble. Une telle mise en œuvre permettrait aux chercheurs de se concentrer sur l'inactivation (ou activation) paramètres plutôt que sur des paramètres techniques tels que le taux ou des volumes injection tout en offrant seulement la bonne quantité de médicament pour l'application considérée. Cela permettrait de réduire la sonde déplacement en optimisant le volume de médicament nécessaire, permettre plus de contrôle sensible au temps de l'administration de médicaments, favoriser la reproductibilité et toutow comparaison directe jumelé des données.
Cette technique combine un système de distribution de substance et l'enregistrement des signaux électrophysiologiques. Nous avons démontré son efficacité en utilisant la capacité d'enregistrement de notre pipette pour localiser fonctionnellement le colliculus supérieur en induisant trains d'activité multi-utilisation du flash stimuli 11. Au cours de l'inactivation, l'activité multi-unité diminuée et progressivement récupéré après compensée injection. Techniques d'inactivation réversibles, tels que celui présenté ici, offrent des avantages considérables par rapport aux lésions mécaniques ou chimiques techniques qui fournissent 3 récupération absent ou pauvres. Techniques d'inactivation réversible renforcent la signification statistique des expériences depuis comparaisons par paires sont possibles 3, éliminant ainsi les différences idiosyncratiques. Nous avons développé une technique efficace et personnalisable coût qui permet un contrôle précis sur la durée de la prestation de la substance et de la robustesondant d'une zone cérébrale cible.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
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