Summary
跨膜蛋白，KvAP，变成巨大的单层囊泡（GUVs）的重组被证明两脱水补液方法 - electroformation和凝胶辅助肿胀。在两种方法中，将含有蛋白的小单层囊泡融合在一起，以形成可以随后通过荧光显微镜和膜片钳电生理学来研究GUVs。
Abstract
巨人单层囊泡（GUVs）是一种流行的仿生系统研究膜相关现象。然而，通常使用的协议来生长GUVs必须为了形成含有官能跨膜蛋白GUVs进行修改。本文介绍了两种脱水 - 再水化方法 - electroformation和凝胶辅助肿胀 - 以形成含有所述电压 - 门控钾通道，KvAP GUVs。在两种方法中，对含有蛋白质的小单层囊泡的溶液是部分脱水，形成一个叠层膜，然后使其在再水化缓冲液溶胀。为electroformation方法，所述膜沉积在铂电极以使得AC场可以在膜补液施加。与此相反，凝胶溶胀辅助方法使用琼脂糖凝胶基质，以提高膜补液。这两种方法都可以产生在低（ 例如，5毫米）和生理（ 例如，100毫摩尔）的盐浓度GUVs。所得GUVs的特征在于通过荧光显微镜，和使用该内面向外膜片钳构造重构信道的函数进行测量。而以交替的电场（electroformation）的存在下溶胀得到高产率的无缺陷GUVs，凝胶辅助溶胀方法产生更均匀的蛋白质的分布，不需要特殊的设备。
Introduction
当研究支配生命系统的物理原理，自下而上途径允许一个实验，以控制系统的组成和不容易在基于细胞的系统1操作的其他参数。为基于膜的工艺，巨单层囊泡（GUVs，直径〜1-100微米）已被证明是一种非常有用的仿生系统2 - 7，因为它们非常适合于显微镜研究和显微8 - 10。虽然有许多不同的协议来产生GUVs，最分为两类-基乳液方法的基础上再水化脂质膜13 11,12和技术- 16。在乳化液为基础的方法中，GUV膜的内，外小叶被依次从脂质单层在水/油界面组装。这种方法适用于封装可溶性蛋白与在GUVs，和用于形成GUVs不对称小叶脂质组合物。然而，从乳液形成GUVs可以保留的痕量溶剂是改变膜的机械特性17，并且该方法不特别适合于跨膜蛋白重建。
膜补液方法依赖于以下事实干燥（脱水）导致许多脂类混合物以形成膜的多片层堆栈。如果此堆栈，然后放置在接触含水缓冲液，在叠层膜会移动它们之间，并在该叠层的表面分开为溶剂流动，个别膜可以分离，以形成GUVs 13,18（以及一个真正的动物园其它脂质对象）。然而，即使是对于最佳缓冲液和脂质组合物，这种典型的“自发溶胀”的方法具有相对低的无缺陷GUVs收率。一种广泛使用的方法，以提高无缺陷GUVs收率“electroformation221 ;,在其中交变电流（AC）场期间膜补液施加。而该机制仍然知之甚少，“electroformation”可以给予壮观GUV产率（>在有利的情况下，90％）为低盐浓度缓冲液（<5毫米）14,19，并且甚至可以在生理缓冲液的工作（约100毫米）使用较高的频率（500赫兹与10赫兹）的交流场和铂电极15。另一种方法，以促进无缺陷GUVs收率是“凝胶辅助肿胀”，其中的脂质溶液沉积在聚合物凝胶基质，而不是被动用于古典“自发溶胀（ 例如 ，玻璃，聚四氟乙烯）基底“。当所得到的脂质/凝胶膜再水化，GUVs能迅速形成，即使对于生理缓冲器16,20。
所有这些方法都可以产生可用于研究膜相关的现象，如脂质仅GUVs可溶性蛋白和膜之间的相互作用。然而，掺入跨膜蛋白进入GUVs，需要显著修改，以确保该蛋白质保持在功能状态在整个重构过程。而在有机溶剂（ 例如，氯仿，环己烷）脂质的解决方案非常适合用于制造脂质膜，跨膜蛋白是典型地仅当稳定它们的疏水跨膜结构域被嵌入脂质双层，或由洗涤剂胶束包围（ 例如，在蛋白质纯化）。因此，对于一重建的起始材料通常是由洗涤剂去除在形成的天然的膜，在洗涤剂溶液中纯化的蛋白质，或小单层含蛋白囊泡（PROTEO-越野车）和/或多层状囊泡（PROTEO-MLV的）存在脂质。大多数将这些膜蛋白进入GUVs方法分为三类。
直接InsertioN：跨膜蛋白悬浮在洗涤剂与预成形的，脂质-只，轻度清洁剂溶解的GUVs混合，并且将洗涤剂然后使用biobeads 21除去。而概念简单，这种方法需要的洗涤剂浓度的精确控制，因为太高的洗涤剂浓度可以溶解而过低的浓度可导致蛋白质折叠或聚集的GUVs。
GUV / PROTEO-SUV的融合：蛋白质在PROTEO-SUV的组合与预成形的，脂质-仅GUVs和融合促进了与特殊膜融合肽22或21的洗涤剂。典型地融合的程度有限，导致GUVs具有低蛋白质浓度。
脱水/再水化：包含蛋白质 - 类脂膜通过PROTEO-SUV的部分脱水（或PROTEO-MLV）溶液和GUVs形成然后生长作为用于纯脂质膜。明显的挑战是局部dehydrati期间保护蛋白质关于步骤23中 ，但该方法已被成功地用于重组跨膜蛋白，如细 菌视紫红质，钙ATP酶，整合和VDAC成GUVs 7,23 - 25。
本文介绍的脱水/再水化协议，使含有该电压-门控钾通道，KvAP，从超嗜热古菌， 嗜pernix GUVs。KvAP具有高度的同源性，以真核电压依赖性钾通道26和一个公知的晶体结构27 ，使其成为一个很好的模型来研究电压门控的机制。生产PROTEO-SUV的已详细描述以前，不是本教程26,28,29的一部分。重要的是，KvAP PROTEO-SUV的不必要产生的每个GUV制剂，因为它们可以被存储在小（ 例如，10微升）等分在-80℃下延长的时间段（> 1年）。 Electroformation或凝胶辅助溶胀然后可用于从KvAP PROTEO-SUV的生长GUVs（或PROTEO-MLV的）。
为electroformation协议的关键步骤被示于图1。含有蛋白质的SUV的溶液的液滴沉积在铂丝（ 图2中示出）。在SUV的悬挂部分脱水导致通过的SUV的融合，形成脂质蛋白膜。期间补液，一个交流电场施加到电极上，以协助脂质层脱层并形成GUVs。 10赫兹场效果很好时，使用“低盐”（<5毫米）补液缓冲区28和GUVs需要几个小时才能成长。与此相反，生理缓冲液（含有〜100mM的盐）与一低电压，500赫兹AC场工作良好，但需要一个长期（〜12小时）肿胀周期15。此方法是基于使用ITO滑动24较早的协议，但是使用自定义腔室续癌宁两个铂丝， 如图2（见用于更简单的设计细节和建议的讨论中，即兴室）。
图3示出了凝胶辅助膨胀方法。该协议可以很好地缓冲生理食盐浓度，迅速，并且产生GUVs具有更均匀的蛋白质分布。然而，分离的，显然无缺陷GUVs收率（ 即 GUV膜是均匀的，在光学长度尺度，并且不括任何对象）较低，但它提供了足够数量的用于膜片钳和显微操作实验。此方法是基于使用琼脂糖凝胶，以产生脂质仅GUVs 16和需要更少的专门的设备比electroformation方法的协议。
GUVs用荧光显微镜的表征被描述，以及使用标准膜片钳设置到程序衡量KvAP活动“由内而外”切膜的补丁。
生长含蛋白GUVs可以比脂质仅GUVs更加困难。尤其是，最后的GUV收率上究竟如何在SUV溶液沉积和脱水以形成薄膜叠层灵敏依赖。有人未经任何以往的经验与GUVs，它可以是下面的其中隔膜是通过从有机溶剂沉积类脂形成的常规协议15,16到第一生长脂质仅GUVs很有帮助。一旦现有协议工作良好，SUV沉积和部分脱水然后可以使用脂质仅越野车，这也是非常有益的调整协议的新的脂质组合物时掌握。当GUVs脂质只SUV的可靠增长，它是那么只是一小步，产生含蛋白质GUVs从PROTEO-的SUV。
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Protocol
1.溶液制备
- 制备5ml含5mM的氯化钾，1mM的HEPES（pH 7.4）中或TRIS（pH为7.5），和2mM海藻糖'的SUV缓冲器“的。过滤用0.2微米的针筒式过滤器的缓冲器和分成可存储在-20℃1ml等分。
注：其他详细信息的试剂和仪器的材料清单给出。 - 准备40毫升GUV“成长缓冲”，这将填补室内GUV在电影补液。对于一个“低盐”的增长，结合的5mM的KCl，1mM的HEPES（pH 7.4）中或1mM的TRIS（pH为7.5）和〜400毫蔗糖。对于一个“生理食盐'成长，结合的100mM氯化钾，5mM的HEPES（pH 7.4）中或5毫摩尔Tris（pH7.5）中，并〜200mM的蔗糖。
- 通过组合的100mM氯化钾，5mM的HEPES（pH 7.4）中或5毫摩尔Tris（pH7.5）中，并〜200mM的葡萄糖制备40毫升'观察缓冲器'为在实验室中的外部溶液。
注意：这些缓冲区只EXAmples。见讨论，以适应缓冲区的其他实验。 - 测量生长并观察缓冲器用渗透压计的渗透压摩尔浓度。添加蔗糖或葡萄糖的颗粒将它们匹配到1％以内，这样GUVs不会溶解或从生长室传送到观察室时塌陷。
注：在此浓度范围内，加入蔗糖1毫米（每40毫升13.7毫克）或葡萄糖（每40毫升7.2毫克）由〜1毫渗量增加渗透压。 - 过滤生长和观测缓冲器用0.2微米的过滤器，并将其存储在4℃，以抑制细菌生长。
- 溶解50毫克β-酪蛋白的10毫升的20mM TRIS（pH为7.5）缓冲液，以形成钝化的试验室的表面，使得GUVs不沾，散布和突发需要5毫克/毫升β-酪蛋白溶液。一旦β-酪蛋白完全溶解（最多几个小时，在4℃），过滤器（0.2微米）成0.5毫升等份可快速冷冻并储存在-20℃，供以后使用（储存在4℃下解冻等分试样通常可用于多达1周）。
2. SUV准备
- 准备并冻结继先前公布详细的协议28 PROTEO-的SUV等分。使用KvAP荧光在蛋白质标记与Alexa-488马来酰亚胺，还原成DPhPC越野车（10毫克/毫升）至1:10（质量比）的脂质比率。
注：野生型KvAP包含每个单体靠近细胞内C端（氨基酸247）一个半胱氨酸。 - 荧光，脂质只有越野车：
注：在通风橱戴丁腈手套和防护眼镜处理氯仿。避免使用任何塑料如氯仿能够溶解它们。氯仿溶液可以储存在琥珀色玻璃小瓶用聚四氟乙烯帽和使用玻璃注射器转移。照顾之前和吹打脂质后，以冲洗所有玻璃器皿至少5至10倍，用氯仿。- 制备100微升10含有0.5％（摩尔）的红色荧光脂质，德克萨斯红-DHPE中，通过将100微升DPhPC溶液（10毫克/毫升的氯仿溶液）用8.2微升德克萨斯红 - DHPE溶液（1毫克/毫升毫克/毫升DPhPC越野车在甲醇中）在1.5ml琥珀色玻璃管形瓶中。
- 在化学罩干燥脂类向下在氮气流中，同时旋转小瓶。当膜看来是干燥，放置脂质的真空下3小时，以除去任何残余的溶剂。
- 加入100微升的SUV缓冲器向脂质和涡大力直到没有脂质仍粘在小瓶的壁，该溶液是均匀的乳白色。
- 超声处理脂质溶液中以形成越野车。调整小瓶的位置，直到超声波使大多数流动和流动瓶内，并注意不要进行不必要的加热解决方案。继续超声处理直到溶液变为半透明，或可能时，透明的（2-5分钟为尖超声处理，〜20分钟，浴超声处理）。
- Aliquo吨的SUV（ 例如，10微升或20微升），并冷冻（-20℃）以备后用。
注：血脂，特别是不饱和脂肪，可以轻松击穿。在20℃（或80℃）在氩气下商店脂质溶液和6个月内使用。脂质分解产物可与薄层色谱法来检测。
3. GUV生长的Electroformation
- 准备electroformation室。
- 如果室内没有被清理，删除Windows，擦去所有密封胶和油脂，提取的电线，冲洗和擦洗使用水和乙醇（≥70％）交替组织室。
- 擦电线井，淹没电线和腔室中的丙酮，和超声处理5分钟。消灭一切用纸巾再次使用丙酮。放入乙醇和超声腔室5分钟。
- 组装室通过孔插入线，然后旋转擦拭线，以确保他们的ARË干净。放腔室在蒸馏水，超声处理5分钟，并用氮气干燥或空气流腔室。
- 制备30微升3毫克/毫升的SUV悬浮在SUV缓冲器。形成含有蛋白质 - GUVs，结合8微升PROTEO-的SUV（DPhPC 10毫克/毫升KvAP 1:10），2微升荧光的SUV（10毫克/毫升DPhPC，0.5摩尔％TexasRed-DHPE）和20μl的SUV缓冲器在1.5ml微量离心管中的最终蛋白质为1脂质（质量）比：12.5和0.1％（摩尔）TexasRed-DHPE。大力混合溶液。
- 可替换地，实行与脂质仅越野车的协议，简单地结合10微升荧光的SUV（10毫克/毫升DPhPC和0.5摩尔％TexasRed-DHPE）与20μl的SUV缓冲器。
- 存款SUV解决方案。
- 使用2微升吸管或5微升玻璃注射器沉积在导线在SUV溶液的小（<0.2微升）液滴。大约1微升溶液是需要的沿着形成一系列滴1厘米线。确保墨滴足够小，间隔足够远，他们不碰或保险丝。
- 让沉积的SUV干燥〜在露天30分钟。当所有的水滴纷纷落户，旋转钢丝等脂质沉积更容易观察的显微镜。
注意：如果SUV的不充分干燥，他们可以洗掉的电线时增长缓冲液加入，而干燥过多会损伤蛋白质。因为空气湿度影响干燥速率，干燥时间和/或空气湿度可以获得最佳的结果30进行调整。上的电线的脂质膜应该是在显微镜下可见。
- 装配该室。
- 密封该室底部：用注射器施加真空润滑脂的三个井周围的腔室的底部，并按下40毫米×22毫米盖玻片轻轻反对以密封腔室底部，使得它粘附没有间隙。密封腔室的（其中的电线出口）与侧面密封膏。在室内，概述了三口井的顶部应用真空润滑脂。
- 慢慢加入生长缓冲，直到每个井被填充到顶部。避免在孔中的溶液中的任何快速运动，因为这可以去除脂质膜脱落的电极。
- 轻轻按下顶盖滑动到油脂，注意不要打跑底部盖玻片关闭室。使用的组织去除缓冲器的任何滴在顶盖滑动的边缘。
注：这是一个很好的时间来检查显微镜下腔，以确认脂质薄膜一直保持在电线。
- 连接的信号发生器，以使用两个鳄鱼夹的导线。设置频率（10赫兹/ 500赫兹的正弦波低/高盐缓冲液），并用万用表测量并调整整个电线的电压0.7 / 0.35 V均方根（Vrms）的电压为低/高盐缓冲液。用铝箔覆盖的腔室，以保护荧光团从光。离开吨他GUVs中生长2至3小时的低盐缓冲液中，12小时或O / N的高盐缓冲液。
- 断开发电机室，并小心地将它放在倒置显微镜来评价GUV增长。使用井缓慢，稳定的运动或流体可能会过早地从电线分离GUVs。
注：GUVs在电线上的边缘通常是在相衬（40X长工作距离物镜）可见，而GUVs上的导线的下半部的任何地方，可以看出用落射荧光。如果没有GUVs是可见的，尝试旋转电线看的上表面。 GUVs可以储存于4℃在生长室中数天。
4. GUV增长凝胶辅助肿胀
- 通过混合100毫克琼脂糖的10毫升纯水中制备出10毫升1％琼脂糖溶液。其加热至沸腾通过将其在微波中在480瓦〜20秒。搅拌以确保琼脂糖完全溶解。
注：该解决方案可以储存于4℃并在需要时加热。 - 等离子清洗（空气等离子）掩盖幻灯1分钟，使琼脂糖解决方案将很好地传播它。用接下来的15分钟内盖滑梯等离子清洗的效果迅速消退。
- 应用200微升暖琼脂糖溶液到每个22×22 mm 2的滑动，以便润湿整个表面上的溶液。倾斜滑动垂直触摸下缘组织，去除多余的液体，并留下琼脂糖只是薄薄的一层光滑的幻灯片上。
- 放置在热板上或烘箱滑动，在60℃，并让它干燥至少30分钟。琼脂糖膜是通过眼几乎不可见。后的幻灯片冷却至室温，立即使用它们，或者在一个封闭的容器将它们存储为长达一周，在4℃。
- 将琼脂糖涂覆的盖玻片在标准3.5厘米培养皿。
- 准备SUV的解决方案，如第3.2和运用〜15微升的SUV溶液（3毫克/毫升的脂肪）〜30非常小水珠轻轻地放在琼脂糖表面。小心不要扭曲琼脂糖层太多。
- 放置在氮气流平缓滑动约10-15分钟，并按照缓冲的蒸发通过肉眼作为液滴干燥。
- 只要越野车已干燥，添加生长缓冲，以覆盖滑动面。对于一个小3.5厘米培养皿中使用约1 ml缓冲液。
- 允许肿胀进行为约30分钟，然后使用倒置显微镜相衬或微分干涉对比（DIC）的审查GUVs的在腔室中的生长。
注：落射荧光观察是困难的，因为在凝胶和自发荧光琼脂糖的荧光团的强背景。
5.采收和观测GUVs
- 钝化观察室（ 如小培养皿或玻璃盖玻片），以便GUVs不沾，传播和突发的室底部。覆盖湛BER底部与β-酪蛋白溶液，孵育5分钟，冲洗用纯水的酪蛋白溶液，用空气或氮气流干燥，最后加观测缓冲液（ 例如，约5毫米深度要小培养皿）。
- 收获GUVs。切的100微升移液管头的端部，以便所述开口较大（〜2毫米直径），并慢慢地向往如移液可以很容易地破坏GUVs的剪切应力。
- 对于电形成GUVs，轻轻除去顶部盖玻片打开生长室。直接放置在移液管尖的每个导线和抽吸以上〜50微升，同时移动枪头沿导线拆下GUVs。
注意：它可能有助于旋转电线收集GUVs的“另一面”的电线。 - 对于“凝胶辅助消肿”GUVs，先点击培养皿的一侧几次帮助GUVs从盖玻片表面分离。定位枪头刚盖玻片和吸出上述50微升，而Pulling尖端背面上的表面上。直接收获GUVs在1.5ml微量离心管中，在4℃下长达1周转移到观察室中，或储存。
- 对于电形成GUVs，轻轻除去顶部盖玻片打开生长室。直接放置在移液管尖的每个导线和抽吸以上〜50微升，同时移动枪头沿导线拆下GUVs。
- 将观察室的倒置显微镜，加上GUVs到观察室，并等待几分钟，让GUVs，收于腔底部。
- 调查相衬或DIC室快速定位光滑，球形（“无缺陷”）“GUV考生”。检查萤光每个“GUV候选人”，以排除内部嵌套任何含有较小的脂质体。最后，检查血脂荧光强度均匀，用一个单一的膜（ 即单层）兼容。
注意：在某些bilamellar（或多层状）囊泡，所述膜过于靠近在一起以得到解决，这样他们出现在单层相衬或DIC图像。然而，这些对象可以从实际unilame区分LLAR GUVs通过脂质荧光，这是更亮的两倍（或更多）。
6.膜片钳GUVs
- 使补丁移液器与使用推荐的吸管拉马程序规范硼硅玻璃毛细管1-2微米的尖端直径。
注：特殊处理如火抛光是没有必要的，而且吸液管可用于它们已被拉出后，如果它们被保持在封闭的盒子数天。 - 通过用β-酪蛋白溶液（5毫克/毫升）培养，以确保GUVs不粘附，扩散和破裂的室表面钝化室。 5分钟后冲洗酪关闭。
- 将接地电极，填充观察缓冲室，转移10微升的GUV暂停如步骤5.2和5.3描述，并等待几分钟，让GUVs，收于底部。
- 填补了新鲜的补丁吸管解决方案（观察缓冲区或其他等渗溶液）和它安装在膜片钳放大器探头。
- 通过腔搜索找到了“无缺陷”GUV在5.4节中描述，并检查它是否含有荧光蛋白。
- 施加恒定正压力（> 100帕，或大致1厘米H 2 o在一个压力计），以保持所述膜片吸管内部清洁，并插入膜片吸管进入腔室。使膜片吸管进入视场，施加测试脉冲来测量/补偿移液器电压偏移和电阻，并检查在荧光灯照明的吸管，以确认该尖端是干净的。
- 使膜片吸管朝向GUV，并在必要时，同时降低了正压力，从而从膜片吸管的向外流动不会使GUV“跑掉”。当膜片吸管靠近GUV，施加负压（长达5厘米的H 2 O）与拉靠在膜片吸管的GUV。监视电阻作为“; GUV膜舌“进入补丁吸管和千兆欧密封形式。
- 如果一个千兆欧密封没有形成，从腔室取出膜片吸管，并返回到步骤6.4。如果膜贴片形成的千兆欧密封，但GUV保持附着到所述移液管，通过从GUV拉远，爆破的GUV靠在腔室底部，或简单地移动所述吸移管从溶液中切除补丁。
- 当内向外膜补丁已经切除从GUV和千兆欧密封是稳定的，关闭测试脉冲和施加电压的协议，如在图13中所示的那个。
注： 图13所示为一个由内而外的补丁中，电流流入补丁电极是“积极”的标准电惯例，V = V 浴 - V 吸管 。保持贴片在负电位（ 例如，V = -100毫伏）为〜30秒的地方KvAP在静止状态，而步骤（100毫秒至5秒），以更积极的潜力（ 例如，V = 100毫伏）就可以驾驶它到导通（ 即开放）活动状态。 - 在膜补片测量结束后，打破了补丁以ZAP或压力脉冲，检查电压电极贴片偏移没有漂移。取出膜片吸管从室，并返回到步骤6.4。
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Representative Results
GUVs的生长可通过检查生长室，在显微镜下进行快速评估。对于electroformation，所述GUVs倾向于增长沿铂导线束， 如图4。在凝胶辅助肿胀，GUVs显示为球形的结构，可以快速成长，并融合在一起（ 图5）。
无缺陷GUVs更容易识别和传送到一个观察室之后进行评价。需要校准测量来严格评价GUV质量，并且一个系统的量化先前已公布的28。然而，作为一个经验指导，“好”GUVs应内部分离（ 即，而不是在一个簇），有一个单一，光滑，球状外膜，不包含物体（ 即，管，嵌套囊泡等 ），以及有“标准”的脂质荧光水平（较亮的对象通常是双或多板层）。 图6显示了“无缺陷”GUV的DIC和落射荧光图像传输到等渗葡萄糖溶液后。在DIC的对比度是由于在蔗糖填充GUV和含葡萄糖槽液之间的光密度的差。 KvAP含GUVs的折射率对比度往往随时间降低，即使KvAP本身不应该是可渗透的蔗糖或葡萄糖。所述均匀的蛋白质的荧光在GUV膜证实KvAP在GUV掺入（ 即 ，它没有留在脂膜），并没有形成微米级的（或更大）的聚集体。
图7,8和脂质及蛋白质的荧光9显示共焦图像从由低级-盐electroformation协议，生理食盐electroformation协议，和凝胶辅助溶胀协议产生GUVs。荧光脂质（品红色）和蛋白（绿色）信号已被缩放到相同的平均亮度，使GUVs具有低/高数每单位面积（蛋白质浓度）的蛋白质具有品红/绿色阴影的叠加图像（右列），而GUVs用平均蛋白密度是白色的。孤立的，无缺陷的GUVs鉴定和GUV尺寸分布示于图10中 。通常electroformation产生更多的无缺陷GUVs比凝胶辅助肿胀，但通过electroformation产生的GUVs较小。 图11示出了蛋白质浓度分布推断从GUVs的荧光。 Electroformation用高盐缓冲液产生GUVs其中蛋白质浓度变化很大，从GUV到GUV。个别GUVs的蛋白质浓度变化为electroformation用低盐缓冲液要少得多，同时通过凝胶辅助膨胀产生GUVs的蛋白浓度是非常均匀的。
的膜片钳技术是一种广泛使用的ð方法用于研究电压门控离子通道，如KvAP的功能。在“内 - 外”的记录，一个干净的玻璃“补丁”吸管用于从一个GUV切除膜的贴剂。膜片吸管内的电极，然后用施加电压，并测量所得到的电流流过该膜补丁。膜贴片的组合物可从细胞/ GUV 31的其余部分有很大的差别，但“由内向外”配置依然测定单通道电导，离子选择性和电压依赖性门控非常有用的。这三个属性是建立该电流不是由于工件（ 例如，千兆欧密封的问题）或污染物（来自纯化如细菌孔蛋白）一种很好的方法，并且有官能KvAP通道中GUVs。
通道电导最容易被测量补丁与只有一个或两个有效信道。在EXA图12所示mple，无通道开口观察当膜被保持在-100毫伏，而在100毫伏，个体信道的开口，可以清楚地分辨。当前直方图显示对应于所述闭合和打开状态的两个峰，和与双高斯函数拟合它们产生的10.9±0.85 pA的单个信道的电流，对应于109.2±8.5 PS（在100mM氯化钾）电导。需要注意的是单通道电导取决于溶液（特别是钾的浓度）和膜组合物32,33。
像许多其他的K-渠道，个人KvAP渠道展“喋喋不休”连发迅速开启和关闭。正如以前证明，氢的选择性可以通过使用在膜片吸管不同溶液进行测试（ 例如，膜片吸管溶液90 mM氯化钠，10mM的氯化钾）28。
电压依赖性门控但是人们经常会tudied在具有多个频道的补丁，以便更容易地获得一个综平均。虽然没有明显的机制有利于生理（细胞内结构域上GUV内部）和逆（在GUV外部细胞内结构域）在GUVs插入KvAP的，在“由内而外”的膜片大部分功能的通道有“生理“插入28， 图13示出了包含多个膜补丁的信道，以一系列的5秒去极化步骤的响应（> 10）。每个步骤之间，该补丁被保持在-100毫伏为30秒，以允许信道与“生理”插入返回其静止状态。当电势足够负（ 例如，V <-60毫伏）大部分电流是由于千兆欧密封泄漏，和一个或两个通道，这些通道可能有“逆”插入偶尔开口。对于措施，更加积极POTEntials，观察信道的越来越多，直至有这么多的个别开闭不再能够解决。因此，该信道的开放概率显然电压依赖性。 KvAP激活和失活的动力学差异很大黑脂膜（类脂膜）26和GUVs之间，但是这是与以前的报道相一致，即Kv通道门控可能对膜的组成和状态34敏感。
图1. GUV Electroformation示意图：含越野液滴沉积到一个电极上的溶液的部分脱水引起的SUV融合，以形成叠层膜。缓冲液然后加入一个AC电场施加。作为电影骤升，个别膜从堆栈中分离，形成GUVs。 （这个数字已经被国防部后指定由AIMON 等 28）
图2. GUV Electroformation室。该室被研磨出具有三个孔（10毫米直径，五毫米深）的PTFE块的。两个直径为0.5mm的铂导线被3毫米（边到边的距离）分离，并且被定位成靠近所述腔室的底部，以促进该电线的成像。底部和顶部盖玻片被关押在地方与真空脂，密封膏防止任何泄漏，从侧面的线孔。交流发电机用鳄鱼夹到电线连接。该腔室是基于一个由埃内斯托Ambroggio和路易斯Bagatolli开发的。 （这个数字已经被修改AIMON 等 28）
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图3.凝胶辅助自发溶胀示意图：含有SUV悬浮液滴沉积在琼脂糖凝胶上作为液滴脱水时，越野车融合形成的脂质膜。当生长缓冲液加入，膜再水合和GUVs在表面形成。 GUVs肿胀以及与周边GUVs融合长到约10微米大小。
含KvAP的铂丝在高盐缓冲液日益增长的DPhPC GUVs图4。代表的形象。在GUVs类似于沿着电线束葡萄。使用40X LWD目标相衬图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. DPhPC GUVs含KvAP肿胀琼脂糖凝胶的 GUVs是作为隐隐可见的球体，直径10微米〜。黑/亮点是脂质/琼脂糖聚集从中囊泡膨胀。与40X LWD目标相衬图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图无缺陷GUV 6.图像包含KvAP用Alexa-488（蛋-PC：鸡蛋-PA 1 9质量）左：DIC，右：Alexa的-488表面荧光。激励：五十○分之四百七纳米，发射：75分之545纳米。请注意，从KvAP均匀荧光，无明显的聚集。 81fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图脂（品红色）和蛋白质（绿色）的荧光从低盐缓冲长大电GUVs 7.共聚焦图像（蛋-PC：鸡蛋-PA 9:1质量）（A）的白色箭头标记（可能）。 GUVs，而红色箭头标志着一个潜在的双板层囊泡具有较高的脂质荧光。需要注意的是，荧光强度是因为考虑到非常大的场的在该图像的中央更亮。 （B）放大显示一小群GUVs的。左（品红色）：TexasRed-DHPE激发：543纳米激光线，排放：七十零分之六百○五纳米。中心（绿色）：KvAP用Alexa-488激发：488纳米激光线，发射：三十〇分之五百十五纳米。右：叠加。OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图脂（品红色）和蛋白质（绿色）的荧光从生理盐浓度长大电GUVs 8.共聚焦图像（蛋-PC：鸡蛋-PA 9:1质量）。（A）的GUVs（白色箭头显示可能单层例子）的更稀疏相比低盐协议，并且可以具有非常不同的蛋白质浓度（红色箭头）。 （B）放大显示一小群GUVs的。左（品红色）：TexasRed-DHPE激发：543纳米的激光线，发射：七十零分之六百○五纳米中间（绿色）：KvAP用Alexa-488激发：488纳米激光线，发射：三十〇分之五百十五纳米。右：覆盖请Ç舔此处查看该图的放大版本。
图9.脂质（品红色）和由凝胶辅助溶胀用生理食盐浓度缓冲器形成GUVs（DPhPC）的蛋白（绿色）荧光的共焦图像。GUVs显示更均匀的蛋白质的密度比制备用生理缓冲电GUVs。左（品红色）：BPTR - 神经酰胺0.1％激发：543纳米激光线，排放：七十〇分之六百〇五纳米。中间（绿色）：KvAP用Alexa-488激发：488纳米激光线，发射：三十〇分之五百十五纳米。右：两个通道的合并，请点击这里查看该图的放大版本。
图11. GUV蛋白密度直方图：蛋白质密度GUVs电铸用低盐缓冲液（5mM的氯化钾，DPhPC）（每单位面积的蛋白质的数量）的变化小于用生理食盐浓度（100mM的氯化钾，蛋-PC：蛋-PA 9：1质量比）GUVs的蛋白质浓度（DPhPC）通过在生理盐缓冲凝胶辅助溶胀生长示出了至少变异。蛋白质浓度是成比例于这些浓度28 KvAP-A488荧光强度，并且在每个直方图中的荧光强度是由分布的平均值归一化。 （中间面板已被修改从AIMON 等 28）
GUV膜补丁（DPhPC'由内而外'的电压公约）图12.单通道活性，GUV种植在100毫米氯化钾，5毫米的HEPES pH值7.4的铂丝。单通道申请100 mV的潜力在补丁后打开。到插块的右侧是用于计算单通道电导的直方图。红线是一个适合于带最大值的双高斯函数在4.70±0.27 pA的和15.62±0.58 pA的，对应于109.2±8.5 PS一个电导。跟踪滤在10kHz与4极Bessel滤波器和记录，在50千赫。
图13.电压dependen吨门控通道从一个高盐缓冲液组成琼脂糖一个GUV（DPhPC，“由内而外”的电压约定）膜补片，贴片膜电流（A）响应电压的瞬步。吸管和浴溶液都含有100mM的氯化钾，和将膜保持30秒，在-100毫伏电压连续步骤之间。在仔细观察可以看到，该跟踪包含1或2个信道，似乎与负电压中打开。小图a）示出经延迟的开口和小图b）的信道的延迟关闭的变焦。电流进行过滤，用4极Bessel滤波器在10千赫和记录，在51.3千赫。离线跟踪被下采样到513赫兹。负电容瞬态-150 pA的切断。 （B）的平均电流（0.25秒<T <5秒）与跨步电压。电流在正电压较大，因为通道开放概率是电压依赖性。尔斯/ ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
仿生模型系统用于研究蛋白质和膜的性能和相互作用的一个重要工具。相比像类脂膜或支持的脂质膜的其他重组系统，GUV基础的系统本数的机会，包括相当大的控制的膜组合物，紧张和几何形状，以及作为真正的无油。然而，掺入跨膜蛋白，如KvAP成GUVs需要常规的协议为脂质仅GUVs显著适应。这里介绍的electroformation协议是以前的特点，并用于研究在弯曲膜2,4,35膜蛋白的分布和动态变化的生物学原理。这项工作表明一个新的凝胶辅助肿胀协议，加入到该组的蛋白质重构在GUVs方法。这两个协议可产生含有KvAP高密度的无缺陷GUVs，并测量在由内而外的补丁确认本身GUVs含有官能钾选择性，电压依赖性通道。
这两种方法都有不同的长处和短处。当低盐条件都可以使用，electroformation提供GUV产量和均匀的蛋白质浓度之间的良好折衷。 Electroformation仍给出合理的产量与生理盐浓度，但蛋白质浓度可以GUVs之间有很大变化（参见图8和11）。的浓度变化似乎被链接到electroformation的持续时间，作为低盐缓冲增长也可以具有相当大的密度变化，如果持续增长超过2小时更长的时间。与此相反，用凝胶辅助膨胀产生GUVs具有显着均一的蛋白质的密度，即使是生理缓冲液。然而，多片层囊泡的分数为更大，琼脂糖自发荧光低复杂蛋白质的定量密度16。解放军用聚乙烯醇琼脂糖CE已经报道以提高凝胶辅助GUV屈服时脂质从氯仿20沉积，但我们无法产生使用聚乙烯醇与SUV的解决方案GUVs。如果无缺陷GUVs收率降低是可以接受的，凝胶辅助肿胀有用于需要均匀的蛋白质分布实验明显的优势。
Electroformation和凝胶辅助肿胀也有很大的不同设备的要求。凝胶溶胀辅助协议使用的小的专用设备，除了等离子体清洁器，因为有许多可供选择的方法来生产清洁的，亲水的玻璃是不是必须的。与此相反，electroformation需要自定义腔室与导线电极。铂丝是昂贵的，但对于此协议GUVs变得更加容易与铂比钛线以及GUVs在ITO不生长用生理食盐浓度时滑动。电极（0.5mm）的直径为配筋电极表面与价格之间omise。在图2所示的腔室是根据一个设计路易 斯Bagatolli 15和Ernesto Ambroggio，并从聚四氟乙烯（PTFE）被加工，以允许清洗与大多数溶剂。然而，聚缩醛或聚氯乙烯（PVC）也应该很好地工作。以除去铂丝为侵蚀性清洁的能力是很重要的，并且当第一次学习的协议，它是能够通过底盖滑动观察GUV生长原位非常有益的。较小的，封闭的井防止解决方案的晃动前后，也允许并行的几个脂质成分测试。然而，起步时的特别定制的腔室不是必须的。例如，简单的单井室可通过定位焊两根线向下到一个小培养皿的底部，或者使用封蜡夹着两个玻璃载玻片它们之间，或者简单地通过的一个小的小瓶帽戳它们来进行的。
两者electroformation和凝胶辅助溶胀协议应该产生的无缺陷GUVs用于显微操作和膜片钳实验的足够数量。然而，GUV收率灵敏取决于双层堆叠的形成时的SUV溶液是部分脱水的。如果困难越来越GUVs遇到（ 即没有或很少GUVs是在生长室中可见），它可以是非常有帮助的使用的脂质/氯仿溶液代替越野车15,16的生长脂质仅GUVs（和低的盐缓冲液）。如果GUVs不从脂质/氯仿薄膜生长良好，那么事情根本是错误的（ 例如，不正确的脂质解决方案或缓冲液，油脂和污垢在电极上，不正确的电压或频率等 ）。但是，如果从GUVs脂质/氯仿膜，但尚未在SUV膜生长，那么问题可能是与部分脱水。
部分脱水步骤是最容易使用脂质只有越野车，因为是过度脱水“变性”血脂没有风险进行了优化。对于electroformation，它可以帮助检查电线后水滴SUV已经晾干，检查存在的，其中液滴被放置的每个点亮脂质荧光。如果脂质荧光消失后室充满生长溶液，那么无论是生长溶液，必须更加小心地加入，或越野车需要脱水更长，以便该膜附着更牢固地与导线。在生长期间，使所述腔室中肯定，无论是金属丝，也没有解决办法动（ 例如，把该腔室时，在显微镜），以避免剥离GUVs断丝。当GUVs生长良好，他们通常很容易看到相衬图像。然而，更小的GUVs往往更明确使用脂质荧光，这也是看到如何薄膜叠层生长期间已经改变很有帮助。检查的所有表面在所有孔中的电线（内部，外部，顶部和底部），以及丢弃的生长，因为产率可以从一个点到另一个变化很大之前的室地板上。
处理和贮存GUVs的是简单的细胞相比，但GUVs是渗透胁迫，剪力和粘合力相当敏感。收获或转移GUVs时光滑，平缓的运动是重要的，并以钝化表面以防止GUVs粘附和爆炸是非常重要的。然而，对于膜片钳实验室必须彻底钝化后冲洗干净，以免钝化液不能大衣补丁吸管，防止千兆欧密封形成。对于钝化的β-酪蛋白的治疗是简单而有效的，并且与牛血清白蛋白，其具有脂质转运功能，β-酪蛋白与脂质双层更有限的相互作用和与GUVs 36工作时，应优先选用。通过改变温育的时间，它是可能得到GUVs坚持不爆炸。然而，GUVs不会粘附在盖玻片作为牢固的细胞，所以照顾时，可以诱导流在腔（ 例如，缓冲液灌注，移动所述腔室）的任何过程仍然必须采取。
膜片钳记录是一种经典方法用于研究电压门控离子通道像KvAP和这个协议是由标准技术衍生用于获得从贴壁细胞“由内向外”的补丁。标准膜片钳的建立，其中，膜片吸管下降倾斜（ 例如，从水平方向30-60度）到一个小培养皿应该很好地工作。然而，膜片吸管和千兆欧密封区域的更清晰的图像可以使用的腔室，其中盖单形成腔室的顶部和底部（〜1毫米分离），以使膜片吸管可以从侧面水平地输入而获得。因为不需要大膜片吸管压力，压力可方便地为controlled用注射器，并与任何简单的压力测量仪（ 例如，即兴水压力计）监测。它可以帮助第一次练习膜片钳实验使用的是脂质/氯仿溶液和低盐缓冲成长脂质只GUVs。由于无缺陷GUVs的产率非常高，就会有大量的完美GUVs即使许多是在收获，并转移到试验室中被破坏的工作。
随着一点点的做法，切除的膜片与稳定gigaseals可以很容易地从DPhPC GUVs和KvAP-DPhPC GUVs获得。实现了高成功率，它有助于慎重选择圆形，但略波动，无缺陷GUVs并检查补丁吸管是干净试图形成千兆欧密封之前（寻找荧光脂质）。当膜“舌头”进入补丁吸管的千兆欧密封通常形成快（<1秒）无需任何强大的吸力或specifiC，保持电压。而一个坏密封件可改善作为膜进一步爬入膜片吸管，往往在密封仍然很差，因为吸管内部被污染，这是必要的重新开始用新鲜膜片吸管和GUV。 DPhPC形式非常稳定的（几十分钟）膜用的补丁，即使在高电压（ 例如，±150毫伏）优良的密封性能。 SOPC：胆固醇（3:1摩尔）也可形成非常稳定的贴剂，但可以要求较高吸入密封，而蛋PC补丁似乎更容易断裂。
对于较长的膜片钳会话，可能有必要调整室溶液的渗透压。如果渗透压比GUV生长缓冲太低得多，GUVs变得肿胀，紧张和球形，它可能无法向抽吸GUV膜足够远进入膜片吸管，以形成千兆欧密封。这通常可以固定通过简单地等待10或20分钟，如蒸发从室增加了转ernal液渗透压，直到GUVs放气，并开始波动。反之，如果腔打开的时间过长外部溶液的渗透压可以增加，直到GUVs紧缩，tubulate和萌芽状态。这可避免从腔室阻挡蒸发（ 例如，用矿物油）或周期性地加入蒸馏水，以取代已蒸发的水。
因为蛋白质可排除切膜板31，活动通道在离体补片的数量并不仅仅与蛋白质在GUV膜的密度。荧光测量表明KvAP的在贴片膜的浓度比GUV 28低得多，它可以是相当容易的，得到仅含有少量的信道的补丁。然而，如果补丁包含太多通道单通道记录，使用补丁移液器具有较小的提示和/或降低的蛋白质与脂质D的明显步骤密度在SUV组合是有效的。与此相反，为了执行对包含许多频道补丁合奏的测量，也可以是有帮助的，开始具有相对高的蛋白质浓度（ 例如，1：10，蛋白质脂质重量）时，使用荧光蛋白来选择GUVs具有高蛋白质浓度中，使用较大的补丁移液器（ 例如，2至3微米的尖端直径），并吸出快速设法迅速形成密封。显然，“全细胞”型配置（ 即 “全GUV”）将是理想的一个GUV所有频道的特点，但不幸的是，“全GUV”配置带来的几个技术问题37。
的解决方案，脂质和蛋白质的浓度在本教程仅被提供作为起始点，并且可以改变以适应特定的实验下列几方面的考虑的需要。
所有的解决方案应包括的pH缓冲液如HEPES或TRIS以确保蛋白质不暴露于极端pH。 SUV的缓存器应当具有的溶质作为蛋白质的尽可能低的浓度将容忍（ 例如，5mM的盐或更低），由于在部分脱水步骤溶质浓度增加及高盐浓度可以使蛋白质变性或使脂质膜迅速在补液步分层。少量糖例如海藻糖（ 例如 1mM至5mM的）被认为是脱水23期间保护蛋白质。而海藻糖已经牵涉于anhydrobiosis并且被认为是保护膜和蛋白质对抗使干燥38，蔗糖或葡萄糖可能工作得同样好。
对于生长缓冲液，盐的浓度是特别重要的，因为这会影响最佳GUV生长（ 例如，electroformation电压，频率和持续时间）的参数。与此相反，对于观测缓冲器的主要约束是叔帽子它应具有相同的渗透压作为生长缓冲区。在“成长缓冲器”和“观测缓冲器”列入蔗糖和/或葡萄糖的可以是有益的，以确保GUVs沉淀到观察室的底部，而在GUV内部和外部之间的折射率的差有助于相衬或DIC显微镜。电生理学家通常包括钙或镁离子的浴和/或膜片吸管解决方案，以提高千兆欧密封形成与细胞膜，但这些不似乎是为GUVs必不可少的。事实上，二价离子如镁和钙可诱导脂质相分离，并促进粘附力，因此，如果这些问题出现，可能是有益的补充1mM EDTA中。
显然，重构系统相比，细胞的一个关键的吸引力是控制脂质组合物的能力。 DPhPC GUVs生长良好，并形成稳定的切膜补丁，这些协议还努力EFfectively含磷脂酰胆碱（PC）的脂质的混合物，磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰甘油（PG），磷脂酸（PA），磷脂酰丝氨酸（PS）和胆固醇。然而，GUV生长是既要脂质成分敏感和缓冲器15，并且这样的协议参数（ 例如，脂质的量沉积，electroformation电压/频率）可能需要调整为含有高浓度的PE脂质的混合物，带电荷的脂质（PG， PA，PS），或胆固醇。当开始出，蛋的PC，DOPC或DPhPC都是不错的第一选择，并且这也是非常有益的，以包括荧光脂质观察GUV增长，并从多层囊泡具有两个或更多个双层区分GUVs。脂的混合物可以通过组合储备溶液的SUV的混悬液来制备，如在（所提供的温度比任何单个的相变温度更高）的部分脱水步骤中的脂类混合。使用较高浓度的SUV（ 如10毫克/毫升）储备溶液允许相当大的灵活性，然后这些可稀释至3mg / ml的前脱水的悬浮液中。
如果试图适应这些协议对其他跨膜蛋白，它要能既直接观察蛋白的掺入GUVs和测试蛋白质的功能是非常重要的。而不是一个问题KvAP，总是存在的复水过程中的步骤的跨膜蛋白将留在薄膜叠层导致脂质仅GUVs形成的可能性。蛋白质的荧光标记是非常方便的，因为它提供了一种快速和明确的方式来观察蛋白质掺入GUVs并且还GUVs内检查聚合。这也是非常重要的，以测试在所述GUVs蛋白质功能，以确认该蛋白质在重组过程中不被损坏。离子通道像KvAP，膜片钳测量可以建立功能渠道的存在GUVs。然而，荧光标记，高亲和力配体（ 例如，毒素，衬底或反式体）也将用于测试的蛋白质的状态中GUVs非常有益的。
综上所述，本文演示了如何生成包含电压门控钾通道KvAP PROTEO-GUVs并用荧光显微镜和电生理特点他们。希望这些方法可以适用于新的类膜蛋白和用于研究和建立从它的基本组成部分生命物质提供更复杂的体外系统的基础。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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