Abstract
DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en almindeligt anvendt metode til kortlægning sekvenser til specifikke kromosomområder. Denne fremgangsmåde er særlig effektiv til at kortlægge stærkt repetitive sekvenser til heterochromatic regioner, hvor beregningsmæssige metoder står uoverkommelige udfordringer. Her beskriver vi en strømlinet protokol for DNA ISH der omgår formamid vaske, der er standard trin i andre DNA ISH-protokoller. Vores protokol er optimeret til hybridisering med korte enkeltstrengede DNA-prober, der bærer fluorescerende farvestoffer, som effektivt markerer repetitive DNA sekvenser i heterochromatic kromosomale regioner i en række forskellige insekt vævstyper. Dog kan ansøgninger forlænges til brug med større sonder og visualisering af enkelt kopi (ikke-repetitive) DNA-sekvenser. Vi viser denne metode ved at kortlægge flere forskellige repetitive sekvenser til knust kromosomer fra Drosophila melanogaster neurale celler og Nasoniavitripennis spermatocytter. Vi viser hybridiseringsmønstre til både små, kommercielt syntetiserede prober og for en større sonde til sammenligning. Denne procedure bruger simple laboratorium leverancer og reagenser, og er ideel til efterforskere, der har lidt erfaring med at udføre DNA ISH.
Introduction
DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en almindeligt anvendt metode til kortlægning sekvenser til specifikke kromosomområder. Sonder til enlige kopi regioner inden euchromatin kan genereres gennem en håndfuld af tilgange, herunder nick-translation eller ende-mærkning af lange DNA-produkter 1,2 og indarbejdelsen af deoxygenin (DIG) -attached nukleotider og deres anerkendelse gennem en bred vifte af gruppevise konjugerede antistoffer 1-3. Visualisering af euchromatic sekvenser i få eller enkelt eksemplar nummer kræver brug af enten enkelte, store prober med høj specifik aktivitet eller en cocktail af flere, mindre sonder, som tilsammen øger signal.
I modsætning hertil meget repetitive sekvenser findes i heterochromatin, såsom satellit DNA'er, er lettere mål for DNA ISH fordi de normalt eksisterer som ti til tusindvis af gentagelser grupperet i enkelte kromosomområder kendt som blokke. Transposoner kan også værefundet ved høje kopiantal på særskilte kromosomale loci 2. I disse tilfælde kan en enkelt prober med lav specifik aktivitet effektivt mærke heterochromatic sekvenser på grund af deres hybridisering ved multiple sites. Prober til repetitive sekvenser kan syntetiseres kommercielt som korte oligonukleotider (30-50 bp) og kemisk konjugeret med enhver af flere forskellige fluorescerende grupper. Kortlægning repetitive sekvenser inden heterochromatin ved at bruge genom-sekventering teknologier er vanskelig på grund af udfordringerne er stødt på i bygning stilladser indenfor meget gentagne satellit blokke 4-6,7. I øjeblikket ISH står som den mest effektive måde at kortlægge disse sekvenser på sub-kromosom-niveau. Denne strategi er vigtig for at kortlægge et stort antal repetitive sekvenser, der bliver afsløret løbende genom og transkriptom sekventering studier.
Effektiviteten og nem kortlægning repetitive sekvenser på slide-monterede kromosomer ville greatly forstærket af en forenklet protokol for DNA ISH. For eksempel de eksisterende protokoller for DNA ISH involverer flere vaske af hybridiseret væv i formamid løsning 2,8, således at tilføje væsentligt til den krævede tid til kortlægning sekvenser og også producerer store mængder kemisk affald for dette dyre reagens. Her beskriver vi en revideret DNA ISH metode, omgår behovet for formamid vaske og udnytter grundlæggende laboratorieudstyr og reagenser. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt udviklet til hurtig kortlægning af stærkt repetitive DNA-sekvenser i heterochromatic regioner af Drosophila larvestadiet neuroblasts ved anvendelse af kommercielt syntetiserede oligoer, der er konjugeret med fluorescensfarvestoffer. Men denne metode fungerer også til kortlægning repetitive sekvenser ved at anvende større prober syntetiseret ved andre midler 9,10 og på tværs af flere forskellige væv og kromosom typer. Derudover kan denne fremgangsmåde anvendes til at kortlægge euchromatic sekvenser ved hjælp af længere eller multiple, korte sonder i euchromatic sekvens af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tissue Dissektion og fiksering (60 min)
- For Drosophila hjerner, placere 3. instar larver i en dråbe 1x PBS (phosphatbufret saltvand). Vælg stor 3. instar larver, der aktivt kravler fra hætteglas eller flasker, der ikke er overfyldte.
- Brug en ultrafine pincet par at gribe fat i munden kroge og andet pincet par at Grib 2/3 ned på længden af kroppen (figur 1A, B). Træk forsigtigt på munden kroge til at udsætte hjernen, ventrale ganglier, spytkirtler og en del af larvestadiet fordøjelseskanalen. Brug en pincet til at adskille hjernen og ventrale ganglier (figur 1A, B) fra de andre væv og anbringes i en dråbe 1x PBT (phosphatpufret saltvand med Tween) på en plast Petri plade.
- For Nasonia testis dissektioner vælge mandlige 3 dage gammel pupper (gule organer med røde øjne). Mand Nasonia har små fløj pad længder i forhold til females under puppestadiet (figur 1C).
- Hold puppe i toppen af maven nær bryst region med en pincet par, og ved hjælp af den anden pincet par, tag fat i meget distale spids af maven og træk tåre-dråbeformede testikler (de vil være omgivet af fedt organ, der kan rystes blidt væk, Figur 1D). Frigør alle udvendige kropsdele fra testiklerne, som vil forhindre en ordentlig Squashing, og sted i en dråbe 1x PBT på en plast Petri plade.
- For hvert dias, dissekere alt fire eller fem vævsprøver (dvs.., Drosophila larver hjerne eller Nasonia testikler).
BEMÆRK: Mere end fem prøver vil føre til overfyldte kerner og kromosomer. - Eventuelt, for at opnå en vis adskillelse af søsterchromatider i euchromatic regioner af mitotiske kromosomer, behandle vævet med en hypotonisk opløsning: overføre hjerner fra 1x PBT til et fald på 0,5% natriumcitrat i 5-10 (ikke mere end 10) min.
BEMÆRK: Colchicin (en mitotisk inhibitor) kan være nyttigt til at øge antallet af mitotiske tal på metafase 11. Men dets anvendelse er unødvendig, hvis meget store sunde larver anvendes, og selv uønsket, fordi det kan have en negativ indflydelse på kromosom opløsning, spredning og morfologi. - Anbring en dråbe (~ 20 pi) af fikseringsopløsning (2,5% paraformaldehyd i 45% eddikesyre) på overfladen af en ren Sigmacote behandlet dækglas.
BEMÆRK: fikseringsopløsning frisk for hver dag i brug. Fiksativ løsninger lige fra 1,8 til 3,7% paraformaldehyd i 45% eddikesyre give de bedste resultater for fisk. Brug af andre end hjerner eller testikler væv, eller tilpasning af denne protokol for immuno-FISH kan kræve at eksperimentere med forskellige fikseringsmidler (for en liste over forskellige fikseringsmidler, se 12). - Overføre forsigtigt hver vævsprøve fra dissekere buffer (1x PBT) i fiksativ dråben med ultrafine pincetter, Minimizing overførsel af dissekering buffer i fikseringsopløsning. Placer vævsprøver, således at de er jævnt fordelt fra hinanden i fiksativ dråbe. Inkubér væv i fiksativ i 4 minutter ved stuetemperatur.
- Placer forsigtigt en poly-lysin-coatede slide nedad på væv og dækglasset. Tryk ikke ned på dette tidspunkt, men i stedet lade de to til at kontakte let, så dækglasset sticks på undersiden af dias. Vend det dias, så dækglasset er på toppen.
- Sandwich dias / væv / dækglas i en foldet stykke filtrerpapir. På en stabil overflade, ved hjælp af tommelfingeren at trykke meget kraftigt lige ned på position direkte over dækglasset. Vær omhyggelig med at undgå sideværts glidning af dækglasset (dette vil forårsage udtværing af vævet).
- Sænk slæden / væv / dækglas i flydende kvælstof (se apparat i figur 1E, F), og lad stå indtil Nitrogen stopper kogende (længere er fine). Fjern dias og straks bræk dækglasset med en frisk barberblad ved at knipse et hjørne af dækglasset i en opadgående retning (undgå at ridse fast væv med barberblad).
- Pre-afkøling af dias / væv / dækglas på en blok af tøris, dækglas, både i 1-2 minutter før nedsænkning i flydende nitrogen til at forhindre dias fra revner.
- Umiddelbart placerer objektglasset med vævet i en Coplin krukke fyldt med 100% ethanol ved stuetemperatur og lad stå i mindst 5 minutter (denne gang kan være længere, hvis nødvendigt).
BEMÆRK: Cold 100% ethanol kan også anvendes. - Fjern dias med væv, væge væk overskydende ethanol med en Kimwipe (uden at røre den faste væv), og lad den glide lufttørre i 1 time.
- Gå direkte til trin 2 eller holde dias tørre ved lav luftfugtighed eller i en udtørring kammer til uger til endda måneder, før du udfører hybridisering.
Figur 1: (A) En 3. instar Drosophila larve (til højre), med positioner angivet for hvor Grib munden kroge (angivet med *) og 2/3 af vejen ned larverne at dissekere hjerner; (Venstre) en skematisk afbildning af en larve en samme udviklingstrin, der viser den relative position af hjernen i larvernes hoved. (B) hjernen og ventrale ganglier dissekeret fra en 3 rd instar Drosophila larve (højre) og en skematisk afbildning af denne væv (til venstre). (C) 3 dage gamle Nasonia puppe på det gule legeme-røde øjne scenen. (D) en testikel par dissekeret fra en 3 dag gammel Nasonia mandlige puppe (til højre) med positioner angiver, hvor at fange den puppe ved den bageste af maven (betegnet med *) og halvvejs på kroppen; (Til venstre) skematisk skildrer mandlige og kvindelige varp pupper; mandlig pupper kan skelnes ved vinger, der ikke strækker sig forbi saggitale profil (sort pil), i modsætning til kvinder, som har vinger, der strækker sig forbi profilen; den relative position af testis par er vist i den mandlige puppe. (E) Apparatet-en streng af papirclips-og (F) metode til at fordybe dias i et kar med flydende nitrogen. Flere papirclips strenge kan bruges til samtidig nedsænkning af flere dias.
2. In situ hybridisering (30 min på dag 1; 1 hr-2,5 timer for lange prober-på dag 2)
- Tilsæt 1 pi (100 ng) af hver probe til 20 pi 1.1x hybridiseringspuffer. Pipetter probe / hybridiseringspuffer på overfladen af den faste væv (undgå at berøre væv).
- Placer forsigtigt et dækglas direkte på sonden / hybridiseringspuffer, og sørg for, at dækslet slip er centreret direkte over vævet. Bufferen skal migrere til the yderkanten af dækglasset, efterlader ingen luftbobler.
BEMÆRK: Små bobler, der ikke kontakte væv ikke udgør nogen problemer af proceduren. Fjern store bobler ved forsigtigt at løfte et hjørne af dækglasset og forsigtigt slippe den tilbage på dias. - Placér / væv / dækglas på overfladen af en blok forvarmet til 95 ° C (dækglas op). Dæk med et stort stykke aluminiumfolie for at forhindre udsættelse for lys. Lad slæden inkuberes ved 95 ° C i 5 min.
BEMÆRK: En typisk varme blok med huller til rør kan vendes til at give en flad overflade, som at placere dias / væv / dækglas. - Fjern dias, lade det køle lidt, indtil det er varmt at røre ved. Wrap forsigtigt et stykke strakt Parafilm omkring dækglasset at forsegle væsken under den.
- Anbring den forseglede glide inden et fugtighedskammer og placere kammeret i en inkubator forvarmet til 30 ° C. Inkuber ved 30 ° C i 4 timer til natten over.
- Opret en fugtighed kammer fra en tom spids boks eller låg Tupperware beholder med afdæmpede Kimwipes eller papirservietter placeret i bunden.
BEMÆRK: enkeltstrenget DNA oligo-prober er blevet designet til at være 28-33 baser for at opnå en teoretisk smeltetemperatur (T m) af 45-47 ° C. Disse længde og Tm intervaller afspejler det faktum, at mange repetitive sekvenser, som vi har studeret er AT-rige og har derfor meget lavt GC-indhold. Længere prober vil sandsynligvis have en højere Tm værdier; dette kan resultere i højere baggrund hybridisering ved standard hybridisering temperatur på 30 ° C. Således kan nogle fejlfinding med hybridiseringstemperaturer være forpligtet til at opnå de bedste resultater. For at finde den bedste hybridiseringstemperatur, stigning (eller fald) temperaturen med 5 ° C, trinvist.
- Opret en fugtighed kammer fra en tom spids boks eller låg Tupperware beholder med afdæmpede Kimwipes eller papirservietter placeret i bunden.
- Fjern forsigtigt Parafilm fra dias og derefter forsigtigt fjerne dækglasset ved langsomt at løfte det ene hjørne. Wash slæden tre gange i 15 minutter hver vask i 0,1 x SSC buffer. Dæk Coplin-skål med alufolie under vaskene for at minimere lys eksponering.
- Hvis du ikke bruger en lang biotinyleret probe, gå videre til trin 2.8.
- Hvis du bruger en lang biotinyleret probe, tørre området omkring vævet med en Kimwipe, og pas på ikke at røre ved vævet selv. Placer 100 pi blokerende opløsning i løbet af vævet og dækker forsigtigt med et dækglas, idet man undgå fældefangst bobler. Wrap glide over dækglasset med parafilm og sted ved 37 ° C i 30 minutter.
- Fjern forsigtigt dækglasset og duppes rundt vævet med en Kimwipe. Pipetter 100 ul rhodamin-avidin fortyndet 1: 1.000 i SBT i vævet og dækker forsigtigt med et dækglas, idet man for at undgå at fange bobler. Wrap glide over dækglasset med parafilm og sted ved 37 ° C i 30 minutter.
- Fjern forsigtigt dækglasset og vask slæden 3 gange i 5 min hver i 4x SSCT og derefter3 gange i 5 minutter hver i 0,1 x SSC.
BEMÆRK: Objektglassene kan vaskes i længere perioder.
- Fjern dias og duppes rundt vævet med en tør Kimwipe at fjerne overskydende buffer (undgå at berøre væv). Placer dias væv opad i et mørkt sted i 10-15 min, eller indtil fugten helt forsvinder.
- Pipetter 11 pi Vectashield mounting medium (med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol-DAPI) på vævet. Placer forsigtigt et rent dækglas (ikke behandlet med Sigmacote) direkte over midten af den stigende medium og væv. Monteringsdelen medium bør migrere langsomt udad mod kanterne af dækglasset.
BEMÆRK: Hvis monterings medium ikke nå kanten af dækglasset på alle sider, så en yderligere 1-2 pi montering medium kan anvendes til en position på kanten af dækglasset for at udfylde den nødvendige volumen. I dette tilfælde skal du huske at tørre overskydende medie fra slide overfladen førforsegling. - Seal kanterne af dækglasset med neglelak. Undgå male neglelak over vævsprøven.
- Placer dias oprejst i et mørkt sted og lad neglelak tørre indtil den er helt hård (normalt 30 minutter eller mere). På dette tidspunkt, image vævet eller opbevares ved -20 ° C i op til 1 uge senere billedbehandling.
Buffer / Solution Opskrifter
10x PBS
- 80 g NaCl
- 2,0 g KCI
- 14,4 g Na 2 HPO 4
- 2,4 g KH 2 PO 4
- pH til 7,4, H 2 O til 1 L
1x PBT
- 5 ml 10x PBS
- 45 ml H2O
- 0,1% Tween 20
20x SSC
- 175,3 g NaCl
- 88,2 g Na-citrat
- i 800 ml H2O
- pH til 7, H 2 O til 1 L
4x SSCT
- 200 ml 20x SSC
- 799 ml H 2
- 0,1% Tween 20
0,1X SSC
- 5 ml 20x SSC
- 995 ml H2O
Hybridiseringsblanding (20 pi; modificeret fra 11)
- 10 pi formamid
- 4 pi 50% dextransulfat
- 2 pi 20x SSC
- 4 pi H2O
SBT 8 (10 ml)
- 2 ml 20x SSC
- 0,01 g bovint serumalbumin (BSA)
- 10 pi Tween 20
- 7,9 ml H2O
Blokering opløsning 8 (10 ml)
- 0,3 g BSA
- 10 pi Tween 20
- 2 ml 20x SSC
- 8 ml H2O
Fikseringsopløsning med paraformaldehyd (1 ml)
- 393,75 pi H2O (tilsæt vand først)
- 450 pi iseddikesyre
- 156,25 pi 16% paraformaldehyd
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere denne fremgangsmåde vi hybridiserede et sæt af små kommercielt syntetiserede oligoer, der var kemisk modificeret med fluorescerende konjugater (figur 2), og en længere biotinyleret probe (fremstillet ved nick-translation af et PCR-produkt, figur 2B), til kromosomer fra flere forskellige væv typer (se tabel 1). Målsekvenserne inkluderet satellit gentagelser placeret i pericentromeric (heterochromatic) regioner af mitotiske kromosomer fra D. melanogaster larval neuroblaster (figur 2A-C) og meiotiske kromosomer fra puppe N. vitripennis testikler (Figur 2D). De hybridiseringer i hvert af disse tilfælde afslørede diskrete båndmønstre på sub-kromosomale regioner. Et punkt værd at nævne er, at sonden til D. melanogaster 359 bp satellit gentagelse genkender både en stor multi-megabase par blok på X, og en meget mindre område på kromosom 3(Figur 2A). En længere sonde mod Responder satellit registrerer også gentagne blokke bestående af relativt lave gentage kopiantal (~ 700 eksemplarer figur 2B). Således er denne fremgangsmåde tillader visualisering af meget små satellit blokke. For at hjælpe afsløre kromosom struktur og støtte i kromosom identifikation, kan det være nyttigt at behandle kromosomerne med en hypotonisk opløsning (beskrevet i trin 1.5). Væv i figur paneler 2B og 2C blev behandlet med en hypotonisk opløsning i 5 og 10 min. Bemærk adskillelsen af søsterchromatider er større med længere behandling (figur 2C).
Figur 2: DNA in situ hybridisering til (A) larver neuroblast kromosomer fra D. melanogaster /D. simulans hybrider, (B) og (C) larver neuroblast kromosomer fra D. melanogaster behandlet med hypotonisk opløsning (se Dissektion og fiksering trin 1), (D) meiotiske kromosomer fra puppe testikel væv i juvel hveps Nasonia vitripennis. I (A), grønne pile indikerer små områder af AATAT satellit på D. simulans 4. kromosom, mens den grønne pilespids point AATAT på D. melanogaster X-kromosom. Rød pil fremhæver en lille region af 359 bp satellit på D. melanogaster 3. kromosom, mens den røde pilespids markerer 359 bp sekvenser på X. Alle satellitter i (A) blev hybridiseret med korte, fluorescensmærkede oligoer. I (B), svarer det grønne signal til AAGAG satellit (syntetiseret oligo) og den røde signal er 120 bp Responder satellit (en biotinyleret probe; markeretmed røde pile). (C) Det samme Responder satellit med en kort fluorescensmærket oligo (røde pile). I (D), markerer en satellit, der er unikt placeret på Paternal Sex Ratio (PSR) kromosom, som er en ikke-essentiel, overtallig B kromosom findes i naturlige populationer af N. den røde pil vitripennis 13, mens den grønne pil viser en satellit på en af de normale kromosomer; denne hybridisering blev udført ved hjælp af korte, fluorescensmærkede oligoer. Alle prober er beskrevet i tabel 1. Scale bar i panel (A) er 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Probe navn | Probe typen | Oligoer | |
| AAGAG satellit | Oligo | (AAGAG) 7 | 5 '6-FAM (fluorescein) |
| AATAT satellit | Oligo | (AATAT) 6 | 5'-Cy3 |
| 359 bp satellit | Oligo | TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT | 5'-Alexa555 |
| PSR satellit | Oligo | TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA | 5'-Alexa555 |
| Nasonia Autosom satellit | Oligo | AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC | 5'-Alexa633 |
| Responder | PCR | F-5 'GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC | Biotin-14-dATP |
| R-5 'CCG AAT TCA AGT ACC AGA C |
Tabel 1: Probe, der anvendes i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA ISH bruges ofte til at kortlægge specifikke sekvenser til kromosomer. Vi har beskrevet en enkel metode til DNA ISH optimeret til højt kopiantal, heterochromatic sekvenser. Snarere end at bruge vaske i en formamid løsning, som er et krav i andre eksisterende DNA ISH-protokoller, lægger vi væv-monterede dias direkte på en forvarmet blok til denaturere DNA. Denne metode omgår anvendelsen af store mængder af formamid. Et afgørende skridt for at producere skarpe hybridiseringssignaler er at bruge frisklavet fiksering løsning; undladelse heraf (eller lave nye løsning med paraformaldehyd der har været åbne i mere end en måned) kan nedsætte signal opløsning. En begrænsning af denne fremgangsmåde er, ligesom for andre DNA ISH protokoller, hybridiseringstemperaturen kræve optimering for at eliminere falske hybridisering til off-målsekvenser.
Denne protokol er følsomme-korte, ssDNA sonder konjugeret med et enkelt fluorophore per molekyle kan registrere blokke af gentagelser med endnu relativt lave gentage kopiantal (fx ~ 700 RSP gentager, figur 2C). Signaler til satellit blokke med færre gentagelser kan visualiseres med korte ssDNA sonder ved hjælp af en meget følsom digitalkamera. Selv om det ikke er vist her, denne fremgangsmåde er også effektiv til kortlægning af ikke-repetitive sekvenser i euchromatin 10. Brug af lange, biotinylerede prober giver mere fleksibilitet til at opdage lave kopi nummerserier som signalet nemt kan forstærkes ved gentagne behandlinger af biotinyleret anti-avidin og rhodamin-avidin 9. At visualisere enkelt kopi-sekvenser, kan multiple prober spænder sekvensen være nødvendig. Alternativt kan bakterielle kunstige kromosomer (BAC'er) indeholdende sekvensen af interesse mærkes gennem nick translation eller tilfældig priming til anvendelse som en probe til ikke-repetitive sekvenser 10. At kortlægge sekvenser på en fin skala, prober rettet different gentagelser (hver med forskellige fluoroforer) kan samtidig anvendes til at opnå den position af målsekvenser i forhold til andre gentagelser og strukturelle vartegn på kromosomerne. Mens vi bruge to prober her (figur 2A, B, D), kan antallet af prober let øges til tre 10 eller mere, afhængigt af antallet af forskellige mikroskop fluorescens filtre til rådighed. Denne protokol kan udvides til andre væv-vi har bekræftet, at protokollen fungerer godt på polytene kromosom Græskar fra spytkirtlerne. Det er tænkeligt, at denne metode kobles med immunofarvning af chromatin proteiner; men det anbefales, at immuno-farvning udføres som et første skridt efterfulgt af re-fiksering med paraformaldehyd før DNA ISH for at forhindre antistof tab under DNA ISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich | ||
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont | ||
| 22 x 22 mm cover slips | Fisher | Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | |
| Sigmacote | Sigma | ||
| Filter paper | 75 - 150 mm | ||
| Paraffin wax paper | |||
| Heat block with thermometer | |||
| Dry incubator | |||
| Razor blades | |||
| Humidity chamber | empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes | ||
| Coplin jars | with slide grooves | ||
| Aluminum foil | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | |||
| Nail polish | clear or colored | ||
| P20 micropipette and plastic tips | |||
| Paperclips | 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain | ||
| Reagents | |||
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Liquid nitrogen | |||
| 100% Ethanol, chemical grade | |||
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |||
| Long biotinylated probe | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen | |
| Rhodamine-Avidin | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | for detection of long biotinylated probe | |
| Hybridization buffer | Recipe above | ||
| 4x SSCT | Recipe above | saline-sodium citrate + Tween | |
| 0.1x SSC | Recipe above | saline-sodium citrate | |
| Blocking solution | Recipe above | ||
| SBT | Recipe above | SSC, bovine serum albumin, Tween | |
| 1x PBT | Recipe above | phosphate-buffered saline + Tween | |
| 1x PBS | phosphate-buffered saline | ||
| Hypotonic solution | 0.5% sodium citrate in H2O | ||
| Formamide | Sigma Aldrich | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories | ||
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
