Enkel metode for fluorescens DNA<em> In Situ</em> Hybridisering til knust Kromosomer

Summary

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Abstract

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en mye brukt metode for kartlegging sekvenser til spesifikke kromosomregioner. Denne tilnærmingen er spesielt effektiv på kartlegging svært repetitive sekvenser til heterochromatic regioner, hvor beregnings tilnærminger står overfor uoverkommelige utfordringer. Her beskriver vi en strømlinjeformet protokoll for DNA ISH som omgår formamid vasker som er standardmåten i andre DNA ISH protokoller. Vår protokoll er optimalisert for hybridisering med korte enkeltkjedet DNA-prober som bærer fluorescerende fargestoffer, som effektivt markerer repetitive DNA-sekvenser innenfor heterochromatic kromosomale regioner over en rekke forskjellige insekter vevstyper. Imidlertid kan applikasjoner utvides til bruk med større prober og visualisering av enkeltkopi (ikke-repeterende) DNA-sekvenser. Vi viser denne metoden ved å kartlegge flere forskjellige repeterende sekvenser til klemt kromosomer fra Drosophila melanogaster nerveceller og Nasoniavitripennis spermatocytter. Vi viser hybridiserings- mønster for både små, kommersielt syntetiserte prober og for en større probe for sammenligning. Denne fremgangsmåten bruker enkle laboratorierekvisita og reagenser, og er ideell for etterforskere som har liten erfaring med å utføre DNA-ISH.

Introduction

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en mye brukt metode for kartlegging sekvenser til spesifikke kromosomregioner. Prober til enkeltkopi regioner innen eukromatin kan genereres gjennom en håndfull av tilnærminger inkludert nick-translasjon eller endemerking av lange DNA-produkt ^1,2 og inkorporering av deoxygenin (DIG) bundede nukleotider og deres gjenkjennelse gjennom en rekke gruppe konjugert antistoffer ^1-3. Visualisering av euchromatic sekvenser i få eller enkeltkopiantall krever bruk av enten enkle, store prober med høy spesifikk aktivitet, eller en blanding av flere, mindre prober som kollektivt forbedre signal.

I kontrast, svært repetitive sekvenser funnet i heterochromatin, for eksempel satellitt DNA, er enklere mål for DNA-ISH fordi de normalt eksistere som titalls til tusenvis av repetisjoner gruppert i enkelt kromosom områder kalt blokker. Transposable elementer kan også blifunnet ved høye kopiantall på distinkt kromosom loci ^to. I disse tilfeller kan enkle sonder med lav spesifikk aktivitet effektivt merke heterochromatic sekvenser på grunn av deres hybridisering på flere steder. Sonder til repeterende sekvenser kan syntetiseres kommersielt som korte oligonukleotider (30-50 bp) og kjemisk konjugert med noen av flere ulike fluorescerende grupper. Kartlegging repetitive sekvenser innenfor heterochromatin ved hjelp av genom-sekvensering teknologi er vanskelig på grunn av utfordringer i byggestillasene innenfor svært repetitive satellitt blokker ^4-6,7. Foreløpig ISH står som den mest effektive måten å kartlegge disse sekvensene på sub-kromosomnivå. Denne strategien er viktig for å kartlegge et stort antall repeterende sekvenser som blir avdekket av pågående genom og transkriptom sekvense studier.

Effektiviteten og enkel kartlegging repetitive sekvenser på glidemonterte kromosomer ville bli greatly forsterket av en forenklet protokoll for DNA ISH. For eksempel eksisterende protokoller for DNA ISH involvere flere vasker av hybridiserte vev i formamid løsning ^2,8, og dermed legge vesentlig til ønsket tid for kartlegging sekvenser og også produsere store mengder av kjemisk avfall for kostbar reagens. Her beskriver vi en revidert DNA ISH metode som omgår behovet for formamid vasker og utnytter grunnleggende laboratorieutstyr og reagenser. Denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for hurtig kartlegging av svært repetitive DNA-sekvenser i heterochromatic regioner av Drosophila larve neuroblasts ved hjelp av kommersielt syntetiserte oligonukleotider som er konjugert med fluorescerende fargestoffer. Men denne metoden fungerer også for å kartlegge repeterende sekvenser med å bruke større prober syntetisert gjennom andre virkemidler ^9,10 og på tvers av flere ulike vev og kromosom typer. I tillegg kan denne metoden brukes til å kartlegge euchromatic sekvensene ved hjelp av lengre eller multiple, korte sonder innenfor euchromatic sekvens av interesse.

Protocol

1. Tissue Dissection og Fiksering (60 min) For Drosophila hjerner, plasserer 3. stadium larver i en dråpe 1x PBS (fosfatbufferet saltvann). Velg store 3. stadium larver som er aktivt kryp fra ampuller eller flasker som ikke er overbefolket. Bruk en ultrafine pinsetten par å gripe tak i munnen kroker og en annen pinsetten par å ta 2/3 ned lengden på kroppen (Figur 1A, B). Dra forsiktig i munnen kroker å utsette hjernen, ventral ganglia, spyttkjertler og en d…

Representative Results

For å demonstrere denne metoden, hybridisert vi et sett av små kommersielt syntetiserte oligonukleotider som ble kjemisk modifisert med fluorescerende konjugater (figur 2) og en lengre biotinylert probe (laget ved nick-translasjon av et PCR-produkt; figur 2B), for å kromosomer fra flere forskjellige vev typer (se tabell 1). De målsekvenser inkludert satellitt gjentar lokalisert i pericentromeric (heterochromatic) regioner av mitotiske kromosomer fra D. melanogas…

Discussion

DNA ISH er ofte brukt for å kartlegge spesifikke sekvenser til kromosomer. Vi har beskrevet en enkel metode for DNA ISH optimalisert for høyt kopiantall, heterochromatic sekvenser. Snarere enn å bruke vasker i formamider løsning, noe som er et krav i andre eksisterende DNA ISH protokoller, vi plassere vev-monterte lysbilder direkte på en forvarmet blokk å denaturere DNA. Denne fremgangsmåte omgår bruken av store mengder av formamid. Ett viktig skritt for å produsere skarpe hybridiseringssignaler er å bruke fer…

Materials

	Company
Materials
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)	Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge)	Dumont
22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear	Fisher
Sigmacote	Sigma
Filter paper (75-150mm)
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)
Coplin jars (with slide grooves)
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 mL microfuge tubes
Nail polish (clear or colored)
2-20 μL micropipette and plastic tips
20-25 standard metal paperclips linked to form a chain
	Company/Notes
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde	Electron Microscopy Reagents
Acetic acid	Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)	Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)	Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Hybridization buffer	Recipe below
4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)	Recipe below
0.1X SSC (Saline-sodium citrate)	Recipe below
Blocking solution	Recipe below
SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)	Recipe below
1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)	Recipe below
1X PBS (Phosphate-buffered saline)
Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector laboratories