שיטה פשוטה DNA הקרינה<em> באתר</em> הכלאה לכרומוזומים "סתמת
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
DNA הכלאה באתר (DNA ISH) הוא שיטה נפוצות לרצפי מיפוי לאזורים של כרומוזום מסוימים. גישה זו היא יעילה במיוחד במיפוי רצפים חוזרים מאוד לאזורי heterochromatic, שבו גישות חישוביות להתמודד עם אתגרי אוסרני. כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל עבור DNA ISH שעוקף שוטף פוראמיד שהם צעדים סטנדרטיים בפרוטוקולי DNA ISH אחרים. הפרוטוקול שלנו מותאם להכלאה עם בדיקות יחידים קצרות גדיל DNA שנושאים צבעי ניאון, אשר למעשה לסמן רצפי DNA חוזר על עצמו באזורי כרומוזומים heterochromatic על פני מספר סוגים שונים של רקמות חרקים של. עם זאת, יישומים ניתן להאריך להשתמש עם בדיקות ויזואליזציה של רצפי DNA עותק יחיד (לא חוזר על עצמו) גדולים יותר. אנו מדגימים שיטה זו על ידי מיפוי כמה רצפים חוזרים שונים לכרומוזומים מעוכים מדרוזופילה melanogaster תאים עצביים וNasoniaspermatocytes vitripennis. אנחנו מראים דפוסי הכלאה של שני חלליות קטנות, מסונתזים באופן מסחרי ולבדיקה גדולה יותר להשוואה. הליך זה משתמש ציוד מעבדה פשוט וריאגנטים, והוא אידיאלי לחוקרים שיש להם ניסיון מועט עם ביצוע DNA ISH.
Introduction
DNA הכלאה באתר (DNA ISH) הוא שיטה נפוצות לרצפי מיפוי לאזורים של כרומוזום מסוימים. יכולות להיות שנוצרו בדיקות לאזורי עותק יחידים בתוך euchromatin באמצעות קומץ של גישות, כולל nick-תרגום או בסופו תיוג של מוצרי DNA ארוכים 1,2 ושילוב של deoxygenin (DIG) נוקלאוטידים -attached וההכרה שלהם באמצעות מגוון רחב של נוגדנים-מצומדות קבוצה 1-3. ויזואליזציה של רצפי euchromatic בעותק מספר מעטים או בודד מחייבת השימוש בשני בדיקות יחידים, גדולות עם פעילות ספציפית גבוהה או קוקטייל של בדיקות מרובות, קטנות יותר, כי באופן קולקטיבי לשפר אות.
בניגוד לכך, חוזר על עצמו מאוד רצפים נמצאו בheterochromatin, כגון DNAs לווין, הם מטרות קלים יותר לDNA ISH מכיוון שהם קיימים בדרך כלל כעשרות אלפי חזרות התקבצו באזורי כרומוזום יחידים הידועים כלוקים. אלמנטים ניידים גם יכולים להיותנמצא במספרים גבוהים בעותק לוקוסי כרומוזומליות שונים 2. במקרים אלה, בדיקות יחידים עם פעילות ספציפית נמוכה יכולות למעשה תווית רצפי heterochromatic בשל ההכלאה שלהם באתרים מרובים. בדיקות רצפים חוזרים יכולות להיות מסונתזת oligonucleotides הקצר מסחרי כ( 30-50 נ"ב) וכימיות מצומדות עם כל קבוצות ניאון שונות מרובות. מיפוי רצפים חוזרים בתוך heterochromatin על ידי שימוש בטכנולוגיות הגנום רצף קשה בשל אתגרים נתקלו בפיגומי בניין בלוקי לווין חוזר על עצמו מאוד 4-6,7. נכון לעכשיו, איש עומד כדרך היעילה ביותר למיפוי רצפים אלה ברמה תת-כרומוזום. אסטרטגיה זו היא חשובה למיפוי מספרים גדולים של רצפים חוזרים הנחשפים על ידי מחקרי הגנום ורצף transcriptome מתמשכים.
היעילות וקלות רצפים חוזרים מיפוי על כרומוזומים רכוב שקופיות תהיה GREמשופר atly על ידי פרוטוקול פשוט לDNA ISH. לדוגמא, פרוטוקולים קיימים לDNA ISH כרוכים שטיפות מרובות של רקמות הכלאה בפתרון פוראמיד 2,8, ובכך להוסיף משמעותי את הזמן הנדרש לרצפי מיפוי וגם לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית למגיב יקר זה. כאן אנו מתארים שיטת DNA ISH מתוקנת שעוקפת את הצורך בשטיפת פוראמיד ומשתמש בציוד מעבדה בסיסי וחומרים כימיים. שיטה זו תוכננה במקור למיפוי המהיר של רצפי DNA חוזר על עצמו מאוד באזורי heterochromatic של neuroblasts זחל תסיסנית באמצעות oligos מסונתז מסחרי המצומדות עם צבעי הקרינה. עם זאת, שיטה זו פועלת גם למיפוי רצפים חוזרים באמצעות בדיקות גדולות יותר מסונתזים באמצעים אחרים 9,10 ועל פני סוגי רקמות וכרומוזום שונים מרובים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי למפות רצפי euchromatic באמצעות יותר או multiple, בדיקות קצרות בתוך רצף euchromatic של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA ISH משמש לעתים קרובות כדי למפות רצפים ספציפיים לכרומוזומים. שתארנו שיטה פשוטה לDNA ISH מותאם לגבוה עותק מספר, רצפי heterochromatic. במקום להשתמש בשטיפות בתמיסת פוראמיד, אשר היא דרישה בפרוטוקולי ISH DNA קיימים אחרים, אנו שמים שקופיות רכוב רקמה ישירות על בלוק מחומם מראש ללפגל DNA. שי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
