Abstract
原位杂交（ISH的DNA）的DNA是一种常用的方法进行映射的序列，以特定的染色体区域。这种方法是在映射高度重复序列，以异染色质区域，其中，计算方法面临令人望而却步的挑战特别有效。在这里，我们描述了一个精简的协议，用于DNA ISH是规避洗甲酰胺是在其他DNA ISH协议的标准步骤。我们的协议被优化用于与携带荧光染料，从而有效地标记在多个不同的昆虫组织类型的异色染色体区域内的重复DNA序列的短单链DNA探针杂交。然而，应用程序可被扩展较大探针和单拷贝（非重复）的DNA序列的可视化中使用。我们证明了该方法通过映射几个不同的重复序列从果蝇染色体挤压神经果蝇细胞和金小蜂vitripennis精母细胞。我们表明杂交模式均小，商业合成的探针和用于比较的较大探针。此过程使用简单的实验室耗材和试剂，是理想的谁与执行DNA ISH一点经验调查。
Introduction
原位杂交（ISH的DNA）的DNA是一种常用的方法进行映射的序列，以特定的染色体区域。可以通过少数的方法，包括缺口转译或长DNA产物1,2-末端标记和deoxygenin（DIG）的掺入-attached核苷酸及其识别通过各种各样的产生内常染色质探针，以单拷贝区基的缀合抗体1-3。在几个或单拷贝数常染色体序列的可视化需要使用任何单一的大型探测器具有高比活或多个较小的探针共同增强信号的鸡尾酒。
与此相反，在异发现高度重复序列，诸如卫星的DNA，是用于DNA ISH更容易的目标，因为它们通常作为几十到重复聚集在被称为块的单染色体区域的数千存在。转座元件也可以是在不同的时染色体位点2个高拷贝数发现。在这些情况下，单个探针具有低比活性可以有效标记异色序列由于在多个位点的杂交。探针的重复序列可被合成市售的短的寡核苷酸（30-50碱基对）和化学缀合与任何多种不同的荧光团。通过基因组测序技术绘制内异染色质重复序列是困难的，因为在高度重复的卫星模块4-6,7建筑脚手架遇到的挑战。目前，ISH站作为在子染色体水平映射这些序列的最有效的方法。这种策略是映射大批正在通过发现正在进行的基因组和转录组测序研究的重复序列的重要。
映射重复序列上滑动安装染色体的效率和易于将选取gre通过对DNA ISH简化协议atly增强。例如，对于DNA的ISH现有的协议涉及杂交的组织中的甲酰胺溶液2,8-多次洗涤，从而增加大致映射序列所需的时间，也产生这种昂贵试剂的大量化学废物。在这里，我们描述了一个修订后的DNA ISH方法规避，需要甲酰胺清洗，并利用基本的实验室设备和试剂。该方法最初是通过使用缀合有荧光染料商业合成的寡核苷酸设计为在果蝇幼虫的神经母细胞异染色质区域高度重复的DNA序列的快速映射。但是，这种方法也适用于通过使用通过其他方式9,10和跨多个不同的组织和染色体类型合成更大的探针映射重复序列。此外，此方法可用于通过使用较长或MULTIP映射常染色质的序列乐，感兴趣的常染色体序列中短探针。
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Protocol
1.组织解剖和固定（60分钟）
- 对果蝇的大脑，放在第三龄幼虫在下降的1×PBS（磷酸盐缓冲盐水）中。选择大的3 龄幼虫正在积极从小瓶或瓶子是不是人满为患爬行。
- 用一个镊子超细对抓牢口钩，另一镊子对抢2/3下来身体（ 图1A，B）的长度。上嘴钩轻轻一拉，露出大脑，腹侧神经节，唾液腺及部分幼虫消化道。使用镊子分离脑和腹侧神经节（ 图1A，B）中从其他组织中，并装在1倍的PBT（磷酸盐缓冲盐水与吐温）上的塑料培养皿的液滴。
- 对于金小蜂睾丸的解剖，选择男3日龄蛹（黄体红色的眼睛）。男金小蜂有小翼片的长度相对到f在蛹期（ 图1C）emales。
- 握住蛹在与一个镊子对，并使用其他镊子对胸部区域附近的腹部的上，抓住腹部的很远尖端和拉出泪滴形睾丸（它们将被脂肪包围体，可以轻轻摇动走; 图1D）。断开任何外部车身零件的睾丸，这将妨碍正常的挤压，并将其放置在1X PBT上的塑料培养皿液滴。
- 对于每一个幻灯片，解剖一共有四五个组织样本（ 即 ， 果蝇幼虫大脑和睾丸金小蜂 ）。
注：以上五个样本会导致过度拥挤的细胞核和染色体。 - 可选地，为了实现在有丝分裂的染色体常染色质区域姐妹染色单体的一些分离，治疗用低渗溶液的组织：从1倍的PBT（传送到大脑的下降为0.5％的柠檬酸钠5-10不超过10）分钟。
注：秋水仙碱（有丝分裂抑制剂）可以增加核分裂象数量在中期11有益的。但是，它的使用是不必要的，如果非常大的健康的幼虫被使用，并且甚至不希望的，因为它可以在染色体分辨率产生负面影响，传播和形态。 - 放置的固定液（45％乙酸的2.5％多聚甲醛）倒在干净Sigmacote处理的盖玻片的表面上的液滴（约20微升）。
注意：请固定液新鲜使用的每一天。固色剂解决方案，从1.8-3.7％多聚甲醛在45％的醋酸产量FISH最好的结果。用面巾纸比大脑和睾丸等，或者此适配协议免疫FISH可能需要与不同的固定剂试验（针对不同的固定剂的列表，请参阅12）。 - 小心地从解剖缓冲液（1×PBT）每一组织样品与超细镊子，米尼米转移到固定剂液滴查懋解剖缓冲器入固定液的转移。定位的组织样本，使得它们被均匀地彼此间隔开的固定剂液滴内。孵育在固定液组织在室温下4分钟。
- 小心地将聚赖氨酸涂覆的滑动面向下到组织和盖玻片。不按下在这一点上，而是允许两个接触轻轻使盖玻片粘到滑动的下侧。倒置滑动，使得盖片是在顶部。
- 夹心折叠一张滤纸内部幻灯片/组织/盖玻片。在一个稳定的表面，用拇指，按非常坚定地直下到盖玻片上方的位置。小心避免横向盖玻片滑动（这将导致涂抹组织）。
- 淹没在滑动/组织/盖玻片入液氮（ 见图1E，女装置），并且静置直至氮停止沸腾（长为fINE）。取出载玻片，并立即通过轻弹盖玻片的角在向上方向上（避免刮伤固定的组织与剃刀刀片）折断盖玻片用新鲜刀片。
- 预冷幻灯片/组织/盖干冰块上滑，盖滑起来，1-2分钟浸入液态氮将有助于防止开裂的幻灯片之前。
- 立即用纸巾滑动放入一个科普林缸填充100％的乙醇在室温下，静置至少5分钟（如果需要，这个时间可以更长）。
注：冷100％乙醇也可以使用。 - 删除与组织滑动，毛细作用带走用Kimwipe过量乙醇（而不触及固定的组织），并离开该滑动风干1小时。
- 直接进入第2步或保存幻灯片干燥低湿度空气中或在干燥室周来进行杂交之前甚至几个月。
图1：与在那里抢口钩显示位置（A）A 3 路龄幼虫果蝇 （右一），（表示带*号）和下幼虫解剖大脑的方式2/3; （左）的概略幼虫一个相同发育阶段的，描绘了幼虫头部内脑的相对位置。（B）中的脑和腹侧神经节从一个第三龄果蝇幼虫（右）和本示意解剖组织（左）。（C）3日龄蛹金小蜂在黄体红眼阶段。（D）睾丸对从3日龄金小蜂的蛹男（右）与解剖位置，表示从哪里抢蛹在腹部的后（标以*）和中途上的主体; （左）示意描绘男性和女性是P蛹;雄性蛹可以通过翼不延伸超过矢状轮廓（黑色箭头），而相比之下，雌性，其具有翼延伸过去的信息来区分;睾丸对的相对位置示于阳蛹。纸夹-和（F）的方法，用于浸泡在液氮的容器幻灯片（E）的装置， -一个字符串。可用于对多张幻灯片同时浸没多个回形针字符串。
2. 在原位杂交（30月1日分; 1小时，2.5小时长探头，第2天）
- 加入1μl每种探针的（100毫微克），以20微升1.1倍的杂交缓冲液中。吸管探针/杂交缓冲液到固定组织的表面（避免触及组织）。
- 小心直接置于盖玻片上的探针/杂交缓冲液中，并确保盖玻片工作在组织直接居中。该缓冲区应该迁移到THË盖玻片的外缘，不留气泡。
注：小气泡不接触组织不会造成任何问题的程序。通过仔细抬起盖玻片的一个角落里，小心地放弃它返回到幻灯片中删除大量气泡。 - 将幻灯片/组织/盖玻片到块预加热到95°C（盖滑起来）的表面。有一大块铝箔盖，以防止曝光。让滑动孵育在95℃下5分钟。
注意：有孔典型热块管可以翻转，提供在其上放置幻灯片/组织/盖玻片一个平面上。 - 去除幻灯片，让它稍微冷却，直到它是温暖的触感。精心包装了一块拉伸封口膜周围的盖玻片密封它下面的液体。
- 放置一个湿度室内部的密封滑动，并把该室到预热至30℃的培养箱。孵育在30℃下进行4小时至过夜。
- 创建湿度室从空尖框或带盖百惠容器放置在底部阻尼的Kimwipes或纸巾。
注：单链DNA寡核苷酸探针被设计为28-33个碱基，达到45-47℃的理论上的熔解温度（T M）。这些长度和T 米范围反映的事实是，我们已经研究了很多重复序列是富含AT的，因此具有非常低的GC含量。较长的探针将可能有较高的Tm 值值;这可能会导致在30℃的标准杂交温度更高的背景杂交。因此，随着杂交温度一些故障，可能需要以达到最佳的效果。找到最好的杂交温度，增加（或减少）由5℃的温度下，增量。
- 创建湿度室从空尖框或带盖百惠容器放置在底部阻尼的Kimwipes或纸巾。
- 仔细从幻灯片中删除封口膜，然后慢慢抬起一个角落里小心地取出盖玻片。华SH幻灯片三次15分钟的0.1X SSC缓冲每次洗。在洗涤覆盖科普林缸用铝箔，以减少曝光。
- 如果不使用长生物素化的探针，继续执行步骤2.8。
- 如果使用的是长的生物素化的探针，干周围用Kimwipe组织的区域，小心不要触碰组织本身。放置100微升封闭溶液在组织中并用盖玻片覆盖轻轻，注意避免俘获气泡。包住滑过盖玻片用Parafilm和地点，在37℃下进行30分钟。
- 小心地取出盖玻片和周围涂抹用Kimwipe组织。吸取100μl的若丹明 - 亲和素稀释1：1000在SBT过组织并覆盖轻轻用盖玻片，注意避免俘获气泡。包住滑过盖玻片用Parafilm和地点，在37℃下进行30分钟。
- 小心地取出盖玻片和5分钟洗滑3次，每次在4倍SSCT然后3次，每次5分钟，在0.1×SSC。
注：幻灯片可水洗的时间较长。
- 去除幻灯片及吸干组织周围用干的Kimwipe以去除多余的缓冲液（避免接触的组织）。放置在滑动组织朝上，在暗处10-15分钟或直至水分完全消散。
- 吸管11微升的Vectashield封固剂（有4'，6-二脒基-2-苯基 - DAPI）到组织上。小心地将一个干净的盖玻片（不与Sigmacote处理）的正上方的安装介质和组织的核心。安装介质应当向外迁移缓慢地向盖玻片的边缘。
注：如果在安装介质无法到达所有各方盖玻片的边缘，再追加1-2微升封固剂可以施加到一个位置，在该盖片的边缘，以填补在所需体积。在这种情况下，可以肯定之前擦去从滑动表面上的任何多余的介质密封。 - 密封盖玻片指甲油的边缘。避免涂抹指甲油在组织样本。
- 放置在滑动直立在暗处，并让指甲油干燥直至完全硬（通常为30分钟以上）。在这一点上，图像中的组织或储存在-20℃下长达1周后成像。
缓冲/解决方案食谱
10X PBS
- 80克氯化钠
- 2.0克氯化钾
- 14.4克的Na 2 HPO 4
- 2.4克KH 2 PO 4的
- pH值至7.4，H 2 O到1升
1X PBT
- 5毫升10X PBS
- 45毫升H 2Ø
- 0.1％吐温20
20X SSC
- 175.3克氯化钠
- 88.2克柠檬酸钠
- 800毫升水2 O
- pH值7，H 2 O到1升
4X SSCT
- 200毫升20X SSC
- 799毫升的H 2
- 0.1％吐温20
0.1X SSC
- 5毫升20X SSC
- 995毫升H 2Ø
杂交混合物（20微升;从11修改）
- 10微升甲酰胺
- 4微升50％硫酸葡聚糖
- 2微升20X SSC
- 4微升水中2 O
SBT 8（10毫升）中
- 2毫升20X SSC
- 0.01克牛血清白蛋白（BSA）的
- 10微升吐温20
- 7.9毫升H 2Ø
封闭溶液8（10毫升）中
- 0.3克BSA
- 10微升吐温20
- 2毫升20X SSC
- 8毫升H 2Ø
用多聚甲醛固定液（1毫升）中
- 393.75微升H 2 O（先加水）
- 450微升冰醋酸
- 156.25微升16％多聚甲醛
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Representative Results
为了证明这种方法，我们杂交的一组小，以致被化学修饰的荧光偶联物（ 图2）和一个较长的生物素化的探针商业合成的寡核苷酸（通过PCR产物的切口平移制成; 图2B），以染色体从几个不同的组织类型（ 见表1）。目标序列包括位于从D.有丝分裂染色体着丝粒（异）地区的卫星重复果蝇幼虫神经母细胞（ 图2A-C）和减数分裂染色体从蛹N. vitripennis睾丸（ 图2D）。在每一种情况下的杂交揭示离散的带型在子的染色体区域。值得一提的是，探头的D.果蝇 359 bp的卫星重复识别在X既有大型多兆碱基对的块，并在3号染色体小得多区域（ 图2A）。对响应卫星更长的探头还检测到重复的块组成的相对较低的重复拷贝数（〜700份; 图2B）。因此，该方法允许非常小的卫星块可视化。为了帮助揭示染色体结构，并有助于染色体鉴定，它可以是治疗染色体用低渗溶液（在步骤1.5中所述）是有用的。用低渗溶液，在图板2B和2C的组织进行处理5分钟和10分钟分别。注意姐妹染色单体的分离是更大的更长的治疗（ 图2C）。
图2：DNA 原位杂交（A）从D.幼虫成神经细胞的染色体果蝇 /D. simulans杂种;（B）和（C）的幼虫成神经细胞从D染色体果蝇治疗低渗溶液（见解剖和固定步骤1）;（D）从宝石黄蜂金小蜂vitripennis蛹睾丸组织中减数分裂染色体。在（A）中 ，绿色箭头表示AATAT卫星上的D.小区域simulans 第 4染色体，而绿色箭头指向AATAT上D.果蝇 X染色体。红色箭头突出的359 bp的卫星小区域的D.果蝇 第三染色体，而红色箭头标记359 bp的序列的十中（A）的所有卫星进行杂交短，荧光标记的寡核苷酸。在（B）中 ，在绿信号对应于AAGAG卫星（合成低聚）和红色信号是120bp的响应卫星（生物素化的探针;标用红色箭头）。（C）的同样的响应卫星具有短荧光标记的寡（红色箭头）。在（D），红色箭头标志着卫星是唯一位于父系性别比（PSR）染色体，这是N的自然种群中的非必需的，编外B染色体vitripennis 13，而绿色箭头表示对正常的染色体中的一个卫星;这种杂交通过使用短，荧光标记的寡核苷酸进行。所有探头都详见表1。比例尺面板（A）为10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 探测器名称 | 探头类型 | 寡 | |
| AAGAG卫星 | 寡 | （AAGAG）7 | 5'6-FAM（荧光素） |
| AATAT卫星 | 寡 | （AATAT）6 | 5'-Cy3的 |
| 359-BP卫星 | 寡 | TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT | 5'-的Alexa555 |
| PSR卫星 | 寡 | TGT AAC TGG AGG AAA AAA ATG TAT TAT TGA | 5'-的Alexa555 |
| 金小蜂常染色体卫星 | 寡 | AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC | 5'-Alexa633 |
| 响应 | PCR | F-5'AAA GGA TCA CCC ATT TTG ATC GC | 生物素 - 14的dATP |
| R-5'CCG AAT TCA AGT ACC AGAÇ |
表1：探针在图2中使用的类型。
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Discussion
DNA的原位杂交是经常用于映射特定序列的染色体。我们描述了一个简单的方法DNA ISH高拷贝数，异色序列优化。而不是使用洗涤的甲酰胺溶液中，这是在其他现有的DNA ISH协议的要求，我们直接放置在预加热块组织安装滑动到使DNA变性。这种方法绕过了使用大量的甲酰胺。用于产生脆的杂交信号的一个关键步骤是使用新鲜制备的固定溶液;如果不这样做（或者使用多聚甲醛是已经开放超过一个月新溶液）可能会降低信号的分辨率。这种方法的一个限制是，像用于其它DNA ISH协议中，杂交温度，可能需要优化，以消除杂散杂交脱靶序列。
这个协议是结合有单fluorop敏感短路，单链DNA探针每分子hore可以检测重复的块与甚至相对低的重复拷贝数（ 例如，〜700 Rsp时重复; 图2C）。信号，以具有较少的重复卫星块可被可视化的短单链DNA探针通过使用一个高度敏感的数码相机。虽然这里未示出，这种方法也是有效的在常染色质10映射的非重复序列。使用长，生物素化的探针提供了在检测到低拷贝数序列作为信号可以容易地通过重复处理来扩增更灵活的生物素化的抗生物素蛋白和罗丹明-抗生物素蛋白9。为了显现单拷贝序列，多个探针跨越序列可能是必要的。或者，含有目的序列的细菌人工染色体（BAC），可以通过切口平移或随机引物用作探针用于非重复序列10进行标记。要映射序列在判罚尺度，探头瞄准differen吨重复（每个具有不同的荧光团）可同时使用，以获得相对于其它重复和在染色体的结构标靶序列的位置。而我们使用两个探针此处（ 图2A，B，D），探针的数目可以容易地提高到3 10个或更多，这取决于可用的不同显微镜的荧光过滤器的数量。该协议可以扩展到其他组织，我们已经验证了协议的工作以及在多线染色体南瓜从唾液腺。可以想象的是，这种方法可以结合免疫染色的染色质蛋白;然而，建议免疫染色来执行作为第一步骤，并随后重新固定用多聚甲醛的DNA ISH之前，以防止DNA的原位杂交中的抗体损失。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich | ||
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont | ||
| 22 x 22 mm cover slips | Fisher | Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | |
| Sigmacote | Sigma | ||
| Filter paper | 75 - 150 mm | ||
| Paraffin wax paper | |||
| Heat block with thermometer | |||
| Dry incubator | |||
| Razor blades | |||
| Humidity chamber | empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes | ||
| Coplin jars | with slide grooves | ||
| Aluminum foil | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | |||
| Nail polish | clear or colored | ||
| P20 micropipette and plastic tips | |||
| Paperclips | 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain | ||
| Reagents | |||
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Liquid nitrogen | |||
| 100% Ethanol, chemical grade | |||
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |||
| Long biotinylated probe | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen | |
| Rhodamine-Avidin | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | for detection of long biotinylated probe | |
| Hybridization buffer | Recipe above | ||
| 4x SSCT | Recipe above | saline-sodium citrate + Tween | |
| 0.1x SSC | Recipe above | saline-sodium citrate | |
| Blocking solution | Recipe above | ||
| SBT | Recipe above | SSC, bovine serum albumin, Tween | |
| 1x PBT | Recipe above | phosphate-buffered saline + Tween | |
| 1x PBS | phosphate-buffered saline | ||
| Hypotonic solution | 0.5% sodium citrate in H2O | ||
| Formamide | Sigma Aldrich | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories | ||
References
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