Méthode simple pour l'ADN fluorescence<em> In Situ</em> Hybridation des chromosomes écrasé

Summary

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Abstract

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Cette approche est particulièrement efficace pour la cartographie des séquences hautement répétitives à des régions hétérochromatiques, où les approches de calcul face à des défis prohibitifs. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour l'ADN ISH qui contourne lavages formamide qui sont des mesures standard dans d'autres protocoles ADN ISH. Notre protocole est optimisé pour l'hybridation avec de courtes sondes d'ADN simple brin qui transportent des colorants fluorescents, qui marquent efficacement des séquences d'ADN répétitives à l'intérieur des régions chromosomiques hétérochromatiques dans un certain nombre de types de tissus de différents insectes. Toutefois, les applications peuvent être étendues à utiliser avec des sondes et la visualisation de séquences d'ADN copie unique (non répétitive) grands. Nous démontrons cette méthode en cartographiant plusieurs différentes séquences répétitives à des chromosomes de Drosophila melanogaster écrasés cellules neurales et Nasoniavitripennis spermatocytes. Nous montrons schémas d'hybridation pour les deux petites sondes, synthétisées dans le commerce et pour une plus grande sonde pour comparaison. Cette procédure utilise des consommables et réactifs de laboratoire simples, et est idéal pour les enquêteurs qui ont peu d'expérience avec l'exécution de l'ADN ISH.

Introduction

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Sondes aux régions à copie unique dans euchromatine peuvent être générés par une poignée d'approches, y compris translation de coupure ou la fin-étiquetage des produits de ^1,2 ADN longues et l'incorporation de deoxygenin (DIG) nucléotides -attached et leur reconnaissance à travers une grande variété de conjugué anticorps-groupe ^1-3. Visualisation des séquences euchromatiques dans peu ou seul numéro de copie nécessite l'utilisation soit simples, grandes sondes ayant une activité spécifique élevée ou un cocktail de plusieurs petites sondes, qui améliorent collectivement signaux.

En revanche, les séquences hautement répétitives trouvés dans hétérochromatine, comme ADN satellites, sont des cibles plus faciles pour l'ADN ISH parce qu'ils existent normalement que des dizaines de milliers de répétitions groupées dans les régions chromosomiques simples appelés blocs. Les éléments transposables peuvent également êtretrouvé à grand nombre de copies à distincte loci chromosomiques ^2. Dans ces cas, les sondes simples avec faible activité spécifique peuvent effectivement étiqueter séquences hétérochromatiques en raison de leur hybridation à plusieurs sites. Sondes à séquences répétitives peuvent être synthétisés oligonucléotides commercialement aussi courtes (30-50 pb) et chimiquement conjugués avec une des multiples différents groupes fluorescents. Cartographie de séquences répétitives au sein hétérochromatine en utilisant des technologies de séquençage des génomes est difficile en raison de difficultés rencontrées dans les échafaudages de construction dans les blocs de satellites hautement répétitives ^4-6,7. Actuellement, ISH se présente comme le moyen le plus efficace de la cartographie de ces séquences au niveau des sous-chromosome. Cette stratégie est importante pour cartographier un grand nombre de séquences répétitives qui sont découverts par des études génomiques et de séquençage du transcriptome en cours.

L'efficacité et la facilité de cartographie des séquences répétitives sur les chromosomes de diapositives montées seraient GREatly renforcée par un protocole simplifié pour l'ADN ISH. Par exemple, les protocoles existants pour l'ADN ISH impliquent de multiples lavages de tissus hybrides en solution formamide ^2,8, ajoutant ainsi sensiblement au temps requis pour les séquences de cartographie et de produire de grandes quantités de déchets chimiques pour ce réactif coûteux. Nous décrivons ici un procédé ADN ISH révisé qui contourne la nécessité de lavages formamide et utilise le matériel et les réactifs de laboratoire de base. Cette méthode a été initialement conçu pour la cartographie rapide de séquences d'ADN hautement répétitives dans des régions hétérochromatiques neuroblastes larves de Drosophila en utilisant les oligos de synthèse dans le commerce qui sont conjugués avec des colorants fluorescents. Cependant, cette méthode fonctionne également pour mettre en correspondance des séquences répétitives en utilisant de plus grandes sondes synthétisées par d'autres moyens et ^9,10 dans de multiples types de tissus et de chromosomes différents. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cartographier des séquences euchromatiques en utilisant plus ou Multiple, de courtes sondes dans la séquence euchromatique d'intérêt.

Protocol

1. Tissue Dissection et fixation (60 min) Pour cerveaux drosophile, placer 3 ème stade larvaire dans une goutte de 1x PBS (tampon phosphate salin). Choisissez grand stade larvaire 3 ème qui sont activement l'exploration à partir des flacons ou des bouteilles qui ne sont pas surpeuplées. Utilisez une pince à épiler ultrafine paire de se emparer de la bouche des crochets et une autre paire de pince pour saisir 2/3 sur la longueur du corps (figure 1A, B)….

Representative Results

Pour illustrer cette méthode, nous avons hybridé un ensemble de petits oligos synthétisés dans le commerce qui ont été modifiés chimiquement avec des conjugués fluorescents (figure 2) et une sonde plus biotinylé (fait par translation de coupure d'un produit PCR; Figure 2B), les chromosomes de plusieurs tissus différents types (voir le tableau 1). Les séquences cibles incluses répétitions satellites situés dans les régions péricentromériques (hétér…

Discussion

ADN ISH est fréquemment utilisé pour cartographier des séquences spécifiques à chromosomes. Nous avons décrit une méthode simple pour l'ADN ISH optimisé pour nombre élevé de copies, séquences hétérochromatiques. Plutôt que d'utiliser des lavages dans une solution de formamide, ce qui est une exigence dans d'autres protocoles ADN ISH existants, on place les lames de tissus montés directement sur un bloc de pré-chauffé pour dénaturer l'ADN. Ce procédé évite l'utilisation de grandes…

Materials

	Company
Materials
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)	Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge)	Dumont
22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear	Fisher
Sigmacote	Sigma
Filter paper (75-150mm)
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)
Coplin jars (with slide grooves)
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 mL microfuge tubes
Nail polish (clear or colored)
2-20 μL micropipette and plastic tips
20-25 standard metal paperclips linked to form a chain
	Company/Notes
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde	Electron Microscopy Reagents
Acetic acid	Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)	Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)	Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Hybridization buffer	Recipe below
4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)	Recipe below
0.1X SSC (Saline-sodium citrate)	Recipe below
Blocking solution	Recipe below
SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)	Recipe below
1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)	Recipe below
1X PBS (Phosphate-buffered saline)
Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector laboratories