Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em> In Situ</em> Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yaklaşım, hesaplama yaklaşımlar engelleyici zorluklarla karşı karşıya heterokromatik bölgelere haritalama derece tekrarlayan dizileri özellikle etkilidir. Burada başka DNA ISH protokolleri standart adımlar formamiddir yıkar circumvents DNA ISH için bir aerodinamik protokol açıklar. Bizim protokol de farklı böcek doku tiplerinin bir dizi boyunca heterokromatik kromozomal bölgeleri içinde olan tekrar eden DNA dizilerinin işaretlemek floresan boyalar, taşımak kısa tek sarmallı DNA probları ile hibridizasyon için optimize edilmiştir. Ancak, uygulamalar daha büyük prob ve tek kopya (non-tekrarlayan) DNA dizilerinin görselleştirme ile kullanmak için uzatılabilir. Biz sinir hücreleri ve Nasonia melanogaster Drosophila gelen ezilmiş kromozomlar için birkaç farklı tekrarlayan dizileri haritalama bu yöntemi göstermektedirvitripennis spermatosit. Biz de, küçük ticari olarak sentezlenir problar için ve karşılaştırma için daha büyük bir sonda için hibridizasyon desen göstermektedir. Bu prosedür, basit laboratuvar malzemeleri ve ayıraçları kullanır, ve DNA ISH performans ile çok az deneyime sahip araştırmacılar için idealdir.
Introduction
In situ hibridizasyon (ISH DNA) DNA spesifik kromozom bölgelerine haritalama dizileri için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ökromatin olan tek kopyalı bölgelere problar çeşitli ile nik-çevirisi ya da büyük DNA ürünleri 1,2 uç-etiketleme ve deoxygenin (DIG) dahil edilmesi de dahil olmak üzere yaklaşımlar, -attached edilmiş nükleotitler ve bunların tanınma bir avuç yoluyla oluşturulabilir grup konjüge antikorlar 1-3. Az ya da tek bir kopya sayısında ökromatik dizilerin Görselleştirme yüksek spesifik aktiviteye veya birlikte sinyali artırmak çok küçük prob bir kokteyli ile tek bir büyük problar ya da kullanılmasını gerektirir.
Normalde on blok olarak da bilinen tek bir kromozom bölgelerinde kümelenmiş tekrarların binlerce olarak mevcut çünkü aksine, uydu DNAlar gibi heterokromatin bulunan çok tekrar eden diziler, DNA ISH için daha kolay hedeflerdir. Transpoze edilebilir elemanları da olabilirfarklı kromozom anomalisi 2 yüksek kopya sayılarında bulundu. Bu durumda, düşük özgül etkinliği olan bir sonda etkili bir nedeniyle çok sayıda yerde bunların hibridizasyona heterokromatik dizileri etiketleyebilir. Tekrar eden dizilere Problar ticari olarak kısa oligonükleotitler (30-50 bp), sentezlenmiş ve kimyasal olarak çok sayıda farklı floresan gruplarının biri ile birleşebilir. Genom-sıralama teknolojileri kullanarak heterokromatindir içinde tekrarlayan dizileri Haritalama nedeniyle oldukça tekrarlayıcı uydu blokları 4-6,7 içinde bina iskeleleri karşılaşılan zorluklar zordur. Şu anda, ISH alt-kromozom düzeyinde bu dizileri haritalama en etkili yol olarak duruyor. Bu strateji, devam etmekte olan genom ve transcriptome sıralama çalışmaları ile ortaya olan tekrar eden dizilerin büyük sayıda haritalanması için önemlidir.
slayt monte kromozomlar üzerinde haritalama tekrarlayan dizilerin verimlilik ve kullanım kolaylığı gre olacakatlı DNA ISH için basitleştirilmiş bir protokol tarafından geliştirilmiş. Örneğin, DNA, ISH mevcut protokoller, böylece eşleme dizileri için gerekli süre büyük ölçüde eklenmesi ve aynı zamanda bu pahalı reaktifin kimyasal atık büyük miktarlarda üretilmesi, formamid çözeltisi 2,8 hibridize dokuların birden fazla yıkama içerir. Burada formamıd yıkar ihtiyacını circumvents ve temel laboratuvar ekipmanları ve reaktifler kullanan bir revize DNA ISH yöntemi tarif. Bu yöntem, ilk olarak floresan boyalar ile konjuge edilmiş ticari olarak sentezlenir oligolar kullanılarak, Drosophila larva neuroblasts heterokromatik bölgelerinde yüksek olan tekrar eden DNA dizilerinin hızlı eşleme için tasarlanmıştır. Ancak, bu yöntem, aynı zamanda, diğer yollarla 9,10 ile ve birden fazla farklı doku ve kromozom türleri arasında sentezlendi büyük probları kullanılarak çok tekrarlanan diziyi eşleştirmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, daha uzun ya da multip kullanılarak ökromatik dizileri eşlemek için kullanılabilirle, ilgi euchromatic dizisi içinde kısa sondalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA, ISH sık kromozomlara özgü dizileri eşlemek için kullanılır. Bu yüksek kopya sayısında heterokromatik dizileri için optimize edilmiş DNA ISH için basit bir yöntem tarif edilmiştir. Aksine diğer mevcut DNA ISH protokolleri bir gerekliliktir bir formamıd çözelti içinde yıkar kullanmak yerine, biz DNA denatüre doğrudan önceden ısıtılmış blok üzerinde doku monte slaytlar yerleştirin. Bu yöntem, formamid yüksek miktarda kullanılmasına aşılmaktadır. Net melezleme sinyalleri üretmek i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
