The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
הנה, יש לנו הפגנו את תחולתו של הסימפונות organotypic אדם ודגמי רקמת האף על מנת להעריך את ההשפעה של חשיפה חוזרת ונשנית CS. כחלופה לניסויים בבעלי חיים, מספר מערכות חשיפה פותחו להערכות טוקסיקולוגית חשיפת תרסיס במבחנה (לדוגמא., Vitrocell, Cultex, אליס, וכו '). מודולים חשיפה אלה יכולים גם להיות מנוצלים להערכה טוקסיקולוגית של מזהמים באוויר, חלקיקים הנישאים באוויר, חלקיקים, וכו 'במחקר זה, השתמשנו במערכת Vitrocell שיכולים להכיל עד 48 מדגמים שונים בו זמנית, מה שמאפשר לניסויים בקנה מידה גדולים יותר והשתנות נמוכה יותר בין טיפולים. לכל חשיפת תרסיס במבחנה, את הסיכון של זיהום בתרבית הרקמה נשאר סיכון עיקרי להפחתת סיכון שדורש טיפול זהיר של תרביות רקמה בכל הניסויים.
מדידת חלקיקים בתצהיר בזמן אמת על microbalance במהלך הדוארניסוי xposure מאפשר לפקח שמינוני CS שנוצרו ממערכת החשיפה העומדים בציפיות. כדי להבטיח את הדיוק של החלקיקים נמדד בתצהיר, הקמה של מדידת האינטרנט בצורה נכונה לפני החשיפה הוא critial, למשל, הגדרת קנה המידה ל0. בנוסף, בגלל ההבדל בין תחומי microbalance (2 סנטימטר) ו הוספת תרבית רקמה (0.33 סנטימטר 2), ושינינו את החישוב הסופי לאזור של להכניס את התרבות: רק 33% מהתצהיר על microbalance משקפים את התצהיר בפועל בכנס התרבות.
מדידה של Teer לברר פונקציונלי מחסום הדוק צומת ולהעריך שיבוש שכבת האפיתל היא הליך קל יחסית ליישום, שבו אנו מדווחים כאן. עם זאת, מכיוון שמודלי רקמת הסימפונות ואף מכילים תאי גביע ובין מייצרי ריר, כביסה הפסגה צריכה להתבצע לפני שקילת משקל הג Teerurement. הכביסה הפסגה היא קריטית משום שהנוכחות של שכבת הריר וההשתנות של ההטיה פח עובי שלה המדידה של Teer, interferring עם ההשפעה של חשיפת CS. רעיון זה הוא בהסכם עם מה שדווח על ידי Hilgendorf ועמיתים, שבי החדירות של קאקו-2 תאים הושפעו משיתוף culturing עם שורת תאי גביע מייצרי ריר HT29 23. הריר צריך לשטוף לפני מדידת Teer, כי כביסה הפסגה ממש לפני החשיפה עלולה להפריע לתגובות הרקמות לCS. לכן, המדידה מתבצעת שלושה ימים לפני החשיפה, ולא ממש לפני החשיפה.
הראינו כי פעילות CYP1A1 / CYP1B1 ניתן הייתה למדוד מהמודלים תרבות organotypic בעקבות חשיפת CS למרות הפעילות מוגברת בצניעות רק על ידי CS. אות חלשה זה יכול להיות מוגבר על ידי דגירה ארוכה יותר של מצע CYP1A1 / 1B1 (כלומר., luciferin-CEE), למשל ל24 שעות (מידע לא מוצג). אחת המגבלות של מדידת פעילות CYP בעבודה הנוכחית הוא היעדר הנורמליזציה לרמת חלבון CYP או לספירת התאים, אשר יכול להילקח בחשבון למחקרים עתידיים כדי להבטיח שהשינוי בפעילות האנזים אינו מושפע על ידי השינוי של שתי רמת החלבון או ספירת התאים.
אנחנו דיווחו כי חשיפת CS בלמה את הריסים להכות בשני האף ודגמי רקמת הסימפונות. תצפיות דומות נעשו במודלים של יונקים ושאינם יונקים מגוונים 12. לריסים להכות מדידה, על מנת להבטיח כי רקמות מטופלות ומטופלים באופן דומה הוא קריטי, לדוגמא, אם שינוי בינוני מיושם, זה צריך להיות מיושם על כל הדגימות. Sutto ועמיתים דיווחו כי pH השפיע על ריסי היונקים להכות תדירות 24. לפיכך, בעת השוואה בין מכות תדרי תאים שטופלו בcompunds / תערובות שונות, pHהתאמה צריכה להיחשב כדי למזער את ההשתנות של מדידת מכות הריסים. יתר על כן, בטמפרטורה שבי המדידה מתבצעת היא קריטית גם כתדר של מכות ריסי טיפות עם ירידה בטמפרטורה. כדי למזער את השונות כתוצאה מהשינויים אלה, חממת במה עליונה, מצוידים בטמפרטורה, CO 2, ובקרת לחות שימש במחקר זה. למרות זאת, שמו לב שהריסים להכות תדרים ברקמות הסימפונות לאחר חשיפת CS היו משתנים מאוד (כלומר., להגדיל בעלון אחד ולהקטין בעלון האחר), טוענים כי מכות הריסים נכונה מופרעים מאוד לאחר חשיפה. בניגוד לכך, אנו נצפו היעדר תדרי מכות הריסים מדידים ברקמת האף לאחר חשיפת CS, המצביע על כך התגובה של רקמות האף היא יותר רגישה ועקבית. זה בהסכם עם פרסום קודם שהראה כי יש לו את רקמות האף קיבולת נמוכה כדי לטהר כלעומת הסמפונות 25.
לבסוף, הראינו כי ביטוי גני פרופיל מסימפונות organotypic ודגמי רקמת האף נחשפו לCS יכול להדגים השפעה של CS על חילוף חומרים xenobiotic. מעניין לציין, כי השינוי שנצפה בחילוף חומרי xenobiotic בסימפונות organotypic והאף במודלים חוץ גופית החשוף לCS דומה לזה של מצב in vivo במעשנים כפי שנדונו בפירוט רב יותר בפרסום קודם 15. לביטוי גני ניתוחים, שימוש במכשיר רובוטי עושה ניתוח תפוקה גבוהה אפשרי. יתר על כן, טיפול רובוטית אוטומטי מגדיל עוד יותר את העקביות ודיוק של תוצאות ביטוי גנים. עם זאת, אוסף מהיר של דגימות הרקמה היה קריטי כדי למנוע השפלה RNA במהלך הפקת RNA. עיבוד RNA וגישות transcriptomic המתואר כאן יכולים להיות מיושמים גם לדגימות רקמת in vivo.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות למוריס סמית 'ומריה Talikka לעיונם של כתב היד.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |