Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Protocol

1. Cultuur van de Organotypische Tissue Bronchial Cultuur Model

Opmerking: Opgelost weefsel modellen werden gekocht als inserts die klaar voor gebruik zijn. Alternatief kan de cultuur worden ontwikkeld uit primaire cellen zoals bijvoorbeeld beschreven door Karp en collega 16. Na ontvangst van weefsels in een steriele verpakking, altijd omgaan met de menselijke organotypische weefsel onder steriele omstandigheden.

  1. Voeg 0,7 ml voorverwarmde (37 ° C) testmedium aan elk putje van een nieuwe steriele 24-well plaat onder de motorkap.
  2. Verwijder de verpakking van de weefsels onder de motorkap, en breng de inzetstukken weefselkweek de nieuwe bereide 24-well plaat (in stap 1.1 beschreven. Hierboven).
  3. Onderhoud en cultuur de weefsels in een incubator bij 37 ° C (5% CO2, 90% vochtigheid).
  4. Vervang het medium om de 2 dagen.
  5. Tijdens een medium verandering, onderzoekt de weefsels onder een lichtmicroscoop om ze ze zijn contaminati zorgen-vrije en dat er geen lekkage van medium.

2. sigarettenrook (CS) Exposure met een in vitro blootstelling System

  1. Drie dagen voor blootstellingexperimenten, was de apicale zijde van de weefselkweek met 200 pl kweekmedium.
  2. Op de dag van de blootstelling, als de meting van de ciliaire kloppend is gepland vóór de blootstelling, omgaan met de weefsels voor ciliaire kloppend meting zoals beschreven in paragraaf 3.
  3. Pre-warm de klimaatkamer van de in vitro belichtingssysteem en de teelt basismodule tot 37 ° C. Vul de teelt basis module met 17,5 ml medium per rij.
  4. Verwijder de weefsels uit de incubator en plaats ze onder de motorkap inzetstukken weefselkweek overbrengen van de kweekplaat de teelt basismodule van de in vitro belichtingssysteem. Bovendien, hebben betrekking op de teelt basismodule met een glazen deksel.
  5. Breng de weefsels in de klimaatkamer van de in vitro blootstelling system voor blootstelling aan mainstream CS.
  6. Indien de in vitro blootstelling is uitgerust met een microbalans, opzet het kwartskristal microbalans voor het uitvoeren van de blootstelling aan de real-time depositie van deeltjes van de rook op een kwartskristal microbalans met de software meten.
    1. Vervang de kristallen in de microbalans modules verbonden met elke rij van de verdunnings / distributiesysteem.
    2. Sluit de microbalans module om de microbalans software. Stel de omvang van de meting tot nul in de software.
  7. Maak de weefsels volgens de experimentele procedure (bijv., Zoals in figuur 1)
    Opmerking: Voorafgaande blootstelling referentie sigaretten (3R4F) geconditioneerd tussen 7 en 21 dagen onder gecontroleerde omstandigheden bij 22 ± 1 ° C en relatieve vochtigheid van 60 ± 3% volgens ISO norm 3402 17.
    1. Genereer sigarettenrook (bijv., Uit 3R4F sigaretten) met behulp van een 30-poorts carrousel roken machine volgens de Health Canada Intense regime: rook de sigaretten naar een standaard kont lengte, dat wil zeggen, ongeveer 35 mm bij 55 ml trekje meer dan 2 sec, twee keer per minuut en 8 seconden pomp stroomt tijd.
      Opmerking: Indien nodig, verdunnen de mainstream CS, zodat de dosis is niet te giftig. Hierin gerapporteerde resultaten werd rook verdund tot 16% (vol / vol).
    2. Gebruik 60% bevochtigde lucht voor de controlemonsters (lucht-blootgesteld).
    3. Expose de weefsels gedurende 6-7 min (bijv., 1 sigaret of lucht blootgesteld) in de in vitro belichtingssysteem
    4. Plaats de weefsels terug in de incubator bij 37 ° C (5% CO2, 90% vochtigheid) gedurende 1 uur.
    5. Herhaal de stappen 2.7.3 en 2.7.4 nog drie keer.
  8. Aan het einde van de blootstelling experiment, stop de microbalans software. De software een bestand dat alle metingen samen met een grafische weergave van de deeltjesdepositie genereren.
  9. Transfer terug de weefsels van de teelt base-module in de petrischaal. Plaats het weefsel terug in de incubator bij 37 ° C (5% CO2, 90% vochtigheid) tot de metingen van de verschillende eindpunten op een specifieke post-exposure tijdstippen.

3. Meting van Ciliaire Beating

Opmerking: Vanaf proefopzet (figuur 1), opnemen ciliaire verslaan voorafgaand aan de belichting en direct na de blootstelling.

  1. Verwijder de weefselkweekplaten de incubator en laat ze onder de motorkap bij kamertemperatuur gedurende 30 min aan de cilia slaan stabiliseren.
  2. Plaats de weefsels onder de lichtmicroscoop verbonden met de CiliaMetrix Software.
  3. Neem de film en de frequentie (in Hertz) van de ciliaire pak slaag. Meet de frequentie om de 3 sec voor 1 minuut.
  4. Zet de weefsels naar de incubator bij 37 ° C (5% CO2, 90% vochtigheid).

4. Transepitheliaal elektrische weerstand (TEER) Meting

Opmerking: De meting van TEER is 3 dagen voor en 48 uur na de blootstelling onder de motorkap onder steriele toestand met behulp van Chopstick elektrode (STX-2) is aangesloten op een voltohmmeter uitgevoerd.

  1. Voeg 200 ul kweekmedium aan het apicale oppervlak van de menselijke bronchiale weefsels.
  2. Zet de EVOMX machine; Was de elektrode met een 70% ethanoloplossing.
  3. Was de elektrode met het kweekmedium.
  4. Meet de weerstand (Ω) door de elektrode in het medium aan de apicale zijde van de weefselkweek zonder het weefsel.
  5. Herhaal stap 4.4 vijf keer te vijfvoud metingen te verkrijgen.
  6. Na de metingen, verwijder voorzichtig het medium van de apicale zijde van het weefsel culturen met behulp van een afzuiger.
  7. Zet de weefselkweken de incubator bij bij 37 ° C (5% CO2, 90% vochtigheid) voor kweken.

5. cytochroom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Voor de start van de studie, bereid de luciferine detectiereagens in door de gehele inhoud van de fles passende reconstitutie buffer aan de amber fles met de luciferine detectiereagens (volgens de instructies van de fabrikant). WINKEL porties van 2 ml bij -20 ° C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Voor de 48 uur na belichtingstijd, incubeer de weefsels gedurende 48 uur na CS blootstelling bij 37 ° C.
  3. Verwarm de Luciferine detectiereagens tot kamertemperatuur.
  4. Incubeer weefsel inzetstukken voor 3 uur of O / N met de Luciferin-CEE substraat (verdund tot 01:50) in de basale kweekmedium.
  5. Pipetteer 50 ul kweekmedium uit elk weefsel voegen aan een 96-well opake witte plaat luminometer bij kamertemperatuur.
  6. Voeg 50 pl luciferine detectie reagens aan elke well van een luminescerende reactie te starten.
  7. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
  8. Lees de luminescentie met een luminometer.
    Opmerking: Voor delichtmeter, gebruik dan een integratietijd van 0,25-1 sec per goed als leidraad.

6. RNA-extractie.

  1. Vóór verzamelen 3D organotypische weefsel inserts, bereiden 1) een doos met droogijs, 2) voldoende bladen (één per 3D insert), 3) koude PBS zonder calcium chloride en magnesium chloride, 4) een 25 ml glazen pipet, en 5 ) steriele glazen naalden voor aspiratie.
    1. Etiket buizen gevuld met keramische kralen voor het homogeniseren stevige cellulaire monsters en voeg 700 ul van Qiazol.
    2. Schakel aspiratie machine.
    3. Verzamel de plaat van de 3D organotypische weefsel inzetstukken uit de incubator.
    4. Was elke insert op de plaat 3 maal met koude PBS. Tussen de wasbeurten, zuigen PBS met het glas naald. Na de derde wasbeurt, aspireren met PBS en afdekplaat om uitdroging van de insert te voorkomen.
    5. Voor elke insert van de plaat, knip de insert membraan (waarop 3D weefsel insert woont) tot de Membrane ligt plat neer op het blad.
    6. Breng het weefsel (samen met het insert membraan) van het mes de homogeniserende buis worden gekenmerkt en schroef de deksel op de buis, schudden en vortex het.
    7. Bevries het monster in droogijs en bewaar bij -80 ° C of blijven het extract het RNA.
      Opmerking: Voorafgaand aan de extractie van RNA, labelen alle buizen en kolommen volgens de randomisatie ontwerp (indien van toepassing). Bereid alle reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant en nemen monsters van -80 ° C vriezer en ontdooi ze op ijs tot ze volledig ontdooid.
  2. Homogenisering
    1. Grind monsters met homogeniseren instrument op 6000 Hz voor 45 sec. Herhaal dit indien de monsters niet goed gehomogeniseerd en laat monsters 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 140 ul chloroform om het monster en vortex gedurende 10-15 sec.
    3. Breng de bovenstaande uit de homogeniserende buis om een ​​Fase slot buis en schud op eenthermoshaker gedurende 2 min bij 1400 rpm en kamertemperatuur.
    4. Aanvullende incubeer de monsters gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer monsters bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  3. RNA neerslag, wassen, schorsing en zuivering in QIAcube.
    1. Breng de bovenste waterige fase in een nieuwe 2 ml buis.
    2. Laad alle benodigde reagentia in de winning robot volgens het protocol van de fabrikant af, selecteer de juiste protocol, stelt het elutievolume (30 pl) en voer de winning robot.
    3. Als de run is voltooid, verwijdert u de rotor adapters en houden elutiebuisjes onmiddellijk bij 4 ° C voor verdere analyse of bij -80 ° C voor langdurige opslag.
  4. Kwaliteitscontrole van het geïsoleerde RNA
    1. Bepaal de hoeveelheid van het geïsoleerde RNA met UV-lezer volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Controleer de kwaliteit van RNA en de RNA integriteit behulp microfluïdische-gel-gebaseerde lab-on-a-chip en een UV-reader, accOrding aan de instructies van de fabrikant.

7. Microarray Workflow

Opmerking: De hieronder beschreven werkwijze is gericht op de werkwijze voor Affymetrix GeneChip hoge verwerkingscapaciteit 3'IVT Express Kit, die wordt gebruikt voor target synthese voor hybridisatie op Affymetrix 3'genexpressie patronen vanaf het maken van het RNA van het gebruik van een complex liquid handling systeem (bijv., pipetteren, verdunnen, doseren, of integreren).

  1. Voorbereiding
    1. Willekeurig monsters batch te vermijden. Het aantal door batches monsters 1-96, waaronder een positieve (commercieel Human universele referentie RNA) en een negatieve (RNase vrij water) controle per batch.
    2. Start de beoogde synthese met 100 ng totaal RNA in 3 gl RNAse-vrij water. Voor 100 ng totaal RNA, een 16 uur incubatie tijd.
  2. RNA Amplification
    1. Bereid de Poly-A RNA spike-in controle-oplossing door een seriële verdunning van de Poly-A RNA Stock met Poly-A Controle VerdunningsBuffer:
      1. Voor verdunning 1, bereiden 2 pi polyA- controle stock in 36 ul verdunning buffer.
      2. Voor verdunning 2, voor te bereiden 2 pl verdunning 1 op 98 pl verdunningsbuffer.
      3. Voor verdunning 3, voor te bereiden 4 pl van verdunning 2 in 196 pl verdunningsbuffer.
      4. Voor verdunning 4, bereiden 20 ul van verdunning 3 in 180 ul van verdunning buffer.
    2. Verdun het RNA in RNAse-vrij water tot een concentratie van 33,3 ng / ul krijgen.
    3. Voeg 2 pi van de polyA controleoplossing de 3 ul totaal RNA monster direct in een plaat met 96 putjes. Deze stap wordt uitgevoerd door het vloeistofverwerkingsysteem.
    4. Bereid de liquid handling systeem en target synthese. Plaats de platen op de robot. Plaats alle benodigde reagentia en laboratorium op het dek. De robot zal de procedure beginnen met de voorbereiding van de appropriate mastermixes en incubeer de monsters in de geautomatiseerde afstand bestuurbare PCR blok.
    5. First Quality Control Controle: controle van het amplificatieproces
      1. Als de kwaliteit van aRNA aanvaardbaar Voer de fragmentatie stap door aan elk monster 8 pl fragmentatie 5X buffer (Deze stap wordt uitgevoerd door het vloeistofverwerkingsysteem). Anders voert u de vorige stap weer vanaf het RNA. Gebruik gefragmenteerd aRNA meteen of bewaar onverdund en gefragmenteerde aRNA bij -20 ° C (of -70 ° C voor langere-termijn opslag).
      2. Voer een tweede kwaliteitscontroleanalyse door het oppakken van willekeurig 12 monsters in de plaat en overdracht 1 ul op microfluidics gel gebaseerde systeem om de efficiëntie van de fragmentatie controleren.
  3. Hybridisatieprocedure
    1. Scan de chip barcodes en elk monster te registreren in de software van de volgens de instructies.
    2. Bereid de hybridisatiemengsel alsvolgt voor een reactie toevoegen aan 33 gl van de gefragmenteerde en gelabeld aRNA 4,2 gl controle-oligonucleotide B2 (3 nM), 12,5 gl 20x eukaryote hybridisatie controles, 25 pi 100% DMSO, 125 gl 2 x hybridisatiebuffer en 50 ui H2O een eindvolume van 216,7 pl
      Opmerking: hybridiseren wassen en scannen positieve en negatieve controles voor het behandelen van monsters.
    3. Bevochtigen array met 200 ui pre-hybridisatie mix in de Hybridisatie en wassen Stain Kit.
    4. Plaats de chip in de hybridisatie oven op 45 ° C en 60 rpm gedurende 10 min.
    5. Ondertussen, denatureren de plaat (met de uiteindelijke cocktail hybridisatie mix) in een PCR-blok bij 99 ° C gedurende 5 min en 45 ° C gedurende 5 min.
    6. Verwijder de pre-hybridisatie mix van de array en vervangen door 200 ul van de hybridisatie cocktail doel (één monster per chip).
    7. Plaats de array naar de hybridization oven op 45 ° C gedurende 16 uur (O / N) met een rotatiesnelheid van 60 rpm.
  4. Wassen en kleuren
    1. Run "Fluidics" van de software menubalk. In het dialoogvenster Fluidics selecteert u de module van belang (1-4), selecteer vervolgens de Prime_450 programma om alle modules. Plaats de buis voor Wash Buffer A in een fles (400 ml) en Wash Buffer B in een fles (200 ml), en voor milliQ water in een fles (500 ml).
    2. Vervolgens volgt u de instructies LCD-scherm. Til de naalden en plaats 600 pl vlek cocktail 1 (SAPE Solution Mix) en 600 gl vlek cocktail 2 (antilichaamoplossing Mix) bevattende microcentrifugebuizen op posities # 1 en # 2, en 900 gl array dat bufferoplossing op positie # 3.
    3. Na de O / N incubatie in de oven, zuigen de cocktail van de chip en vul de microarray met 250 ul Wash Buffer A. Wijs de juiste chip op elke module, selecteer het FS450-001 protocol en lopen elk module, volgens de instructies op het scherm. Dit proces duurt 90 min.
    4. Zodra het LCD-scherm verschijnt "Eject Cartridge" bericht, verwijder de chip en controleer of er geen luchtbellen. Indien deze aanwezig zijn, vullen de array geheel bij de Array houden buffer. Toepassen stickers op de septa om eventuele lekken in de scanner te vermijden en voorafgaand de microarray raam schoon te laden in de scanner.
  5. Scannen.
    1. Warmen de scanner. Laad de chip in de autoloader van de scanner en start het scannen.
      Opmerking: Na ~ 12 min per chip, wordt een .CEL bestand per chip gegenereerd.
    2. Controleer het beeld en lijn het rooster (indien nodig) om de plek om de sonde cellen te identificeren.
      Opmerking: De dataset is voorgelegd aan ArrayExpress (Toetreding code = E-MTAB-1721).

8. Netwerkgebaseerde Systems Biology Analyse voor een effectbeoordeling

  1. Microarray data verwerking.
    Opmerking: Gegevens verwerken van eend scoren methoden werden uitgevoerd met behulp van de R statistische milieu versie 2.14.
    1. Open een R18-sessie en laad de affy 19, gcrma en affyPLM pakketten geïnstalleerd door het uitvoeren van de opdrachten: bibliotheek (affy)> library (gcrma)> library (affyPLM)
    2. Lees ruwe data bestanden uitvoeren van de opdracht: data.affybatch <-ReadAffy ("pad naar de map waar zijn opgeslagen het CEL-bestanden")
    3. Aftrekken van de achtergrond correctie en kwantiel normaalschool te probe set expressie waarden te genereren met behulp van de gcrma pakket, door het uitvoeren van de opdracht: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Kwaliteitscontrole.
    1. Genereren van RNA degradatie percelen met het commando: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Pak de coëfficiënt van het RNA degradatie helling loopt het commando: helling = deg $ helling
    3. Plot de helling coëfficiënt en mogelijke uitschieters.
    4. Genereer Nuse en RLE plots de volgende commando: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> Nuse (Pset).
    5. Identificeer als sommige van de gegenereerde boxplots zijn uitschieters: array wordt outlier als ten minste 2 van de 3 QC metriek hierna gedefinieerd afwijkt van de andere matrices:
      - Deg $ helling verschillend van de gemiddelde deg $ hellingsgraad
      - Nuse plot: een array wordt beschouwd als uitschieter als het bovenste kwartiel daalt onder 0,95 of het laagste kwartiel boven 1.05, dat wil zeggen, als de boxplot is geheel boven 1.05 of geheel onder de 0.95..
      - RLE plot: array wordt outlier wanneer de mediaan van de RLE verdeling groter dan 0,1 of kleiner dan -0,1.
    6. Als een array wordt geïdentificeerd als een uitschieter, gooi, en begin opnieuw vanaf stap 8.1.2.
    7. Breng een algemeen lineair model met de gegevens van de specifieke contrasten van belang (bijv., De vergelijking van "behandelde" en "controle" omstandigheden) genereren ruwe P-waarden voor elke set op de microarray probe die furt kan wordenhaar aangepast met de Benjamini-Hochberg procedure van de Limma pakket. Selecteer een probeset per gen als vertegenwoordiger van het gen voor verdere analyse te behouden zoals beschreven 20.
      Opmerking: Een blokkerende factor (de blootstelling plaat) van het experiment ontwerp werd opgenomen in het model voor de verwerking van gegevens.
  3. Netwerk-gebaseerde analyse.
    Opmerking: De werkwijze zoals hier toegepast is beschreven in Martin et al. (In revisie in BMC bioinformatica).
    1. Voor elke paarsgewijze vergelijking van belang starten vanaf de berekende (log2-) veelvoudveranderingen (behandeling versus controle) voor elk gen in de netwerkomgeving (uit stap 8.2).
    2. Bereken de ondertekende Laplace matrix L van de door L-netwerk (i, j) = - teken (i ~ j) w (i, j) indien een rand van het gewicht w (i, j) tussen knooppunt i en j, L (i, j) = deg (i) de gewogen mate van i en L (i, j) = 0 anders. Het gewicht w (i, j) gelijk aan 1 indien i en j in de hoofdketen en w (i, j) = 1 / n of i een backbone knooppunt en j is een van de n neighbors in het transcript laag.
    3. Bereken scores voor de ruggengraat door f = L3-1L2Tx waar L3 is de sub-matrix van L naar de backbone knooppunten en L2 is de sub-matrix van L wier rijen komen overeen met de transcriptie laag knooppunten en de kolom met de backbone knooppunten
    4. Bereken de ondertekende Laplace, Q, van de door het backbone netwerk waar de rand borden omgekeerd netwerk.
    5. Bereken de NPA score door NPA = fTQf.
    6. Bereken het betrouwbaarheidsinterval, de ruggengraat rand permutatie p-waarde en het transcript laag permutatie p-waarde.
      Opmerking: (bijv., De biologische variatie tussen de monsters in een experimentele groep) Naast de intervallen van de NPA scores vertrouwen, goed voor de experimentele fout, gezelschapsdieren statistieken werden ontleend aan de specificiteit van de NPA score beschrijven de beschreven biologie in het netwerk. Omdat NPA is een kwadratische vorm van de vouwveranderingen, kan de variantie berekend gebaseerd op de veelvoudverandering geschat variances. Een betrouwbaarheidsinterval wordt vervolgens afgeleid met behulp van de centrale limietstelling. Twee permutatietests geïmplementeerd 21 waarbij eerste plaats beoordeelt of de resultaten waren specifiek voor de onderliggende gegevens (bijv., Gen veelvoudveranderingen) in het model leidt tot een permutatie P-waarde (aangegeven met * O in de figuren als P -waarde <0,05). Ten tweede, om te beoordelen of de "oorzaak en gevolg" laag van het netwerk aanzienlijk bijgedragen tot de amplitude van het netwerk verstoring (aangeduid met K * in de cijfers bij het P-waarde <0,05).
    7. Beschouw het netwerk als beïnvloed door de behandeling als het betrouwbaarheidsinterval niet nul de twee permutatie p-waarden <0.05 bevat EN.
    8. Bereken de leidende knooppunten die gedefinieerd worden als de belangrijkste knooppunten in het skelet dragen tot 80% van de NPA score.

Representative Results

In onderstaande resultaten beschreven, de organotypic weefsels waren primaire menselijke epitheelcellen geïsoleerd van gezonde, niet-roken, blanke donoren en werden opgelost met behulp van fibroblasten 15.

3D bronchiale en neusweefsel modellen
In vitro bronchiale en nasale organotypische modellen lijken op celniveau de menselijke luchtwegen epitheel (figuur 2).

CS blootstelling
Organotypische bronchiale en neusweefsel modellen kunnen herhaaldelijk worden blootgesteld aan mainstream CS aan de lucht-water grensvlak. De belichting rook experimentele procedure voor de resultaten hier weergegeven is in Figuur 1.

Opname van ciliaire kloppend
Cilia slaan werd opgenomen in de weefsels lucht blootgesteld zoals in de video. CS blootstelling werd geassocieerd met een vermindering van de ciliaire slaan frequentie: hoe sterker piek rond waargenomen4 Hz in de sham blootgesteld en vóór blootstelling is niet langer na CS blootstelling (figuur 3) waargenomen. Dit verminderde frequentie zou de trilharen maken verslaan minder efficiënt om slijm en ziekteverwekkers 22 verwijderen.

Meting van TEER en CYP1A1 / 1B1 activiteit
TEER werd gemeten 48 uur na de laatste blootstelling aan ervoor te zorgen het weefsel is nog steeds functioneel. CYP1A1 / 1B1 activiteit werd gemeten 48 uur na afloop van blootstelling in figuur 1. De TEER waarden in het CS-blootgestelde weefsels waren niet significant verschillend in vergelijking met de lucht blootgestelde weefsels bevestigd dat er geen grote cytotoxisch effect van rook bij deze concentratie. Op 48 uur na blootstelling werd CYP1A1 / 1B1 activiteit van de weefsels iets toegenomen, hetgeen een bescheiden toename van weefsel afweermechanisme na belichting (figuur 4).

Genexpressie profielen en netwerk-gebaseerde systemen biologie aanpak om de impact van CS blootstelling op de wijziging van xenobiotisch metabolisme
Weefsels werden verzameld op 48 uur na blootstelling tijdstippen. Vervolgens werd microarray analyse om gen-expressie profielen van de CS- en weefsels lucht blootgestelde genereren. Impact van de CS blootstelling aan lichaamsvreemde metabolisme werd onderzocht met behulp van een netwerk-gebaseerde systeembiologische aanpak leveraged van het gen-expressie profielen en zoals eerder 15 gemeld. Met een netwerkgebaseerde Systeembiologische analyse blijkt dat CS blootstelling effecten op het niveau van backbone knooppunten in het xenobiotisch metabolisme netwerkmodel goed gecorreleerd tussen de in vitro en in vivo datasets (figuur 5). Daarentegen, op het niveau van elke afzonderlijke veranderingen genexpressie, slechte correlatie waargenomen tussen de in vitro (CS-blootgestelde versus lucht blootgesteld) en in vivo (rokers versus niet-rokers).


Figuur 1. Schematische voorstelling van de herhaalde blootstelling van CS naar de organotypische bronchiale weefsel modellen Afkortingen:. CYP, cytochroom P450; CS, sigarettenrook; TEER, transepithele elektrische weerstand.

Figuur 2
Figuur 2. Organotypische bronchiale en nasale epitheelweefsel cultuur modellen. Cartoon illustratie van de bronchiale (A) en nasale (B) weefselkweek insert in de lucht-water grensvlak. De in vitro modellen die haarcellen in de apicale laag van de hematoxyline & eosine gekleurde cellen (C bronchiale, D voor nasale) zoals eerder 15 beschreven. De modellen werden samen gekweekt met fibroblasten die belangrijk zijn voor de groei en differentiatie van epitheelcellen (aangegeven door pijlen). Kleuring van de luchtwegen lineage markers: P63 (E voor bronchiale, F voor nasale) en MUC5AC (G voor bronchiale, H voor nasale) getoond zoals eerder 15 gemeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Cilia slaan frequentie. Cilia kloppende frequentie (CBF) werd gemeten in lucht blootgesteld en in de kweek vóór en na blootstelling. Verminderde CBF werd gezien na CS blootstelling (representatieve resultaten van twee insert worden getoond als herhaalde 1 (R1) en repliceren 2 (R2)).

ad / 52.325 / 52325fig4.jpg "/>
Figuur 4. Meting van CYP1A1 / CYP1B1 activiteit en TEER. Left panelen geven de CYP1A1 / CYP1B1-activiteit in de bronchiale (A) en nasale (B) weefselmodellen. Rechts panelen geven de TEER meting in het bronchiale (C) en nasale (D) weefselmodellen. Gemiddelden ± SD worden getoond. Afkortingen: CS, sigarettenrook; CYP, cytochroom P450; TEER, transepithele elektrische weerstand; RLU relatieve luminescense unit.

Figuur 5
Figuur 5. Netwerkgebaseerde Systeembiologische analyse van de effectbeoordeling van CS blootstelling in de context van xenobiotische metabolisme. De veranderingen van gen expressie niveaus werden gebruikt om de activering van ruggengraatknooppunt van de lichaamsvreemde Metabolisme netwerkmodel (A) berekenen strong> zoals gerapporteerd in een eerdere publicatie 15. De figuur rechts illustreert het concept van de kwantificering van de backbone knooppunten, ook wel bekend als "differentiële netwerk backbone waarde," met behulp van de NPA aanpak. De blauwe ovalen geven de activiteit van de backbone knooppunten (bijv., De functionele laag) en de groene ballen vertegenwoordigen de expressie van genen (bijv., De transcriptionele laag). Effecten van CS blootstelling in organotypische bronchiale weefsels (in vitro, CS belichte versus lucht blootgesteld) en 48 h postexposure werden vergeleken met die van roken op humane bronchiale epitheel van bronchoscopie en nasale epitheelcellen verzameld door burshing de inferieure turbinate (GSE16008 ) (in vivo, rokers versus niet-rokers) (B). Bijvoegsels, correlatie van de genexpressie verandert tussen de in vitro en in vivo datasets. Afkortingen: CS, sigarettenrook; NPA, netwerk verstoring amplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Hier hebben we de toepasbaarheid van de menselijke organotypic bronchiale en neusweefsel modellen om de effecten van herhaalde CS blootstelling te beoordelen aangetoond. Als alternatief voor dierproeven enkele blootstelling systemen ontwikkeld voor toxicologische evaluatie van aërosol in vitro (bijv., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Deze blootstelling modules kunnen ook worden gebruikt om de toxiciteit van luchtvervuiling, zwevende deeltjes, nanodeeltjes, etc. In deze studie hebben we de Vitrocell systeem aan maximaal 48 verschillende monsters tegelijkertijd, waardoor grotere schaal experimenten en lagere variabiliteit behandelingen. Voor elke aerosol blootstelling in vitro, het risico van weefselkweek verontreiniging blijft een groot risico waarvan beperking vereist een zorgvuldige behandeling van het weefsel culturen in de experimenten.

Het meten van de depositie van deeltjes in real time op de microbalans tijdens de eXposure experiment maakt het mogelijk om te controleren of de CS doses gegenereerd uit het belichtingssysteem te zijn dat voldoet aan de verwachtingen. Om de nauwkeurigheid van de gemeten deeltjes depositie waarborgen, opzetten het online meten juist vóór de belichting critial, bijvoorbeeld het opzetten van de schaal 0. Daarnaast, vanwege het verschil tussen de gebieden van de microbalans (cm2) en de weefselkweek insert (0,33 cm2), pasten we de uiteindelijke berekening van de oppervlakte van het kweekinsert: slechts 33% van de neerslag op de microbalans de werkelijke afzetting in de kweekinsert.

Meting van TEER strak-splitsing barrière functionaliteit te kennen en om verstoring van de epitheellaag beoordelen is een relatief eenvoudige procedure te implementeren, die we hier gemeld. Omdat de bronchiale en nasale weefselmodellen bevatten slijmvormende afgewisseld slijmbekercellen, apicale wassen dient voor de TEER MMO te voerenurement. De apicale wassen is essentieel omdat de aanwezigheid van de mucuslaag en de variabiliteit van de dikte vertekening van de meting van TEER, interferring de gevolgen van CS blootstelling. Dit begrip is in overeenstemming met hetgeen is beschreven door Hilgendorf en collega's, waarbij de permeabiliteit van Caco-2 cellen werd beïnvloed door co-kweken met slijmvormende slijmbekercellen lijn HT29 23. Het slijm moet worden afgewassen vóór TEER meting, omdat apicale wassen vlak voor de belichting kan interfereren met het weefsel reacties op CS. Daarom wordt de meting uitgevoerd drie dagen vóór de blootstelling, en niet vlak voor blootstelling.

We toonden aan dat CYP1A1 / CYP1B1 activiteit kan worden gemeten vanaf de organotypische cultuur modellen volgende CS blootstelling hoewel de activiteit werd slechts licht verhoogd met CS. Dit zwakke signaal kan worden versterkt door een langere incubatie van het CYP1A1 / 1B1 substraat (bijv., Luciferine-CEE), bijvoorbeeld voor24 uur (gegevens niet getoond). Een van de beperkingen van de CYP activiteitsmeting in dit werk is het ontbreken van normalisatie naar de CYP eiwitniveau of het aantal cellen, die in aanmerking kunnen worden genomen voor toekomstige studies dat de verandering van de enzymactiviteit niet beïnvloed Door de verandering van ofwel het eiwitniveau of het aantal cellen.

We meldden dat CS blootstelling remde de ciliaire verslagen in zowel de nasale en bronchiale weefsel modellen. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan in diverse zoogdieren en niet-zoogdieren modellen 12. Voor ciliaire slaan meten, zodat de weefsels worden gehanteerd en behandeld op dezelfde wijze kritisch is, bijvoorbeeld als mediumverversing wordt uitgevoerd, moet worden toegepast voor alle monsters. Sutto en collega's gemeld dat de pH beïnvloed de zoogdieren ciliary verslaan frequentie 24. Dus, bij het vergelijken slaan frequenties tussen cellen behandeld met verschillende compounds / mengsels pHaanpassing moet worden overwogen om de variabiliteit van de ciliaire kloppend metingen te minimaliseren. Bovendien is de temperatuur waarbij de meting plaatsvindt is ook belangrijk als de frequentie van ciliaire slaan druppels met afnemende temperatuur. Om de variabiliteit door deze veranderingen een podium-top incubator, uitgerust met temperatuur, CO2 en luchtvochtigheid werd gebruikt in deze studie minimaliseren. Ondanks dit, we hebben geconstateerd dat de ciliaire frequenties verslagen in de bronchiale weefsels na CS blootstelling waren zeer variabel (dwz., Te verhogen in een insert en dalen in de andere insert), wat suggereert dat de ciliaire kloppend is zeer verstoorde direct na blootstelling. Daarentegen we de afwezigheid van meetbare ciliaire slaan frequenties waargenomen in de nasale weefsels na CS blootstelling suggereert dat de respons van de nasale weefsel gevoeliger en consistent. Dit is in overeenstemming met een eerdere publicatie blijkt dat de nasale weefsel een lagere capaciteit te ontgiftenvergeleken met de bronchus 25.

Tot slot hebben we laten zien dat gen expressie profilering van de organotypic bronchiale en neusweefsel modellen blootgesteld aan CS een impact van CS op lichaamsvreemde metabolisme kon aantonen. Interessant is dat de waargenomen verandering in xenobiotische metabolisme in de organotypische bronchiale en nasale in vitro modellen blootgesteld aan CS lijken op die van de in vivo situatie rokers zoals in meer detail in een eerdere publicatie 15. Voor genexpressie analyses met de robotic instrument met een hoge doorvoer analyse mogelijk. Bovendien, robotachtige automatische handling verhoogt verder de consistentie en nauwkeurigheid van de resultaten genexpressie. Niettemin snelle verzameling van de weefselmonsters was cruciaal om RNA afbraak tijdens de RNA-extractie te vermijden. De RNA processing transcriptoom benaderingen beschreven kunnen ook worden toegepast op in vivo weefselmonsters.

Disclosures

Deze studie werd gefinancierd door Philip Morris International.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Maurice Smith en Marja Talikka bedanken voor hun beoordeling van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

Tags

Biotechniek menselijk organotypic bronchiale epitheel 3D-cultuur, sigarettenrook trilharen kloppend xenobiotisch metabolisme netwerk modellen systemen toxicologie
Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E.,… More

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter