Protocol
1. Kultur i Organotypiska Tissue Bronkial Kultur Modell
Obs: Rekonstituerade vävnadsmodeller köptes som skär som är färdiga att använda. Alternativt skulle kulturen utvecklas från primära celler såsom beskrivs exempelvis av Karp och kollegor 16. Efter mottagandet av vävnader i sterila förpackningar, alltid hantera de mänskliga organotypiska vävnaderna under sterila förhållanden.
- Lägg 0,7 ml förvärmda (37 ° C) analysmedium till varje brunn av en ny steril 24-brunnsplatta under huven.
- Ta förpackningen till vävnaderna under huven, och överföra vävnadskulturinsatser till den nya förberedda 24-brunnar (beskriven i steg 1.1. Ovan).
- Underhåll och kultur vävnaderna i en inkubator vid 37 ° C (5% CO2, 90% fuktighet).
- Byt mediet var 2 dagar.
- Under ett byte av medium, undersöka vävnader under ett ljusmikroskop för att säkerställa att de är de contamination-fri och att det inte finns något läckage av medium.
2. Cigarettrök (CS) Exponering med hjälp av en in vitro Exponeringssystem
- Tre dagar före exponering experiment, tvätta den apikala sidan av vävnadskultur med 200 | il av odlingsmediet.
- På dagen för exponering, om mätningen av ciliära misshandeln planeras före exponering, hanterar vävnader för ciliär stryk mätning som beskrivs i avsnitt 3.
- Pre-värma klimatkammaren för in vitro exponeringssystem och odling basmodulen till 37 ° C. Fyll odlingen basmodulen med 17,5 ml medium per rad.
- Avlägsna vävnaderna från inkubatorn och placera dem under huven för att överföra de vävnadsodlings skären från odlingsplattan för odling basmodul för vitro exponeringssystemet i. Dessutom täcker odling bas modul med ett glaslock.
- Överför vävnaderna i klimatkammare för vitro exponering syste inm för exponering för vanliga CS.
- Om vitro exponeringssystemet är utrustat med en mikrovåg, set-up Quartz Crystal Micro innan du kör exponering för att mäta realtidspartikel avsättning av rök på en kvartskristall med hjälp av mikrovåg programvaran.
- Byt kristallerna i mikrovåg moduler anslutna till varje rad av systemet utspädning / distribution.
- Anslut mikrovåg modulen till mikrovåg programvara. Ställ in skalan för mätningen till noll i programvaran.
- Exponera vävnaderna enligt den experimentella proceduren (t.ex.., Såsom i fig 1)
Obs: Före exponering, referens cigaretter (3R4F) kondition mellan 7 och 21 dagar under kontrollerade förhållanden vid 22 ± 1 ° C och relativ luftfuktighet på 60 ± 3% enligt ISO-standard 3402 17.- Generera cigarettrök (t.ex.., Från 3R4F cigaretter) med hjälp av en 30-port karusell rökning machine enligt Health Canada Intense regimen: röker cigaretter till en vanlig rumpa längd, dvs ca 35 mm vid 55 ml puff över 2 sek, två gånger per minut och 8 sekunder pumpavgas tid.
Obs: Om det behövs, späd mainstream CS så att dosen inte är för giftig. I resultat redovisas här, var rök utspädd till 16% (vol / vol). - Använd 60% fuktad luft för kontrollprover (luftexponerade).
- Exponera vävnaderna under 6-7 minuter (dvs., 1 cigarett eller luftexponerad) i in vitro exponeringssystem
- Sätt vävnaderna tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C (5% CO2, 90% fuktighet) under en timme.
- Upprepa steg 2.7.3 och 2.7.4 tre gånger.
- Generera cigarettrök (t.ex.., Från 3R4F cigaretter) med hjälp av en 30-port karusell rökning machine enligt Health Canada Intense regimen: röker cigaretter till en vanlig rumpa längd, dvs ca 35 mm vid 55 ml puff över 2 sek, två gånger per minut och 8 sekunder pumpavgas tid.
- Vid slutet av exponeringsexperiment, stoppa mikrovåg programvara. Mjukvaran kommer att generera en fil som innehåller alla mätningar tillsammans med en grafisk framställning av partikelavsättning.
- Transfer tillbaka vävnader från odling base modul till odlingsplattan. Placera vävnaden tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet) tills mätningarna för de olika slutpunkterna vid de specifika postexponerings tidpunkter.
3. Mätning av Strålkroppen Beating
Obs: Enligt försöksplan (Figur 1), rekord ciliary slå före exponering och direkt efter exponeringen.
- Avlägsna vävnadsodlingsplattorna från inkubatorn och lämna dem under huven vid RT under 30 min för att stabilisera cilier slå.
- Placera vävnaderna under ljusmikroskop som är ansluten till CiliaMetrix Software.
- Spela filmen och frekvens (i Hertz) i strålkroppen misshandeln. Mäta frekvensen varje 3 sek under 1 minut.
- Avkastning vävnaderna tillbaka till inkubatorn vid 37 ° C (5% CO2, 90% fuktighet).
4. transepitelial Electrical Resistance (TEER) Mätning
Obs: Mätningen av TEER sker 3 dagar före och 48 timmar efter exponering under huven i sterilt tillstånd med hjälp Chopstick elektrod (STX-2) som är ansluten till en voltohmmeter.
- Lägg 200 | il odlingsmedia till den apikala ytan av de humana bronkiala vävnader.
- Slå på EVOMX maskin; tvätta elektrod med en 70% etanollösning.
- Tvätta elektroden med odlingsmediet.
- Mät resistansen (Ω) genom införing av elektroden i mediet på den apikala sidan av vävnadskultur utan att röra vävnaden.
- Upprepa steg 4.4 fem gånger för att få quintuplicate mätningar.
- Efter mätningarna, försiktigt bort mediet från den apikala sidan av vävnadskulturer använder en sug.
- Returnera vävnadskulturer till inkubatorn vid vid 37 ° C (5% CO2, 90% fuktighet) för odling.
5. cytokrom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 activity
- Innan starten av studien, förbereda luciferin detektionsreagenset genom att överföra hela innehållet i flaskan med lämplig beredning buffert till den gula flaskan innehållande luciferin detektionsreagenset (enligt tillverkarens anvisningar). Förvara portioner av 2 ml vid -20 ° C i högst 1 månad.
- För efter exponeringstid 48 h, inkubera vävnader för 48 timmar efter CS exponering vid 37 ° C.
- Värm Luciferin detektionsreagenset till RT.
- Inkubera vävnads skär i 3 h eller O / N med Luciferin-CEE-substrat (utspätt till 1:50) i det basala odlingsmedium.
- Överför 50 | il odlingsmedium från varje vävnad infoga till en 96-brunnars ogenomskinlig vit luminometer platta vid RT.
- Lägg 50 il luciferin detektionsreagens till varje brunn för att initiera en luminiscerande reaktion.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur under 20 minuter.
- Läs luminescensen med användning av en luminometer.
Obs: Förluminometer, använd en integrationstiden för 0,25-1 sek per brunn som en riktlinje.
6. RNA-extraktion.
- Innan uppsamling av 3D organotypiska vävnadsinlägg, förbereda en) en låda med torr is, 2) tillräcklig mängd av bladen (en per 3D infoga), 3) kall PBS utan kalcium-klorid och magnesiumklorid, 4) en 25 ml glas pipett, och 5 ) sterila glasnålar för aspiration.
- Etikett rör fyllda med keramiska pärlor för homogenisering fasta cellprov och lägga 700 pl Qiazol.
- Slå på aspiration maskin.
- Samla plattan av 3D organotypiska vävnads skär från inkubatorn.
- Tvätta varje insats på plattan 3 gånger med kall PBS. Mellan tvättar, aspirera PBS med glasålen. Efter den tredje tvättningen, att aspirera med PBS och täckplatta förhindra torkning av skäret.
- För varje insats från plattan, skär ut insatsen membran (som 3D vävnadsinsatsen bosatt) tills Membrane ligger platt ned på bladet.
- Överför vävnaden (tillsammans med insatsen membran) från bladet till homogeniserande röret lämpligt märkt och skruva på locket på tuben, skaka den och skaka den.
- Frys provet i torris och förvara vid -80 ° C eller fortsätta att extraktet RNA.
Obs: Innan utvinning av RNA, märka alla rör och kolumner enligt randomisering designen (om tillämpligt). Förbered alla reagenser enligt tillverkarens rekommendationer och ta ut prover från -80 ° C frys och tina dem på is tills de är helt upptinad.
- Homogenisering
- Grind prover med homogenisering instrument på 6000 Hz för 45 sek. Upprepa om proverna är inte ordentligt homogeniserad och lämna prover i 5 min vid RT.
- Lägg 140 l kloroform till provet och virveln för 10-15 sek.
- Överför supernatanten från homogeniserande rör till en fas lås röret och skaka på enthermoshaker under 2 min vid 1400 rpm och RT.
- Ytterligare inkubera prover för 2 min vid RT och Centrifugera proverna vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
- RNA nederbörd, tvätt, fjädring och rening i QIAcube.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen i ett nytt 2 ml-rör.
- Ladda alla nödvändiga reagenser i utvinning roboten enligt tillverkaren protokollsida, välj lämpligt protokoll, ställa elueringsvolymen (30 pl) och kör utvinning roboten.
- När körningen är klar, ta bort rotor adaptrar och hålla elueringsbetingelser rören omedelbart vid 4 ° C för vidare analys eller vid -80 ° C för långtidsförvaring.
- Kvalitetskontroll av den isolerade RNA
- Bestäm den mängd av det isolerade RNA med användning av en UV-läsare enligt tillverkarens instruktioner.
- Kontrollera kvaliteten av RNA och RNA integritet med hjälp mikroflödes-gel-baserade lab-on-a-chip och en UV-läsare, accOrding till tillverkarens instruktioner.
7. Microarray Workflow
Obs: Processen beskrivs nedan fokuserar på metoden för Affymetrix Genechip Hög genomströmning 3'IVT Express Kit, som används för målet syntes för hybridisering på Affymetrix 3 'genuttryck patroner från och med beredningen av RNA till användningen av en komplex vätskehanteringssystem (t.ex.., pipettering, späda, dispense eller integrera).
- Framställning
- Slumpa prov för att undvika batch effekter. Antalet prover behandlas av partier är 1-96, däribland en positiv (Commercial Human universalreferens RNA) och en negativ (RNas fritt vatten) kontroll per parti.
- Starta målet syntes med användning av 100 ng av totalt RNA i 3 | il RNas-fritt vatten. För 100 ng total-RNA, använd en 16 h inkubationstid.
- RNA-amplifiering
- Förbered Poly-A RNA spike-i kontrollösning av en serieutspädning av poly-A-RNA-lager med Poly-A Kontroll Utspädningsbuffert:
- För späd 1, förbereda 2 pl polyA kontroll lager i 36 ul spädningsbuffert.
- För späd 2, förbereda 2 pl utspädning 1 i 98 pl spädningsbuffert.
- För späd 3, förbereda 4 pl utspädning 2 i 196 pl spädningsbuffert.
- För späd 4, förbereda 20 pl utspädning 3 i 180 pl spädningsbuffert.
- Späd RNA i RNas-fritt vatten för att få en koncentration av 33,3 ng / ul.
- Lägg 2 pl av polyA kontrollösning på 3 pl av totala RNA-prov direkt i en 96-brunnsplatta. Detta steg utförs av vätskehanteringssystem.
- Förbered vätskehanteringssystem och mål syntes. Placera plattorna på roboten. Placera alla nödvändiga reagenser och laboratorieutrustning på däck. Roboten startar proceduren genom att förbereda appropriate mastermixes och inkubera proverna i den automatiserade fjärrstyrda PCR-block.
- Första Kvalitetskontroll Check: Kontroll av förstärkningen Process
- Om kvaliteten på ARNA är acceptabel, utföra fragmentering steget genom att lägga till varje prov 8 pl fragmentering 5X buffert (Detta steg utförs av vätskehanteringssystem). Annars utför föregående steg igen med början från RNA. Använd fragmenterad ARNA omedelbart eller lagra outspädda och splittrade ARNA vid -20 ° C (eller -70 ° C för längre tids förvaring).
- Utför en andra kvalitetskontroll analys genom att plocka upp slumpmässigt 12 prover i plattan och överföring 1 pl på mikrofluidik gel-baserat system för att kontrollera effektiviteten i fragmentering.
- Förbered Poly-A RNA spike-i kontrollösning av en serieutspädning av poly-A-RNA-lager med Poly-A Kontroll Utspädningsbuffert:
- Hybridisering förfarande
- Skanna chipstreckkoder och registrera varje prov i tillverkarens programvara enligt instruktionerna.
- Förbered hybridiseringsblandning somföljer för en enda reaktion och lägga till den i 33 pl av den fragmenterade och märkta ARNA: 4.2 l kontroll oligonukleotid B2 (3 nM), 12,5 | il 20x eukaryota hybridiseringsförfaranden kontroller, 25 pl 100% DMSO, 125 | il 2x hybridiseringsbuffert och 50 | il av H2O för en slutvolym av 216,7 pl
Notera: Hybridisera, tvätta och skanna positiva och negativa kontroller innan bearbeta prover. - Pre-väta arrayen med 200 pl av för-hybridiseringsblandning ingår i Hybridisering Tvätta och Stain Kit.
- Placera chip i hybridisering ugn inställd på 45 ° C och 60 varv per minut under 10 minuter.
- Under tiden, denaturera plattan (innehållande den slutliga cocktail hybridiseringsblandning) i en PCR-blocket vid 99 ° C under 5 min och 45 ° C under 5 min.
- Avlägsna grund hybridisering mix från arrayen och ersätta det med 200 l av hybridisering cocktail målet (ett prov per chip).
- Placera arrayen i hybriseringen ugn inställd på 45 ° C under 16 h (O / N) med en rotationshastighet av 60 varv per minut.
- Tvättning och färgning
- Kör "Fluidics" från programvaru menyraden. I dialogrutan Fluidics Markera modulen av intresse (1 - 4), välj sedan Prime_450 programmet till alla moduler. Placera slangen för tvättbufferten A i en flaska (400 ml) och för tvättbufferten B i en flaska (200 ml), samt för milliQ vatten i en flaska (500 ml).
- Därefter följer du instruktionerna på LCD-skärmen. Lyft upp nålar och placera 600 ul fläck cocktail 1 (SAPE Solution Mix) och 600 pl fläck cocktail 2 (Antibody Solution Mix) innehåller mikrocentrifugrör vid positionerna # 1 och # 2, och 900 pl Array Holding buffertlösning vid position # 3.
- Efter O / N inkubation i ugnen, aspirera cocktail från chipet och fyll microarray med 250 ul tvättbuffert A. Tilldela rätt chip till varje modul, välj FS450-001 protokollet och köra varje moDule, att följa anvisningarna på skärmen. Denna process pågår i 90 minuter.
- När LCD-skärmen visar "Eject kassett" meddelande, ta bort chipet och inspektera om det finns några bubblor. Om bubblor, fyll arrayen helt med Array hålla bufferten. Applicera etiketter på septa för att undvika eventuella läckor i skannern och rengör microarray fönstret innan du lägger i Scanner.
- Skanning.
- Värm upp skannern. Ladda chipet i automatiska mataren av skannern och starta skanningen.
Obs: Efter ~ 12 min per chip, är en .CEL fil per chip genereras. - Kontrollera bilden och rikta rutnätet (vid behov) till platsen för att identifiera de probcellerna.
Obs! Dataset har lämnats in till Arrayexpress (anslutningskoden = E-MTAB-1721).
- Värm upp skannern. Ladda chipet i automatiska mataren av skannern och starta skanningen.
8. Nätverksbaserade systembiologi Analys för en konsekvensbedömning
- Microarray databehandling.
Obs: Databehandling end scoringmetoder fördes med hjälp av R statistisk miljön version 2.14.- Öppna en R 18 session och ladda AFFY 19, gcrma och affyPLM paket installerade genom att köra kommandona: biblioteks (AFFY)> bibliotek (gcrma)> bibliotek (affyPLM)
- Läs rå datafiler som kör kommandot: data.affybatch <-ReadAffy ("sökvägen till den mapp där lagras de CEL-filer")
- Subtrahera bakgrundskorrigering och -kvantilen normale att generera sond inställda uttrycksvärden med hjälp av gcrma paketet, genom att köra kommandot: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
- Kvalitetskontroll.
- Generera RNA nedbrytnings tomter med kommandot: deg <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
- Utdrag koefficienten av backen RNA nedbrytning kör kommandot: lutning = deg $ lutning
- Rita lutningen koefficient och identifiera eventuella extremvärden.
- Generera Nuse och RLE tomter att köra följande kommandon: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> Nuse (Pset).
- Identifiera om vissa av de boxplots genereras är outliers: en array anses outlier om åtminstone två av de tre QC metrics definieras nedan avviker från de andra arrayer:
- Deg $ lutning skiljer sig från den genomsnittliga deg $ lutning
- Nuse plot: en array anses avvikare om den övre kvartilen stiger 0,95 eller lägre kvartilen över 1,05, det vill säga, om boxplot helt över 1,05 eller helt under 0,95..
- RLE plot: en array anses avvikare om medianen av RLE fördelningen är större än 0,1 eller mindre än -0,1. - Om en array identifieras som en avvikare, sedan kasta, och börja om från steg 8.1.2.
- Montera en övergripande linjär modell till data för de specifika kontraster av intresse (dvs., Jämförelser av "behandlad" och "kontroll" förhållanden) genererar rå P-värden för varje prob inställd på microarray, vilket kan vara furthennes justeras med hjälp av Benja-Hochberg förfarande för limma paketet. Välj ett probeset per gen för att hålla som representant för genen för ytterligare analyser som beskrivs i 20.
Obs: En blockfaktor (exponeringsplattan) från experimentet designen redovisades i modellen för databehandling.
- Nätverksbaserad analys.
Obs: Metoden som implementeras här beskrivs i detalj i Martin et al. (I revidering BMC bioinformatik).- För varje parvisa jämförelsen av intresse, börja från beräknade (log2-) vika ändringar (behandling mot kontroll) för varje gen under nätverket (från steg 8,2).
- Beräkna det undertecknade Laplace matris L av nätet som definieras av L (i, j) = - tecknet (i ~ j) w (i, j), om det finns en kant av vikt w (i, j) mellan nod i och j, L (i, j) = grader (i) är det viktade graden av I och L (i, j) = 0 annars. Vikten W (i, j) är lika med 1 om i och j är i huvudkedjan och w (i, j) = 1 / n om i är ett stamnät nod och j är en av dess N neighborer i avskriften lagret.
- Beräkna poäng för ryggraden med f = L3-1L2Tx där L3 är undermatris L till noderna ryggraden och L2 är under matris av L vars rader motsvarar de transkriptionskiktnoder och kolumnen till noderna ryggraden
- Beräkna undertecknade Laplace, Q, av nätverket definieras av stamnät där alla kant tecken är omvända.
- Beräkna NPA poäng genom NPA = fTQf.
- Beräkna konfidensintervall, ryggraden kant permutation p-värde och avskriften skiktet permutation p-värde.
Anm: (. T.ex. den biologiska variationen mellan proverna i en försöksgrupp) Utöver de konfidensintervall för NPA poäng, som står för den experimentella fel, följeslagare statistik härleddes att beskriva specificitet NPA poäng till biologin beskrivna i nätet. Eftersom NPA är en kvadratisk form av veck förändringar, kan dess varians beräknas utifrån den utfällbara förändringen uppskattas variances. Ett konfidensintervall därefter härleds med hjälp av centrala gränsvärdessatsen. Två permutationstester genomfördes 21 vari först, för att bedöma om resultaten var specifika för den underliggande bevis (dvs., Gen fold-förändringar) i modellen, vilket leder till en permutation P-värde (betecknas med * O i siffrorna då P -värde <0,05). För det andra, för att bedöma om "orsak-och-verkan" skikt av nätet i hög grad bidragit till amplituden av nätverket störning (betecknas med K * i figurerna då P-värde <0,05). - Betrakta det nätverk som påverkas av behandlingen, om konfidensintervallet inte innehåller noll och de två permutations p-värden <0,05.
- Beräkna de ledande noder som definieras som nyckel noder i ryggraden bidrar med upp till 80% av NPA poäng.
Representative Results
I resultat som beskrivs nedan, de organotypiska vävnaderna var primära humana epitelceller isolerade från friska, rökfria, kaukasiska donatorer och rekonstituerades använder fibroblaster 15.
3D bronkial och nasala vävnadsmodeller
In vitro bronkial och nasala organotypiska modellerna liknar på cellnivå människans luftvägar epitel (Figur 2).
CS exponering
Organotypiska bronkial och nasala vävnad modeller kan upprepade gånger utsättas för vanliga CS vid luft-vätskegränssnittet. Den rökexponering experimentella förfarande som används för resultaten som visas här är avbildad i Figur 1.
Inspelning av cilie stryk
Cilia misshandeln spelades in i luftexponerade vävnader som visas i filmerna. CS exponering var associerad med en minskning av strålkroppen slå frekvens: den starkare topp observeras runt4 Hz i sken exponerad och innan exponering är inte observeras längre efter CS exponering (Figur 3). Detta reducerade frekvensen skulle göra cilier slår mindre effektiva för att avlägsna slem och smittämnen 22.
Mätning av TEER och CYP1A1 / 1B1 aktivitet
TEER mättes 48 timmar efter den sista exponeringen för att säkerställa att vävnaden är fortfarande funktionella. CYP1A1 / 1B1 aktiviteten mättes också 48 timmar efter avslutad exponering som visas i figur 1. De Teer värden i CS-exponerade vävnader var inte signifikant jämfört med luftexponerade vävnader som bekräftar att det inte finns någon större cytotoxiska effekten av rök vid denna koncentration. Vid 48 h efter exponering, var CYP1A1 / 1B1 aktivitet av vävnaderna ökat något, vilket indikerar en måttlig ökning av vävnad försvarsmekanism efter exponering (Figur 4).
Genuttrycksprofilerna och nätverksbaserade system biology tillvägagångssätt för att studera effekterna av CS exponering på förändring av xenobiotisk metabolism
Vävnader uppsamlades vid 48 h efter exponering tidpunkterna. Därefter var microarray analys som genomförts för att generera genuttrycksprofilerna av CS- och luftexponerade vävnader. Inverkan av CS exponering på xenobiotisk metabolism undersöktes med hjälp av en nätverksbaserad systembiologi strategi belånade från gen-uttryck profiler och som tidigare 15 rapporterats. Med hjälp av en nätverksbaserad systembiologi synsätt visar att CS exponeringseffekter på nivån av noder ryggraden i xenobiotisk Metabolism nätverksmodellen var snyggt korrelerade mellan in vitro och in vivo dataset (Figur 5). Däremot på nivån för varje enskild gen-uttryck förändringar, var fattiga korrelationer observer mellan in vitro (CS-exponerade mot luftexponerade) och in vivo (rökare kontra ickerökarna).
Figur 1. Schematisk förfarande av upprepad exponering av CS till organotypic bronkial vävnadsmodeller Förkortningar:. CYP, cytokrom P450; CS, cigarettrök; TEER, transepiteliala elektriska resistansen.
Figur 2. Organotypiska bronkial- och nasala epiteliala vävnadsodlingsmodeller. Tecknad illustrerar bronkial (A) och nasal (B) vävnadsodlingsinsatsen vid luft-vätskegränssnittet. De in vitro-modeller innehöll cilie celler som visas i den apikala lagret av Hematoxylin & Eosin färgade celler (C för bronkial, D för nasal) som tidigare 15 rapporterats. Modellerna samodlades med fibroblaster som är viktiga för tillväxt och differentiering av epitelceller (anges med pilar). Färgning av luftvägs härstamning markörer: P63 (E för bronkial, F för nasal) och Muc5AC (G för bronkial, H för nasal) visas som tidigare 15 rapporterats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flimmerhår Beating Frekvens. Flimmerhår stryk frekvens (CBF) mättes i luft-exponerade och i kulturen före och efter exponering. Minskat CBF sågs efter CS exponering (representativa resultat från två insats visas som replikat 1 (R1) och replikera 2 (R2)).
ad / 52.325 / 52325fig4.jpg "/>
Figur 4. Mätning av CYP1A1 / CYP1B1-aktivitet och TEER. Vänster pannels indikerar CYP1A1 / CYP1B1-aktivitet i den bronkiala (A) och nasal (b) vävnadsmodeller. Högra panelerna indikerar TEER mätning i bronkial (C) och nasal (D) vävnadsmodeller. Medel ± SD visas. Förkortningar: CS, cigarettrök; CYP, cytokrom P450; TEER, transepiteliala elektriskt motstånd; RLU, relativa luminescense enhet.
Figur 5. Nätverksbaserade systembiologi strategi för bedömning av CS exponering i samband med xenobiotisk metabolism påverkan. Förändringarna av genuttryck nivåer användes för att beräkna aktiveringen av ryggraden nod i nätverket modellen xenobiotisk Metabolism (A) strong> som rapporterats i en tidigare publikation 15. Figuren till höger illustrerar begreppet kvantifieringen av ryggraden noder, även känd som "differentiell nätverksvärdet ryggrad," med hjälp av NPA tillvägagångssätt. De blå ovaler representerar aktiviteten av noderna ryggraden (dvs., Det funktionella lagret) och de gröna kulorna representerar expressionen av gener (dvs., Den transkriptionella skiktet). Effekterna av CS exponering i organotypic bronkiala vävnader (in vitro, CS-exponerade kontra luftexponerade) vid 48 h efterexponering jämfördes med de för rökning på humant bronkialepitelceller uppsamlades genom bronkoskopi och nasal epiteliala genom burshing inferior turbinata (GSE16008 ) (in vivo, rökare vs. nonsmokers) (B). Inlägg, ändrar korrelation av genexpression mellan in vitro och in vivo datauppsättningar. Förkortningar: CS, cigarettrök; NPA, nätverksstörnings amplitud.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här har vi visat att tillämpningen av mänskliga organotypisk bronkial och nasala vävnadsmodeller för att bedöma effekten av upprepad CS exponering. Som ett alternativ till djurförsök, har ett antal exponeringssystem utvecklats för toxikologiska bedömningar av aerosolexponering in vitro (t.ex.., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Dessa exponeringsmoduler kan också användas för en toxikologisk bedömning av luftburna föroreningar, luftburna partiklar, nanopartiklar, etc. I denna studie använde vi Vitrocell system som kan rymma upp till 48 olika prov samtidigt, vilket möjliggör större skala experiment och lägre variabilitet mellan behandlingar. För varje aerosol exponering in vitro, risken för förorening vävnadskultur är fortfarande en stor risk vars begränsning kräver en noggrann hantering av vävnadskulturer hela experimenten.
Mätning partikelavsättning i realtid på mikrovåg under eXposure experiment gör det möjligt att övervaka att CS doserna som genereras från exponeringssystemet som överensstämmer med förväntningarna. För att säkerställa riktigheten av de uppmätta partikelavsättning, inrätta online mätningen korrekt innan exponeringen är critial, t.ex. inrätta skalan till 0. Dessutom, på grund av skillnaden mellan de områden av mikrovåg (cm 2) och vävnadsodlingsinsatsen (0,33 cm 2), justerat vi den slutliga beräkningen till området för odlingsinsatsen: endast 33% av avsättningen på mikrovåg återspeglar den faktiska deponeringen i odlingsinsatsen.
Mätning av TEER att utröna tät-korsning barriär funktionalitet och bedöma störningar av epitelskiktet är en relativt enkel procedur att genomföra, som vi rapporterade här. Men eftersom bronkial och nasala vävnad modellerna innehåller slemproducerande insprängda bägarceller behöver apikala tvättning utföras innan Teer measurement. Den apikala tvätt är kritisk, eftersom förekomsten av slemlagret och variationen av sin tjocklek burk partiskhet mätning av TEER, interferring med effekterna av CS exponering. Detta begrepp är i överensstämmelse med vad som rapporterades av Hilgendorf och kollegor, där permeabilitet Caco-2 celler som påverkas av samtidig odling med slem-producerande bägare cellinje HT29 23. Den slem måste tvättas bort före TEER mätning, eftersom apikal tvätt precis innan exponeringen kan störa vävnads svar på CS. Därför mätningen utförs tre dagar före exponering, och inte precis innan exponeringen.
Vi visade att CYP1A1 / CYP1B1-aktivitet kunde mätas från organotypiska odlingsmodeller efter CS exponering trots att aktiviteten endast måttligt ökade med CS. Denna svag signal kan förstärkas genom en längre inkubation av CYP1A1 / 1B1 substrat (dvs., Luciferin-CEE), till exempel för24 h (data ej visade). En av begränsningarna av CYP aktivitetsmätning i detta arbete är frånvaron av normalisering till CYP proteinnivå eller till celltal, vilket skulle kunna beaktas vid framtida studier för att säkerställa att förändringen på enzymaktiviteten inte påverkas genom förändring av antingen proteinnivån eller celltal.
Vi rapporterade att CS exponering hämmade strålkroppen slå i både nasala och bronkial vävnadsmodeller. Liknande observationer gjordes i olika däggdjurs- och icke-däggdjurs modellerna 12. För ciliär slå mätning, se till att vävnaderna hanteras och behandlas på ett liknande sätt är kritisk, till exempel om medel förändring genomförs bör det tillämpas för alla prover. Sutto och kollegor rapporterade att pH påverkade däggdjur strålkroppen slå frekvens 24. Så när man jämför slå frekvenser mellan celler som behandlats med olika beredningar avsedda / blandningar, pHjustering bör övervägas för att minimera variabiliteten av ciliära stryk mätning. Dessutom är också kritisk temperatur vid vilken mätningen utförs som frekvensen av ciliära stryk sjunker med sjunkande temperatur. För att minimera variabiliteten på grund av dessa förändringar, en scen-top inkubator, utrustade med temperatur, CO 2, och fuktighetskontroll användes i denna studie. Trots detta, konstaterade vi att ciliära slå frekvenser i bronkerna vävnader efter CS exponering var mycket varierande (ie., Ökar i en insats och minska i den andra insatsen), vilket tyder på att strålkroppen misshandeln är mycket störd direkt efter exponering. Däremot observerade vi avsaknaden av mätbara ciliär beating frekvenser i nasala vävnad efter CS exponering, vilket tyder på att svaret på den nasala vävnad är känsligare och konsekvent. Detta är i överensstämmelse med en tidigare publikation som visar att nasala vävnad har en lägre kapacitet att avgifta somjämfört med luftrör 25.
Slutligen visade vi att genuttryck profilering från organotypisk bronkial och nasala vävnadsmodeller utsätts för CS kunde påvisa en inverkan på CS på xenobiotisk metabolism. Intressant den observerade förändringen i xenobiotisk metabolism i organotypisk bronkial och nasal in vitro-modeller utsatta för CS likna in vivo situationen hos rökare som diskuteras mer i detalj i en tidigare publikation 15. För genuttryck analyser, med hjälp av fjärrstyrt instrument gör en hög genomströmning analys möjlig. Dessutom ökar automatiskt robothantering mer enhetligt och noggrannheten i genuttryck resultaten. Trots snabb insamling av vävnadsproverna var avgörande för att undvika RNA nedbrytning under RNA-extraktion. Den RNA-bearbetning och transcriptomic strategier som beskrivs här kan också tillämpas på in vivo vävnadsprover.
Disclosures
Denna studie har finansierats av Philip Morris International.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Maurice Smith och Marja Talikka för deras granskning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
| MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
| VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
| 3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
| 30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
| CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
| Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
| LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
| Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
| EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
| Luciferin Detection Reagent | |||
| MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
| QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
| Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
| Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |
References
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
- Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
- Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
- Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
- Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
- Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
- Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
- Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
- Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
- Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
- Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
- Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
- ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
- R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
- Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
- Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
- Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
- Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
- Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
- Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).
