The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
هنا، لقد أثبتنا مدى انطباق الشعب الهوائية عضوي النمط البشري ونماذج الأنسجة الأنفية لتقييم تأثير التعرض المتكرر CS. كبديل لالتجارب على الحيوانات، تم تطوير عدد من النظم التعرض لتقييم السمية من التعرض الهباء الجوي في المختبر (على سبيل المثال، Vitrocell، Cultex، أليس، وما إلى ذلك). يمكن أيضا أن تستخدم هذه الوحدات التعرض لتقييم سمية الملوثات المحمولة جوا، والجسيمات المحمولة جوا، والجسيمات النانوية، وما إلى ذلك وفي هذه الدراسة، استخدمنا نظام Vitrocell التي يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب على نطاق أوسع وانخفاض التباين بين العلاجات. لكل التعرض الهباء الجوي في المختبر، وخطر التلوث زراعة الأنسجة يبقى خطرا كبيرا الذي يتطلب معالجة دقيقة من مزارع الأنسجة في جميع أنحاء التجارب التخفيف.
قياس ترسب الجسيمات في الوقت الحقيقي على توازن دقيق خلال البريدالتجربة xposure تسمح لمراقبة أن جرعات CS المتولدة من نظام التعرض هي مطابقة للتوقعات. لضمان دقة من ترسب الجسيمات قياس و الضبط لقياس عبر الإنترنت بشكل صحيح قبل التعرض غير critial، على سبيل المثال، ووضع مقياس ل0. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلاف بين المناطق في توازن دقيق (سم 2) و إدراج زراعة الأنسجة (0.33 سم 2)، ونحن تعديل الحساب النهائي إلى منطقة إدراج الثقافة: 33٪ فقط من ترسب على توازن دقيق تعكس ترسب الفعلي في إدراج الثقافة.
قياس طير للتأكد من وظيفة حاجز ضيق تقاطع وتقييم اختلال طبقة الطلائية هو إجراء سهل نسبيا لتنفيذ، والتي نشرنا عنها هنا. ومع ذلك، لأن الشعب الهوائية والأنف نماذج الأنسجة تحتوي على خلايا كأس يتخلل المنتجة للمخاط، يحتاج غسل قمي التي يتعين القيام بها قبل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف طيرurement. غسل قمي أمر بالغ الأهمية لأن وجود طبقة المخاط وتباين لها سمك يمكن التحيز قياس طير، interferring مع تأثير التعرض CS. هذه الفكرة هي في الاتفاق مع ما جاء عن Hilgendorf والزملاء، والتي تأثرت نفاذية كاتشو-2 خلايا من الرئيسين زراعة مع خط الخلية القدح المنتجة للمخاط HT29 23. يحتاج المخاط ليتم غسلها قبل قياس طير، لأن غسل قمي الحق قبل التعرض قد تتداخل مع ردود الأنسجة لCS. لذلك، يتم إجراء قياس قبل ثلاثة أيام من التعرض، وليس صحيحا قبل التعرض.
نحن أظهرت أن النشاط CYP1A1 / CYP1B1 يمكن قياسها من نماذج ثقافة عضوي النمط بعد التعرض CS على الرغم من أن النشاط تم زيادة متواضعة فقط من قبل CS. هذه إشارة ضعيفة يمكن تضخيمها من قبل حضانة أطول من الركيزة CYP1A1 / 1B1 (أي.، وسيفيرين-CEE)، على سبيل المثال ل24 ساعة (لا تظهر البيانات). واحدة من القيود المفروضة على قياس النشاط CYP في العمل الحالي هو غياب التطبيع إلى مستوى البروتين CYP أو إلى عدد خلايا، والتي يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار للدراسات المستقبلية للتأكد من أن تغيير على نشاط الإنزيم لا يتأثر قبل تغيير أي من مستوى البروتين أو عدد خلايا.
أبلغنا أن التعرض CS تحول دون الهدبية الضرب في كل من الأنف ونماذج الأنسجة الشعب الهوائية. وقد أجريت ملاحظات مماثلة في نماذج الثدييات وغير الثدييات متنوعة 12. لالهدبية الضرب القياس، وضمان أن يتم التعامل مع الأنسجة ويعامل بطريقة مماثلة أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال إذا تم تنفيذها تغيير المتوسطة، فإنه ينبغي تطبيق لجميع العينات. ذكرت Sutto وزملاؤه أن الرقم الهيدروجيني أثرت على الهدبية الثدييات الضرب تردد 24. وهكذا، عند المقارنة بين الضرب الترددات بين الخلايا المعالجة مع مختلف على compunds / مخاليط، ودرجة الحموضةوينبغي النظر في تعديل للحد من تقلب القياس الهدبية الضرب. وعلاوة على ذلك، فإن درجة الحرارة التي يجري القياس أمر بالغ الأهمية أيضا كما تردد من الهدبية الضرب قطرات مع تناقص درجات الحرارة. للحد من تقلب الواجب لهذه التغييرات، حاضنة مرحلة أعلى، مجهزة درجة الحرارة، CO 2، ومراقبة الرطوبة واستخدمت في هذه الدراسة. على الرغم من هذا، لاحظنا أن الهدبية الضرب الترددات في أنسجة الشعب الهوائية بعد التعرض CS كان متغير بدرجة كبيرة (أي، زيادة في إدراج واحد وخفض في إدراج أخرى)، مما يوحي بأن الضرب الهدبي هو الحق مضطرب للغاية بعد التعرض. في المقابل، لاحظنا غياب قابلة للقياس الترددات الهدبية الضرب في أنسجة الأنف بعد التعرض CS، مما يشير إلى أن الاستجابة للأنسجة الأنف هي أكثر حساسية ومتسقة. ويتفق ذلك مع نشر السابق تبين أن الأنسجة الأنفية لديها قدرة أقل على إزالة السموم كمامقارنة مع القصبات الهوائية 25.
وأخيرا، فإننا أظهرت أن التعبير الجيني التنميط من الشعب الهوائية عضوي النمط ونماذج الأنسجة الأنفية تتعرض لCS يمكن أن تثبت لها تأثير على التمثيل الغذائي للCS أجنبي بيولوجيا. ومن المثير للاهتمام، وتغيير لوحظ في التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا في الشعب الهوائية والأنف عضوي النمط في نماذج المختبر تتعرض لCS أن تشبه الوضع في الجسم الحي في المدخنين كما تمت مناقشته بمزيد من التفصيل في منشور السابق 15. ليحلل التعبير الجيني، وذلك باستخدام أداة الروبوتية يجعل تحليل الإنتاجية العالية ممكن. وعلاوة على ذلك، ويزيد من معالجة الروبوتية التلقائي مزيد من الاتساق ودقة النتائج التعبير الجيني. ومع ذلك، كان جمع سريع من عينات الأنسجة حاسم لتجنب تدهور RNA خلال استخراج الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا معالجة RNA والنهج transcriptomic الموصوفة هنا يتم تطبيقها على عينات الأنسجة في الجسم الحي.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر موريس سميث ومارجا Talikka لاستعراضها من المخطوطة.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |