The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
ここでは繰り返さCS暴露の影響を評価するために、人間の器官の気管支および鼻組織モデルの適用可能性を実証した。動物実験の代替として、露光システムの数は、インビトロでのエアロゾル暴露の毒性評価のために開発された( 例えば 、Vitrocell、Cultex、ALICE、等)。これらの露出モジュールはまた、本研究では等大気汚染物質、浮遊微小粒子、ナノ粒子の毒性学的評価のために利用することができ、我々は、大規模実験との間の低い変動性を考慮し、同時に48の異なるサンプルまで収容することができVitrocellシステムを使用しトリートメント。 インビトロでのすべてのエアロゾル暴露のために、組織培養の汚染の危険性は、その緩和の実験を通して組織培養物の慎重な取り扱いが要求される大きなリスク残る。
電子天秤の間にリアルタイムで粒子沈着を測定するxposure実験は、露光システムから生成されたCS用量は期待に適合していることを監視することができます。段取りオンライン測定を正確に露光する前には、 例えば 、critialなぜなら微量天秤(cm 2)との面積の差により、さらに0にスケールを設定し、測定された粒子の沈着の精度を確保するため組織培養インサート(0.33 cm 2)を 、我々は、培養インサートの領域に最終的な計算を調整する:天秤上の堆積のわずか33%が、培養インサートの実際の堆積を反映する。
タイトジャンクションのバリア機能を確認すると、上皮層の破壊を評価するためにTEERの測定は、私たちがここで報告された、実装するための比較的簡単な手順である。気管支および鼻組織モデルは、粘液産生散在杯細胞を含有してので、頂端洗浄TEER measの前に実行される必要があるurement。粘液層の存在およびその厚缶バイアスTEERの測定のばらつきは、CS暴露の影響をinterferringのでアピカル洗浄が重要である。この概念はのどぐろしたCaco-2細胞の透過性、粘液産生杯細胞株HT29 23との共培養によって影響された同僚によって報告されたものと一致している。粘液は、右露光前頂端洗浄CSに対する組織反応を妨害する可能性があるため、事前のTEER測定を洗い流される必要がある。したがって、測定は3日間の曝露の前に行われ、露光前、右されていません。
我々は、活性は軽度にしかCSによって増加したが、CYP1A1 / CYP1B1活性がCS曝露後の器官培養モデルから測定することができることを示した。この弱い信号のために、例えば、CYP1A1 / 1B1の基質( すなわち 、ルシフェリン-CEE)のより長いインキュベーションによって増幅することができる24時間後(データは示さず)。本研究におけるCYP活性測定の限界の一つは、CYPタンパク質のレベルまたは酵素活性に変化が影響を受けないことを保証するために、将来の研究のために考慮することができる細胞数に正規化が存在しないことであるタンパク質レベルまたは細胞数のいずれかの変化によって。
私たちは、CS曝露が鼻および気管支組織モデルの両方に繊毛運動を阻害したことを報告した。同様の観察は、多様な哺乳動物および非哺乳動物のモデル12で行った。繊毛運動の測定のために、組織は同様の方法で処理し、処理されることを保証することは培地交換が実施される場合、例えば、それは、すべてのサンプルに適用されるべき、重要である。 Suttoらは、pHが、周波数24を破って、哺乳動物の毛様体に影響を与えたことを報告した。したがって、異なるcompunds /混合物で処理した細胞との間の拍動頻度を比較した場合、pHは調整は、繊毛運動測定のばらつきを最小限にするために考慮されるべきである。繊毛運動の周波数は温度の低下と共に低下するとまた、測定を行う際の温度も重要である。本研究で使用した温度、CO 2、及び湿度制御が装備これらの変更、ステージトップインキュベーターによるばらつきを最小限にすることができる。それにもかかわらず、我々は、CS曝露後の気管支組織中の周波数を破っ繊毛の繊毛運動は、露光後の非常に乱れた権利であることを示唆している、高度に可変( すなわち一つのインサートが増加し、他のインサートの減少)であったことを観察した。対照的に、我々は、鼻組織の反応の感受性と一致していることを示唆し、CS曝露後鼻組織に測定可能な繊毛運動周波数が存在しないことを観察した。これは、鼻組織のように解毒する低い能力を有することを示した以前の出版物と一致している気管支25と比較した。
最後に、CSに曝露された器官の気管支および鼻組織モデルからの遺伝子発現プロファイリングは、生体異物代謝にCSの影響を実証することを示した。興味深いことに、CSに曝露しビトロモデルにおける器官気管支及び鼻内異物代謝において観察された変化は、以前の刊行物15に詳細に説明するように喫煙者におけるインビボの状況と似ている。遺伝子発現解析のために、ロボティック機器を使用するハイスループット分析を可能にする。また、自動ロボットハンドリングはさらに、遺伝子発現の結果の一貫性及び精度が向上する。それにもかかわらず、組織サンプルの迅速な収集はRNA抽出中にRNAの分解を避けるために重要であった。ここで説明するRNA処理とトランスクリプトームアプローチはまた、 インビボでの組織サンプルに適用することができる。
The authors have nothing to disclose.
著者は、原稿の彼らのレビューのためにモーリス·スミスとマルヤTalikkaに感謝したいと思います。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |