The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
여기서는 반복 CS 노출의 영향을 평가하는 인간의 Organotypic 기관지 비강 조직 모델의 적용 가능성을 보여 주었다. 동물 실험에 대한 대안으로, 노광 시스템의 수는 (예., Vitrocell, Cultex, ALICE 등) 시험관 내에서 에어로졸 노출 독성 평가를 위해 개발되었다. 이러한 노광 모듈도 본 연구 등 공수 오염 물질, 공기 중의 입자, 나노 입자의 독성 학적 평가를 위해 이용 될 수 있고, 우리는 더 큰 규모의 실험 간의 낮은 가변성을 허용 동시에 48 가지의 다른 샘플들까지 수용 할 수 Vitrocell 시스템을 사용 치료. 시험관 내에서 모든 에어로졸 노출, 조직 배양 오염의 위험은 저감 그 실험에 걸쳐 조직 배양의 취급에주의를 요구하는 주요 위험 남아있다.
E 중 미량 천칭에 실시간 입자 침착을 측정xposure 실험은 노출 시스템에서 생성 된 CS 량은 기대에 부합하는 것을 모니터링 할 수 있습니다. 설정해서 온라인 측정을 정확하게 노광 전에 것은, 예 critial 때문에 마이크로 저울 (cm 2)의 영역의 차이, 또한 0으로 스케일을 설정하고, 측정 된 입자의 증착의 정확성 조직 배양 인서트 (0.33 cm 2), 우리는 배양 인서트의 영역에 최종 계산을 조정 된 미량 천칭에 증착 단지 33 %가 배양 인서트의 실제 증착을 반영한다.
꽉 접합 장벽 기능을 확인하고 상피 층의 중단을 평가하기 위해 봉사자의 측정은 우리가 여기에보고 구현하기 비교적 쉬운 과정이다. 비강 및 기관지 조직 모델 점액 생산 산재 배 세포를 포함하기 때문에, 정점 세척 봉사자 MEAS 전에 행할 필요하여 연산. 정점 세척 중요하므로 점액층의 존재 및 CS 노출의 영향 interferring 두께 캔 바이어스 티에르의 측정 가변성. 이 개념은 Hilgendorf 및 카코-2 세포의 투과성이 점액을 생산하는 술잔 세포 라인 HT29 (23)와 공동 배양에 의해 영향을 받았다있는 동료들에 의해보고 된 것과 일치한다. 바로 노출 전에 혀끝의 세척 CS에 대한 조직 반응을 방해 할 수 있기 때문에 점액 전에 봉사자 측정에 씻어해야합니다. 따라서, 측정은 노출 3 일 전에 수행 및 노출되기 직전되지 않습니다.
우리는 활동이 완만 한 CS 증가되었지만 CYP1A1 / CYP1B1 활동이 CS 노출 다음의 Organotypic 문화 모델에서 측정 될 수 있음을 보여 주었다. 이 약한 신호는 CYP1A1 / 1B1 기판의 장기간 배양에 의해 증폭 될 수있다 (예., 루시페린 – CEE), 예컨대 대24 시간 (데이터 미기재). 본 연구에서 CYP 활성 측정의 한계 중 하나는 효소 활성에 변화가 영향을받지 않도록 CYP 단백질 수준 또는 미래 연구를 위해 고려 될 수있는 세포 수로 정규화 결석 단백질 수준 또는 세포 수의 변화 중 하나에 의하여.
우리는 CS 노출은 비강과 기관지 조직 모델을 모두 제치고 섬모를 억제 보도했다. 비슷한 관찰 다양한 포유 동물 및 비 – 포유 동물 모델 (12)에서 수행 하였다. 섬모가 측정 치는 조직을 유사한 방식으로 처리하고 처리하도록 할 변화 매체가 구현되는 경우, 모든 샘플에 적용되어야한다, 예를 들면, 중요하다. Sutto와 동료들은 pH가 주파수 (24)를 때리고 포유 동물의 섬모에 영향을 보도했다. 따라서, 다른 compunds / 혼합물의 pH로 처리 한 세포 사이의 주파수를 치고 비교할 때조정은 모양체 박동 측정의 변동을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 모양체 고해 주파수가 감소함에 따라 온도 강하 더욱이, 측정이 수행되는 온도는 중요하다. 본 연구에서 사용 된 온도, CO 2, 조습 갖추고 이러한 변화, 탑 스테이지 배양기에 의한 변동을 최소화. 그럼에도 불구하고, 우리는 CS 노출 후 기관지 조직에 주파수를 치는 섬모는 섬모 구타 노출 후 매우 방해 권리가 있음을 시사 매우 변수 (예., 하나 삽입 증가하고 다른 삽입 감소)이라고 관찰했다. 대조적으로, 우리는 비강 조직의 반응이 더 민감하고 일관성이 있음을 시사 CS 노광 후의 비강 조직에서 측정 모양체 비팅 주파수의 유무를 관찰했다. 이 비강 조직으로 독을 제거하기 위해 낮은 용량을 가지고 있음을 보여주는 이전의 출판물과 일치한다기관지 (25)와 비교.
마지막으로, 우리는 CS에 노출의 Organotypic의 기관지와 코 조직 모델에서 프로파일 유전자 발현이 생체 이물 대사에 CS의 영향을 설명 할 수 있음을 보여 주었다. 이전 출판 (15)에 자세히 설명한 바와 같이 흥미롭게도, CS에 노출 체외 모델에서 관찰의 Organotypic의 기관지에서 생체 이물 대사 변경과 코는 흡연자의 생체 내 상황의 유사. 유전자 발현 분석을 위해, 로봇 기기를 사용하면 높은 처리량 분석을 가능하게한다. 또한, 자동 핸들링 로봇은 상기 유전자 발현 결과의 일관성 및 정확성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 조직 샘플의 신속한 수집 RNA 추출 중에 RNA의 분해를 방지하는 것이 중요했다. RNA 프로세싱 및 여기서 설명 transcriptomic 접근법은 또한 생체 조직 샘플에 적용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 원고의 자신의 검토를 위해 모리스 스미스와 Marja Talikka에게 감사의 말씀을 전합니다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |