The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Här har vi visat att tillämpningen av mänskliga organotypisk bronkial och nasala vävnadsmodeller för att bedöma effekten av upprepad CS exponering. Som ett alternativ till djurförsök, har ett antal exponeringssystem utvecklats för toxikologiska bedömningar av aerosolexponering in vitro (t.ex.., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Dessa exponeringsmoduler kan också användas för en toxikologisk bedömning av luftburna föroreningar, luftburna partiklar, nanopartiklar, etc. I denna studie använde vi Vitrocell system som kan rymma upp till 48 olika prov samtidigt, vilket möjliggör större skala experiment och lägre variabilitet mellan behandlingar. För varje aerosol exponering in vitro, risken för förorening vävnadskultur är fortfarande en stor risk vars begränsning kräver en noggrann hantering av vävnadskulturer hela experimenten.
Mätning partikelavsättning i realtid på mikrovåg under eXposure experiment gör det möjligt att övervaka att CS doserna som genereras från exponeringssystemet som överensstämmer med förväntningarna. För att säkerställa riktigheten av de uppmätta partikelavsättning, inrätta online mätningen korrekt innan exponeringen är critial, t.ex. inrätta skalan till 0. Dessutom, på grund av skillnaden mellan de områden av mikrovåg (cm 2) och vävnadsodlingsinsatsen (0,33 cm 2), justerat vi den slutliga beräkningen till området för odlingsinsatsen: endast 33% av avsättningen på mikrovåg återspeglar den faktiska deponeringen i odlingsinsatsen.
Mätning av TEER att utröna tät-korsning barriär funktionalitet och bedöma störningar av epitelskiktet är en relativt enkel procedur att genomföra, som vi rapporterade här. Men eftersom bronkial och nasala vävnad modellerna innehåller slemproducerande insprängda bägarceller behöver apikala tvättning utföras innan Teer measurement. Den apikala tvätt är kritisk, eftersom förekomsten av slemlagret och variationen av sin tjocklek burk partiskhet mätning av TEER, interferring med effekterna av CS exponering. Detta begrepp är i överensstämmelse med vad som rapporterades av Hilgendorf och kollegor, där permeabilitet Caco-2 celler som påverkas av samtidig odling med slem-producerande bägare cellinje HT29 23. Den slem måste tvättas bort före TEER mätning, eftersom apikal tvätt precis innan exponeringen kan störa vävnads svar på CS. Därför mätningen utförs tre dagar före exponering, och inte precis innan exponeringen.
Vi visade att CYP1A1 / CYP1B1-aktivitet kunde mätas från organotypiska odlingsmodeller efter CS exponering trots att aktiviteten endast måttligt ökade med CS. Denna svag signal kan förstärkas genom en längre inkubation av CYP1A1 / 1B1 substrat (dvs., Luciferin-CEE), till exempel för24 h (data ej visade). En av begränsningarna av CYP aktivitetsmätning i detta arbete är frånvaron av normalisering till CYP proteinnivå eller till celltal, vilket skulle kunna beaktas vid framtida studier för att säkerställa att förändringen på enzymaktiviteten inte påverkas genom förändring av antingen proteinnivån eller celltal.
Vi rapporterade att CS exponering hämmade strålkroppen slå i både nasala och bronkial vävnadsmodeller. Liknande observationer gjordes i olika däggdjurs- och icke-däggdjurs modellerna 12. För ciliär slå mätning, se till att vävnaderna hanteras och behandlas på ett liknande sätt är kritisk, till exempel om medel förändring genomförs bör det tillämpas för alla prover. Sutto och kollegor rapporterade att pH påverkade däggdjur strålkroppen slå frekvens 24. Så när man jämför slå frekvenser mellan celler som behandlats med olika beredningar avsedda / blandningar, pHjustering bör övervägas för att minimera variabiliteten av ciliära stryk mätning. Dessutom är också kritisk temperatur vid vilken mätningen utförs som frekvensen av ciliära stryk sjunker med sjunkande temperatur. För att minimera variabiliteten på grund av dessa förändringar, en scen-top inkubator, utrustade med temperatur, CO 2, och fuktighetskontroll användes i denna studie. Trots detta, konstaterade vi att ciliära slå frekvenser i bronkerna vävnader efter CS exponering var mycket varierande (ie., Ökar i en insats och minska i den andra insatsen), vilket tyder på att strålkroppen misshandeln är mycket störd direkt efter exponering. Däremot observerade vi avsaknaden av mätbara ciliär beating frekvenser i nasala vävnad efter CS exponering, vilket tyder på att svaret på den nasala vävnad är känsligare och konsekvent. Detta är i överensstämmelse med en tidigare publikation som visar att nasala vävnad har en lägre kapacitet att avgifta somjämfört med luftrör 25.
Slutligen visade vi att genuttryck profilering från organotypisk bronkial och nasala vävnadsmodeller utsätts för CS kunde påvisa en inverkan på CS på xenobiotisk metabolism. Intressant den observerade förändringen i xenobiotisk metabolism i organotypisk bronkial och nasal in vitro-modeller utsatta för CS likna in vivo situationen hos rökare som diskuteras mer i detalj i en tidigare publikation 15. För genuttryck analyser, med hjälp av fjärrstyrt instrument gör en hög genomströmning analys möjlig. Dessutom ökar automatiskt robothantering mer enhetligt och noggrannheten i genuttryck resultaten. Trots snabb insamling av vävnadsproverna var avgörande för att undvika RNA nedbrytning under RNA-extraktion. Den RNA-bearbetning och transcriptomic strategier som beskrivs här kan också tillämpas på in vivo vävnadsprover.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Maurice Smith och Marja Talikka för deras granskning av manuskriptet.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |