The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Burada, biz tekrarlanan CS maruz etkisini değerlendirmek için insan organotipik bronşiyal ve burun doku modellerinin uygulanabilirliğini göstermiştir. Hayvanlar üzerinde yapılan testlere bir alternatif olarak, tatbik sistemlerinde bir dizi (örneğin., Vitrocell, Cultex ALICE, vs.), in vitro olarak, aerosol maruz toksikolojik değerlendirmeler için geliştirilmiştir. Bu maruziyet modülleri de bu çalışmada vb havadaki kirleticilerin, havadaki partikülleri, nanopartiküllerin, bir toksikolojik değerlendirme için kullanılabilir, biz büyük ölçekli deneyler arasında düşük değişkenlik sağlayan, aynı anda 48 farklı numunelerin kadar kalabileceği Vitrocell sistemi kullanılan tedaviler. Vitro her aerosol maruz kalma, doku kültürü kirlenme riski olan azaltma deneyler boyunca doku kültürleri dikkatli kullanım gerektirir önemli bir risk olmaya devam etmektedir.
Veya sırasında, mikro gerçek zamanlı olarak parçacık birikimi ölçümüXposure deney maruz sisteminden üretilen CS dozlar beklentilerine uygun olduğunu izlemenize olanak sağlar. Ayarı-up çevrimiçi ölçüm doğru pozlama önce, örneğin, critial çünkü mikro (cm 2) alanları arasındaki farkın, Ayrıca 0'a ölçek kurma ve ölçülen partikül birikimi doğruluğunu sağlamak için doku kültürü eki (0.33 cm2), kültürlere ekin alanına nihai hesaplama arındırılmış mikro üzerinde depolanma sadece% 33 kültür eklemek gerçek birikimi göstermektedir.
Sıkı birleşim bariyer işlevini belirlemek için ve epitel tabakasının bozulmasını değerlendirmek için TEER ölçümü burada bildirilen uygulanması nispeten kolay bir işlemdir. Bronş ve burun doku modelleri mukus üreten serpiştirilmiş kadeh hücreleri içeren Ancak, apikal yıkama TEER ÇÇA önce yapılması gerekiyorkullanan akan. apikal yıkama kritik çünkü mukus tabakasının varlığı ve CS maruz kalma etkisi ile interferring kalınlığı kutu önyargı TEER ölçümü değişkenliği,. Bu kavram HILGENDORF ve Caco-2 hücrelerinin geçirgenliği mukus üreten goblet hücre hattı HT29 23 ile birlikte culturing etkilenen edildiği meslektaşları tarafından bildirilen ne ile uyum içindedir. Sağ maruz önce apikal yıkama CS doku yanıtları engel olabilir çünkü mukus önce TEER ölçümü için yıkanır gerekmektedir. Bu nedenle, ölçüm üç gün maruz önce yapılır ve maruz kalmadan önce doğru değildir.
Biz aktivite sadece mütevazı CS artarak rağmen CYP1A1 / CYP1B1 etkinliği CS maruz aşağıdaki organotipik kültür modelleri ölçülen olabileceğini gösterdi. Bu zayıf sinyal CYP1A1 / 1B1 alt-tabaka daha uzun bir kuluçka ile amplifiye edilebilir (örn., Lusiferin-CEE), örneğin çalıştırma için24 saat (veriler gösterilmemiştir). Bu çalışmada CYP etkinliği ölçümünün sınırlamalardan biri enzim aktivitesi üzerindeki değişiklik etkilenmeyen sağlamak için CYP protein düzeyi ya da gelecekteki çalışmalar için dikkate alınması gereken hücre sayısı, normalizasyon yokluğudur Protein seviyesi veya hücre sayımı ya değiştirilmesi.
Biz CS pozlama nazal ve bronş doku modelleri hem de yenerek Silier engellediğini bildirdi. Benzer gözlemler, çeşitli memeli ve memeli olmayan model 12 yapılmıştır. Kirpiksi, ölçme dayak dokular benzer bir şekilde ele alınır ve muamele edilmesini sağlayabilecekleri için orta değişiklik uygulanması halinde, tüm numuneler için uygulanması gereken örneğin önemlidir. Sutto ve arkadaşları pH frekansı 24 yenerek memeli Silier etkilediğini bildirdi. Bu nedenle, farklı bileşimlerdir / karışımları pH ile muamele edilmiş hücreler arasındaki frekanslar dayak karşılaştırırkenAyar siliyer Dayak ölçüm değişkenliği en aza indirmek için düşünülmelidir. Siliyer dayak frekansı, sıcaklığı azaldıkça düşer Üstelik, ölçüm yapılan sıcaklık, da önemlidir. Bu çalışmada kullanılan sıcaklık, CO2 ve nem kontrolü ile donatılmış, bu değişiklikler, bir sahne üstü kuluçka, bağlı değişkenliği en aza indirmek için. Buna rağmen, biz CS maruz kaldıktan sonra bronşiyal dokularda frekansları yenerek siliyer siliyer dayak maruz kaldıktan sonra son derece rahatsız hakkı olduğunu düşündüren, son derece değişken (yani., Bir ekleme artış ve diğer insert azalma) olduğunu gözlemledik. Bunun aksine, nazal doku tepkisi daha hassas ve tutarlı olduğuna işaret CS maruz kaldıktan sonra burun dokularında ölçülebilir siliyer dayak frekanslarının olmadığını gözlemledik. Bu burun dokusu gibi detoks için daha düşük bir kapasiteye sahip olduğunu gösteren bir önceki yayın ile uyum içinde olanbronş 25 ile karşılaştırıldığında.
Son olarak, biz dumanına maruz bırakılan organotipik bronşiyal ve nazal doku modelleri profil gen ifadesi ksenobiyotik metabolizması üzerine CS etkisi göstermek göstermiştir. Bir önceki yayın 15 daha ayrıntılı olarak ele alındığı gibi İlginç bir şekilde, CS maruz nitro modellerinde gözlenen Organotipik bronş ksenobiyotik metabolizma değişiklik ve burun sigara içenlerde, in vivo durumu benzeyebilir. Gen ekspresyon analizi için, robot cihaz kullanılarak yüksek verimli bir analizi mümkün kılar. Ayrıca, otomatik robotlu taşıma daha gen ifadesi sonuçlarının tutarlılığını ve doğruluğunu artırır. Bununla birlikte, doku örneklerinin hızlı toplama RNA ekstraksiyonu sırasında RNA bozulmasını önlemek için önemlidir. RNA işleme ve burada tarif edilen transkriptomik yaklaşımlar da, in vivo doku örnekleri uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar yazının kendi gözden Maurice Smith ve Marja Talikka teşekkür etmek istiyorum.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |