Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Abstract

Vaste tumorweefsels zijn sterk betrokken bij het reguleren kankercelmigratie en invasie. Invasieve migratie door middel van cross-linked weefsels wordt vergemakkelijkt door actine-rijke uitsteeksels genaamd invadopodia dat proteolytisch degraderen de extracellulaire matrix (ECM). Invadopodia activiteit is aangetoond afhankelijk ECM stijfheid en kankercellijnen contractiele krachten suggereert dat stijfheid signalen die subcellulaire structuren kunnen reguleren door actomyosine contractiliteit te zijn. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Sommige verschillen tussen de twee tests bestaan, het protocol hier gepresenteerde een werkwijze voor het maken PAAs thbij kan in beide testen en gemakkelijk aanpasbaar aan specifieke biologische en technische behoeften van de gebruiker.

Introduction

De stijfheid van het tumor geassocieerde ECM is geïdentificeerd als een belangrijke factor bij het ​​stimuleren maligne gedrag verhogen actomyosine contractiliteit 1-3. Hoewel dit effect voornamelijk aangetoond met borstkankercellen werd matrix stijfheid gebleken invasieve eigenschappen van cellen afkomstig van verschillende kankers 4-8 suggereert dat tumor stijfheid kan een rol spelen bij andere kankersoorten veranderen. Om verknoopte weefsels tijdens invasieve migratie dringen, kankercellen gebruiken actine-rijke lijm uitsteeksels bekend als invadopodia dat proteinases lokaal te maken focaal degraderen de ECM 9. Invadopodia worden beschouwd als een kenmerk van invasieve cellen en zijn betrokken bij tumorcel invasie en metastase 10,11. Vorige werk heeft aangetoond dat matrix stijfheid invadopodia nummers kunnen reguleren en bijbehorende ECM degradatie 4,12 door myosine II activiteit en mechanosensitieve eiwitten 12. Gezien decorrelatie tussen dichtheid en kanker tumor agressiviteit 13,14 suggereren deze resultaten een mechanisme waardoor kankercellen reageren stijve tumorweefsels invasie en metastase rijden door actomyosine contractiliteit.

In vitro ECM stijfheid en in vivo weefseldichtheid is aangetoond dat invasieve gedrag van kankercellen 1,15-17 reguleren. Terwijl actomyosine contractiliteit blijkt belangrijk te zijn in dit proces, bestaande studies conflict of metastatische capaciteit gecorreleerd verhoogde of verlaagde contractiele krachten 6,18-20. Bovendien is het nog onbekend of deze krachten rechtstreeks bemiddelen invadopodia activiteit 21. We ontdekten recent dat kankercel contractiele krachten waren afhankelijk van matrix stijfheid en waren voorspellend voor ECM afbraak door invadopodia 5. Deze resultaten suggereren dat cellulaire krachten een belangrijke rol in de progressie van kanker kunnen spelen door te bemiddelen invadopodia activiteit in reactie op de mechanische eigenschappen van de tumor micro-omgeving.

Om invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen 5 correleren, we aangepast een protocol voor het creëren van PTA's met verschillende rigiditeiten die eerder werd gebruikt om de stijfheid-afhankelijke invadopodia activiteit 4,12,22 onderzoeken. Door chemisch verknopen menselijk plasma fibronectine gehele PAAs, kunnen deze gemodificeerde hydrogelen worden gebruikt als basis voor zowel invadopodia en trekkracht testen om te waarborgen dat cellen ervoer dezelfde starre beide experimenten 5. In de invadopodia assays, de fibronectine zorgt voor een natuurlijke bindende domein voor gelatine om de overlay ECM koppelen aan de PTA's te matrixafbraak detecteren. In de trekkracht assays, de fibronectine verschaft een ligand voor directe cellulaire adhesie microsferen verplaatsingen gebruikt om cellulaire aandrijfkrachten berekenen detecteren. Deze methode resulteert in wat wij zacht, hard hebben genoemd,en stijf PTA's die zijn gebonden aan glazen bodem gerechten en hebben elasticiteitsmoduli, E, van 1.023, 7.307 en 22.692 Pa 5, die het bereik van de mechanische eigenschappen gemeld voor de normale en kankerweefsel 23 overspannen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de dekglaasjes voor PAAs

  1. Schone 12 mm dekglaasjes met pluisarme doekjes.
  2. Vlam de 12 mm dekglaasjes en de 14 mm dekglaasje in de microwell van elk 35 mm glazen bodem schaal door ze door vlam van een bunsenbrander met een pincet.
  3. Behandel de microputjes met 200 ui 0,1 N NaOH gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min.
  5. Behandel de microputjes met 50-100 pl 3-aminopropyltrimethoxysilaan gedurende 10 min bij kamertemperatuur in de zuurkast. Dit chemisch reageert met kunststof; Gebruik daarom glaspipetten en niet de microputjes niet helemaal vol contact met het gerecht plastic vermijden.
  6. Was de microwells met ultrapuur water voor ongeveer 10 minuten totdat de 3-aminopropyltrimethoxysilaan duidelijk.
  7. Spoel de microwells met ultrapuur water twee keer met behulp van een knijpfles.
  8. Was de microwells met 2 ml ultrapuur water eent kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min.
  9. Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min.
  10. Behandel de microputjes met 2 ml 0,5% glutaaraldehyde oplossing bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 30 min.
  11. Was de microputjes met 2 ml ultrazuiver water bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 30 min.
  12. Droge microputjes een scherpe hoek (60 ° of meer) gedurende 30 min.
    Opmerking: Schotels worden opgeslagen gedurende 2 maanden in een exsiccator.

2. Voorbereiding van de PTA's voor Invadopodia Testen

  1. Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 574 gl ultrazuiver water (tabel 1).
  2. Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 & #181, l 2% BIS en 409 gl ultrazuiver water (tabel 1).
  3. Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 169 pl ultrazuiver water (tabel 1).
  4. Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine in ultrazuiver water de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Voor alle oplossingen, voeg 1 ui 10 mg / ml acrylzuur N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED ; Tabel 1). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pl) 		2%
(Pl) 		Ultrapuur
Water
(Pl) 		1 mg / ml
FN
(Pl) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pl) 		100 mg / ml
APS
(Pl)
TEMED
(Pl) 		Elastisch
Modulus
(Pa)
Zacht 200 25 574 200 1 5 2 1023
Hard 200 175 409 215 1 5 2 7307
Stijf 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabel 1: Ingrediënt volumes en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de invadopodia assays. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat.

  1. Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje.
    Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik.
  2. Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet.
  3. Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van de overgebleven oplossing.
  4. Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet.
    Opmerking: 10x PBS wordt in het laboratorium en samengesteld uit 0,011 M KH 2PO 4, 1,54 M NaCl en 0,056 M Na 2 HPO 4.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.

3. Peerherstel van PTA's voor meer trekkracht Testen

  1. Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 566 gl ultrazuiver water (tabel 2).
  2. Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 gl 2% BIS en 401 gl ultrazuiver water (tabel 2).
  3. Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 161 pl ultrazuiver water (tabel 2).
  4. Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine aan de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Ultrasone trillingen 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes (excitatie / emissie van 580/605 nm) gedurende 30 sec. Voor elke oplossing, voeg 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes,1 ui 10 mg / ml acrylzuur NHS ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui TEMED (tabel 2). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pl) 		2%
BIS
(Pl) 		Ultrapuur
Water
(Pl) 		1 mg / ml
FN
(Pl)
Micro-sferen
(Pl) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pl) 		100 mg / ml
APS
(Pl)
TEMED
(Pl) 		Elastisch
Modulus
(Pa)
Zacht 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Hard 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Stijf 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabel 2:. Volumes Ingrediënt en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de trekkracht assays AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat.

  1. Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje.
    Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik.
  2. Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van the 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet.
  3. Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van overgebleven oplossing.
  4. Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.

4. Voorbereiding van ECM voor Invadopodia Testen

  1. Verwarm de gelatine-oplossing (1% gelatine en 1% sucrose) tot 37 ° C.
  2. Behandel de PTA met 150 pi van de gelatine-oplossing gedurende 1 minuut vervolgens zorgvuldig aspireren van de bodem van de microputjes bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten in een hoek van 45 °.
  3. Droog de resterende dunne laag van gelatine aan de PTA in de microputjes op een steile hoek (60 ° of meer) te optimaliseren drogen gedurende 60 min.
  4. Behandel de microputjes met 2 ml van een gekoelde 0,5% glutaaraldehyde oplossing ice 15 min gevolgd door kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  6. Behandel de microputjes met 2 ml van een natriumboorhydride-oplossing gedurende 1 minuut. Tik voorzichtig gerechten op de bank te bellen die op het oppervlak van de gelatine vormen te verwijderen.
  7. Zuig en was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  8. Verdun een FITC-gemerkte menselijke plasma fibronectine oplossing van 50 ug / ml met 1x PBS en centrifugeer bij 175.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min. Ofwel koopt commercieel beschikbaar gelabeld fibronectine of het etiket het als volgt:
    1. Los 5 mg fibronectine in 10 ml boraatbuffer (170 mM natriummetaboraat-tetrahydraat en 40 mM NaCl) en plaats dialyse tubing.
    2. Label de fibronectine door het plaatsen van de buis in 200 ml boraatbuffer met 6 mg opgeloste FITC bij kamertemperatuur op een magnetische roerderingesteld op de laagste stand gedurende 1,5 uur in het donker.
    3. Dialyseren met 500 ml van een 1x PBS op een ingesteld op de laagste stand voor 3 dagen in een donkere koude kamer (4 ° C) met twee volume magneetroerder verandert per dag.
    4. Bereken FITC-gemerkte fibronectine concentratie gebaseerd op de optische dichtheid van monsters verdund (1: 200) bij 280 nm en 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 maal de verdunningsfactor van 200 maal 2 (waar de glycerol concentratie de fibronectine in de volgende stap) resulterend in mg / ml units.
    5. Dialyseren overnachting in een 50% glycerol oplossing op een ingesteld op de laagste stand overnachting in een donkere koude kamer bij 4 ° C magneetroerder.)
  9. Behandel de microputjes met 150 pi van de FITC-gelabelde fibronectine-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 60 min in het donker.
  10. Zuig het FITC gemerkte fibronectine oplossing uit de bodem van de microputjes voorzichtig bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten45 ° en vul de glazen bodem gerechten met 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een donkere celkweek kap voor sterilisatie. Vul ook glazen bodem schotel deksels of maak schoon met pluizen weinig doekjes gedrenkt in 70% ethanol.
  11. Was glazen bodem gerechten door ze te vullen met 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer met 2 ml 1x PBS gedurende in totaal 15 min.

5. Voorbereiding en beeldvorming van Invadopodia Testen

  1. Voeg 25,000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM en RPMI 1640 met 5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor) voor de glazen bodem gerechten incubeer overnacht.
  2. Zuig en behandel de microputjes met 2 ml van een 3,7% paraformaldehyde oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten om de cellen te repareren.
  3. Na twee snelle wasbehandelingen met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 2 ml van een 0,1% Triton X-100 oplossing bij kamer- tempetuur in het donker gedurende 5 minuten om de cellen te permeabiliseren.
  4. Na een snelle wassing met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 3% bovine serum albumine blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 minuten om de cellen te blokkeren.
  5. Incubeer de microputjes met 150 pi van muizen anti-cortactin antilichaam (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min.
  6. Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  7. Incubeer de microputjes 150 ul geit anti-muis 633 antilichaam (1: 500) en 546 falloïdine (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min.
  8. Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  9. Voeg zes druppels montage medium aan elke microwell vullen en dek af met 22 x 22 dekglaasjes.
  10. Afbeelding cortactine en actine te invadopodia te identificeren met behulp van excitatie en emissie filters van 632/647 nm en556/570 nm, respectievelijk, met behulp van een hoge NA, 40x olie-immersie lens op een breed veld omgekeerde microscoop. Op dezelfde afbeelding fibronectine aan ECM degradatie te identificeren met behulp van een excitatie en emissie-filter van 492/518 nm.

6. Voorbereiding en beeldvorming van Traction Force Testen

  1. Voeg 15.000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium om de glazen bodem gerechten en incubeer overnacht.
  2. Zuig medium in de glazen bodem gerechten en vervangen door 2 ml L-15-medium met dezelfde aanvullingen (5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor), pre -warmed tot 37 ° C.
  3. Incubeer de glazen bodem gerechten in een klimaatkamer bij een omgekeerde microscoop vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C met een hoge vochtigheid gedurende 1 uur.
  4. Neem vier sets van beelden met een hoge NA, 40x lens op een breed veld omgekeerde microscoop met een geautomatiseerde podium om cellulaire posities te markeren:
    1. Afbeelding cellen aanp van de PTA's met behulp van fase contrast ("fase" image).
    2. Afbeelding fluorescerende microbolletjes met excitatie en emissie filters van 560/645 nm door zich net onder de cellen tot de eerste laag van microsferen aan de bovenkant van de PTA is scherpgesteld ("stress" beeld).
    3. Daarnaast richten op de bodem van de PTA (de microsferen markers) en maak een opname ("bottom" beeld). Opmerking: Het doel van dit beeld is de z-positie om de werkelijke PAA dikte krijgen op elke positie trekkracht berekeningen zoals beschreven in Representatieve resultaten opnemen.
    4. Na deze beelden zijn verworven op meerdere posities, meng in 220 ul van 10% Triton-X oplossing om cellen te verwijderen. Afbeelding microsferen bij de bovenkant van de PAAs op elke positie zoals eerder beschreven (het "nul").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de invadopodia assay worden invadopodia gewoonlijk geïdentificeerd door colocalization markers zoals actine en cortactin op puntvormige structuren in het cellichaam (figuur 1). Zowel actief afbrekende en niet-degraderende invadopodia kunnen worden geteld en gedifferentieerd of deze structuren colocalized met donkere gedeeltes zonder fluorescent signaal in de FITC-gelabelde fibronectine (figuur 1). Invadopodia worden handmatig geteld en ECM afbraak per cel wordt bepaald door het handmatig drempelvorming deze zwarte gebieden binnen lijnen van de cellen.

In de trekkracht test worden vier opnamen op elke cellulaire lokalisatie gekenmerkt door stap (afbeelding 2). Eerste "fase" en "onderstreept" opnamen gemaakt van de cellen van belang. Een "bottom" beeld van het PAA wordt ook genomen op elke positie om hydrogel dikte berekenen. Na verwijdering thij cellen, wordt een afbeelding "null" genomen op elk gemarkeerd stadium positie. Vervormingen in de PTA's worden berekend op basis van de verandering in de microbolletjes posities tussen de "benadrukt" en "null" beelden. Deze verplaatsingen en de mechanische eigenschappen van de PTA (E en Poisson veronderstelde 0,5) worden dan gebruikt om trekkrachten (figuur 2) te berekenen. Er zijn verschillende methoden bestaan ​​voor de berekening van trekkrachten 24 op basis van enkele formulering van de Boussinesq oplossing voor een oneindige elastische half ruimte 25. Hoewel de details van deze analyses vallen buiten het bestek van deze tekst hebben we een licentie LIBTRC software van Micha Dembo aan de Boston University, die een eerder beschreven methode voor de berekening van trekkrachten 26 gebruikt. Deze bijzondere rekenmethode compenseert eindige dikte in zijn berekeningen van de dikte van de PTA vereist op elke positie die berekend is gebaseerd op de difference in de z-positie van de "benadrukte" en "onderste" beelden. Veel onderzoeksgroepen hebben vergelijkbare computer pakketten beschikbaar of ervoor kiezen om hun eigen programma's te schrijven. Ook andere methoden bestaan ​​voor het berekenen van trekkrachten op basis van verschillende wiskundige benadering 24.

Figuur 1
Figuur 1: De invadopodia test kan worden gebruikt om invadopodia en bijbehorende ECM afbraak identificeren Voorbeeld breedveldbeeld fluorescentiebeelden van invadopodia in een SCC-61 (hoofd en nek geschubde cel carcinoom) cel op een harde PAA met 1% gelatine en FITC. gelabeld fibronectine. Invadopodia worden meestal geïdentificeerd door colocalization van twee markers zoals actine en cortactine (rood en blauw in de overlay-afbeelding, respectievelijk). Invadopodia kan worden gekwantificeerd als zowel actief vernederende (colocalized met zwarte gebieden ontberening FITC signaal zoals aangegeven door gele pijlen) en niet-afbrekende (aangegeven met witte pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: De trekkracht test kan worden gebruikt om cellulaire trekkrachten die door het actine cytoskelet bepalen door het volgen van de verplaatsing van ingebedde microbolletjes in de PTA Voorbeeld breedveldbeeld fase en fluorescentie afbeeldingen van een SCC-61 cellen op een harde PAA (. "fase"), en de microsferen direct onder de cel aan het bovenoppervlak van de PAA ("stress"). Een beeld van de bodem van de PAA kan ook worden later berekenen de lokale dikte ("bottom"). Nadat de cel wordt verwijderd, wordt een afbeelding opnieuw gemaakt van de microsfeers op het bovenoppervlak van de PAA ("null"). Microsphere posities tussen de "benadrukt" en "null" beelden kunnen worden gevolgd op een opbrengst "verplaatsing veld." Microsphere verplaatsingen en PAA mechanische eigenschappen kunnen vervolgens worden gebruikt om een berekening van "tractie vector veld." Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We presenteren een werkwijze voor het vervaardigen PTA die kunnen worden gebruikt als basis voor invadopodia en trekkracht assays invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren. Terwijl PTA zijn lang gebruikt om te kijken naar stijfheid effecten op cellen en bereken trekkrachten 18,24,27, dit protocol is de eerste parallelle assays op basis PTA dezelfde starheid ontwikkelen invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren reactie op matrix mechanische eigenschappen. Goed activeren van de dekglaasjes van de glazen bodem gerechten zorgt de PTA zal binden aan hen en niet loskomen. Terwijl wij en anderen hebben aangevoerd reagentia zoals sulfo-SANPAH en acrylzuur NHS ester gelatine aan het oppervlak van de PTA binden in het verleden 4,12,28, vonden we dat deze werkwijzen niet betrouwbaar uniform oppervlaktelagen van fibronectine produceerde . Daarom werd fibronectine embedded en verknoopt gedurende de PTA's met behulp van acrylzuur NHS-ester zoals uitgevoerddoor andere groepen 29,30. De toenemende concentraties van fibronectine werden vereist om dezelfde liganddichtheid geven op de oppervlakken van de zachte, harde en stijve PTA 5. Bovendien incorporatie van fibronectine (maar niet de microbolletjes) verminderde de mechanische eigenschappen van de zacht, hard en stijf PTA van 1071, 9299 en 28.283 Pa 4 tot 1023, 7307 en 22692 Pa 5, respectievelijk. Echter, deze verlaagde elastische moduli waarden nog omvatte het traject van normale en kankerachtige weefsels 23. Opslag moduli van de PTA kan gemakkelijk gemeten worden door reometrie en omgezet elastische moduli 1,4.

Terwijl het protocol is eenvoudig, neerlaten en verwijderen van de 12 mm dekglaasjes zijn de moeilijkste stappen en vereisen praktijk. De grootste uitdaging bij het neerlaten van een dekglaasje is ervoor te zorgen dat de PAA oplossing verspreidt zich gelijkmatig zonder luchtbellen of spatten. Het verwijderen van een dekglaasje vereisteen vaste hand om de 12 mm dekglaasje, de glazen bodem 14 mm dekglaasje of de PAA niet beschadigen. We hebben hydrofobe coatings op de 12 mm dekglaasje geprobeerd om te helpen bij het verwijderen, maar vond dat de PTA's worden achtergelaten met patronen in hun oppervlakken. Het gebruik van fijne tip en dun, paddle-stijl pincet voor het verlagen en het verwijderen van de 12 mm dekglaasjes, respectievelijk, is een aanrader. Daarnaast is de hoeveelheid licht gebruikt om beelden van de cellen moet worden geminimaliseerd omdat sommige celtypen gevoelig zijn geconcentreerd licht op de microscoop. Ook werd L-15 medium gebruikt voor de trekkracht assays sinds onze klimaatkamer op onze microscoop niet is uitgerust voor CO 2. Terwijl dezelfde supplementen werden gebruikt in de media voor de invadopodia en trekkracht testen in een poging voorwaarden dezelfde blijven, zou DMEM en RPMI 1640 worden gebruikt in plaats van L-15 als CO2 niveaus kunnen worden gecontroleerd.

Terwijl het volume van PAA oplossing gekozen theoretisch yfield gels met een dikte van 75 urn, hun dikte doorgaans variëren tussen 30-60 um. Echter, dit bereik is ver boven de waarde waarbij cellen de onderliggende stijfheid van de dekglaasjes van de glazen bodem gerechten 31 kan voelen. Bovendien is de dikte van de laag ECM gebruikt voor het detecteren afbraak (gelatine en FITC-gelabelde fibronectine gevuld op de PAAs) eerder als ongeveer 1 urn dik 12 gerapporteerd; Daarom, deze dunne laag niet de cellen te beschermen tegen de starheid van de PTA's. Echter, vast vuil, scheuren en andere onzuiverheden in ofwel de PTA en / of ECM layer beïnvloeden individuele cellulaire invasieve samentrekkingen. Deze problemen kunnen worden veroorzaakt door vuil 12 mm dekglaasjes dat puin introduceren in de hydrogels, uitdroging van de gels en / of gelatine en onvolledige aspiratie natriumboorhydride waarvan bellen die de ECM laag vervormd kan verlaten. Daarom moet erop worden gelet bij het selecteren van cells voor beeldvorming zodat ze niet overmatig worden beïnvloed door lokale onregelmatigheden in het oppervlak van de monsters.

Relatief hoge concentraties van fibronectine in zowel de PAAs (gemengd bij 200-230 ug / ml) en de ECM laag (overlay op de gelatine bij 50 ug / ml) gebruikt; De werkelijke concentraties op beide oppervlakken niet direct gemeten. Terwijl elk oppervlak lijkt met fibronectine verzadigd, is het onduidelijk of cellen ervaren exact dezelfde ligand dichtheden tussen de beide assays. Voor de trekkracht assays 200 nm microbolletjes bij een verdunning van 1: 125 hebben bewezen optimaal voor beeldvorming. Het is echter heel gebruikelijk om andere groepen met microsferen met verschillende diameters of verdunningen voorbeeld. In dit systeem, kleine microbolletjes weergegeven Brownse beweging binnen de PAAs, terwijl grotere microsferen veroorzaakt barsten en misvormingen. Deze observaties zijn waarschijnlijk door de fysische eigenschappen van de PAAs (dwz

Kortom, veel van deze experimentele factoren worden aangepast op basis van de eisen van de gebruiker zoals PTA met verschillende mechanische eigenschappen, kankercellen met verschillende invasieve en contractiele eigenschappen en microscopiesystemen met andere beeldvormende vermogens. De verhouding van acrylamide: BIS kan worden gevarieerd om PTA met gelijke of verschillende elastische moduli en verknopen 27 produceren. De gevoeligheid van de trekkracht testen kunnen om rekening te houden voor de verschillende cellulaire kracht niveaus worden bijgesteld door de stijfheid en / of microsferen dilution. Verschillende fluoroforen kunnen worden gekozen immunofluorescentie en fibronectine labeling op basis microscoop specificaties. Terwijl FITC doet bleekmiddel, het is heel helder maken van ECM afbraak gemakkelijk herkenbaar. Echter, fluorescentie beeldvorming van invadopodia en kleine microbolletjes vereist meestal een hoge NA doelstellingen voor optimale resolutie. Bovendien kunnen beide assays worden uitgevoerd op dekglaasjes in putjes. Echter, glazen bodem gerechten zijn veel gemakkelijker te bereiden en te gebruiken gedurende de experimentele procedure. In de toekomst deze testen te combineren in één zou directe visualisatie van zowel ECM afbraak en cellulaire kracht genereren. Toch zijn er verschillende technische problemen voordoen waaronder live cell imaging voor invadopodia en microbead verplaatsingen, verhoogde cellulaire blootstelling aan licht, bleken van de FITC fibronectine en of trekkrachten volledig getransduceerd door de fluorescent gelabelde en verknoopte ECM laag op de PAA oppervlakken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal K25CA143412 (Parekh). We willen graag erkennen dat extra ondersteuning werd verleend door het ministerie van KNO. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Acknowledgments

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Tags

Geneeskunde invadopodia trekkracht degradatie contractiliteit stijfheid polyacrylamide
Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerrell, R. J., Parekh, A.… More

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter