Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Abstract

Katı tümör dokuları güçlü kanser hücresi göç ve istila düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çapraz-bağlanmış dokular içinden invaziv göç proteolitik olarak hücre-dışı matrisi (ECM) indirgeme invadopodia adı aktin zengin uzantılar ile kolaylaştırılır. Invadopodia aktivitesi sertliği sinyalleri aktomizin kontraktilite yoluyla bu hücre içi yapıları düzenleyebildiğini göstermektedir ECM sertliği ve kanser hücresi kasılma kuvvetleri bağlı olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. Kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini farklı bükülmezliklerde poliakrilamid jeller (PAAS) göre invadopodia ve çekiş kuvveti testleri kullanılarak in vitro korele edilebilir. İki tahliller arasında bazı farklılıklar vardır, ancak burada sunulan protokol inci PAAS oluşturmak için bir yöntem temin etmektedirHer iki deneylerinde kullanılabilir ve kolayca kullanıcının belirli bir biyolojik ve teknik ihtiyaçlarına adapte edilebilir edilebilir.

Introduction

tümör ilişkili ECM sertliği aktomizin kasılma 1-3 artırarak malign davranış sürüş önemli bir faktör olarak tespit edilmiştir. Bu etki ilk olarak göğüs kanseri hücreleri ile gösterilmiştir, matris sertliği diğer kanser türü bir rol oynayabileceğini tümör sertliğini gösteren kanser 4-8 çeşitli türetilen hücre invaziv özelliklerini değiştirmek için bulunmuştur. Invaziv göç sırasında çapraz bağlı dokulara nüfuz etmek, kanser hücrelerinin fokal ECM 9 aşağılamak için proteinazı lokalize invadopodia olarak bilinen aktin-zengin yapışkan uzantıların kullanılması. Invadopodia invaziv hücrelerinin bir işareti olarak düşünülen ve tümör hücre istilası ve metastaz 10,11 implike edilmiştir. Önceki çalışma matris sertlik invadopodia numaralarını düzenleyen göstermiştir ve miyozin II faaliyet ve mechanosensitive proteinler 12 ile ECM bozulmasını 4,12 ilişkili olmuştur. VerilmişTümör yoğunluğu ve kanser saldırganlık 13,14 arasındaki korelasyon, bu sonuçlar kanser hücrelerinin aktomizin kontraktilitesinde yoluyla işgali ve metastaz sürücü sert tümör dokularına yanıt verebilir bir mekanizma öneririz.

Nitro ECM sertlik ve in vivo doku yoğunluğunun kanser hücrelerinin 1,15-17 invaziv davranışını düzenleyen gösterilmiştir. Aktomizin kontraktilite, bu süreçte önemli görünmektedir iken, metastatik kapasite artışı ile ilişkilendirilmiştir ya da kasılma kuvvetleri 6,18-20 azalma olup olmadığı gibi mevcut çalışmalar çatışma. Ayrıca, bu güçlerin doğrudan invadopodia aktivitesini 21 arabuluculuk olmadığını bilinmemektedir. Biz son zamanlarda kanser hücresi kasılma kuvvetleri matris sertlik bağımlı ve invadopodia 5 ile ECM bozulma belirleyici olduğunu buldu. Bu sonuçlar hücresel kuvvetler invadopodia ac aracılık kanser ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedirtümör mikro-mekanik özelliklerine yanıt olarak bilirlik.

Kanser hücrelerinin 5 invaziv ve kasılma özelliklerini ilişkilendirilmesi için, daha önceden sertliği bağımlı invadopodia aktivitesi 4,12,22 araştırmak için kullanılmıştır, farklı sertliklere sahip PAAS oluşturmak için bir protokol yapılması. Kimyasal PAAS boyunca insan plazma fibronektinin çapraz olarak, bu modifiye edilmiş hidrojeller hücreler iki deneyde 5 aynı katılıkları deneyimli sağlamak için invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri hem de baz olarak kullanılabilir. Invadopodia deneylerinde, fibronektin matris bozulmasını tespit PAAS için Kaplanmış ECM bağlantı jelatin bir doğal bağlanma alanı içerir. Çekiş kuvveti deneylerinde, fibronektin hücresel çekiş kuvvetleri hesaplamak için kullanılan mikroküreli değiştirmeleri tespit doğrudan hücresel yapışma için bir ligand sağlar. Biz sert, yumuşak adlandırdıkları Bu yöntem sonuçları,normal ve kanserli dokuların 23 rapor mekanik özelliklerinin aralığını kapsayan hangi Pa 5 1023, 7307, ve 22.692 arasında, cam alt yemekleri bağlı ve elastik modüle, E sahiptir sert PAAS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PAAS Cam lameller 1. Hazırlık

  1. Düşük tüy bırakmayan mendil ile temizleyin 12 mm lamelleri.
  2. Alev 12 mm lamelleri ve cımbız kullanarak Bunsen beki alevi geçirerek her 35 mm cam alt çanak kuyucuklarda 14 mm lamel.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 N NaOH, 200 ul mikro tedavi edin.
  4. Aspire ve hava 30 dakika mikro kurulayın.
  5. Çeker ocak içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3-aminopropiltrimetoksilan 50-100 ul mikro tedavi edin. Bu kimyasal plastik tepki gösterir; Bu nedenle, cam pipet kullanın ve çanak plastik ile temasını engellemek için tamamen mikro doldurmak değil.
  6. 3-aminopropiltrimetoksisilan berrak hale gelene kadar yaklaşık olarak 10 dakika için ultra-saf su ile mikro-yıkayın.
  7. Saf su iki kez sıkmak şişe kullanarak mikro durulayın.
  8. Saf su, a 2 ml mikro yıkayın10 dakika boyunca orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker t oda sıcaklığı.
  9. Aspire ve hava 30 dakika mikro kurulayın.
  10. 30 dakika için orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker oda sıcaklığında 0.5% glutaraldehit solüsyonu 2 ml mikro tedavi edin.
  11. 10 dakika boyunca orta hızda (yaklaşık 1 Hz) ayarlanmış bir rocker oda sıcaklığında, aşırı saf su, 2 ml ile mikro yıkayın. 30 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  12. 30 dakika boyunca bir dik açıda (60 ° ya da daha yüksek) bir kuru mikro-.
    Not: Tabaklar bir desikatör içinde 2 ay boyunca saklanabilir.

Invadopodia Tahliller için PAAS 2. hazırlanması

  1. Yumuşak PAA (% 8 akrilamid ve% 0.05 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 25 ul ve ultra saf su 574 ul (Tablo 1) bir araya getirir.
  2. Sabit PAA (% 8 akrilamid ve% 0.35 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 175 ve # 200 ul birleştirme181 l% 2 BİS ve ultra saf su 409 ul (Tablo 1).
  3. Katı PAA (% 12 akrilamid ve% 0.60 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 300 ul,% 2 BIS 300 ul ve ultra saf su 169 ul (Tablo 1) bir araya getirir.
  4. 15 dakika için çözümler degas. Sırasıyla, sert, yumuşak ve sert PAA çözümleri için, aşırı saf su içinde 1 mg / ml insan plazma fibronektinin 200, 215, ve 230 ul ekle. Tüm solüsyonlar için, 10 mg / ml akrilik asit, N-hidroksisüksinimid (NHS) ester 1 ul, 100 mg / ml amonyum persülfat 5 ul ve N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin (TEMED 2 ul Tablo 1). Nazik pipetleme ile karıştırın ve çözümleri kabarcıkları oluşturarak kaçının.

PAA
(1 mi) 		% 40
AA
(Ul) 		% 2
(Ul) 		Ultrapure
Su
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul) 		10 mg / ml
NHS ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Elastik
Modül
(Pa)
Yumuşak 200 25 574 200 1 5 2 1023
Sert 200 175 409 215 1 5 2 7307
Sert 300 300 169 230 1 5 2 22.692

Tablo 1: Bileşen VOLUmes ve invadopodia deneylerinde kullanılan, sert, yumuşak ve sert PAAS için elastik modüle sonuçlanır. AA = akrilamid, FN fibronektin, APS = amonyum persülfat =.

  1. Her kuyucuklarda merkezine üzerine PAA çözeltisi 8.48 ul pipetle.
    Not: Bu birim teorik kalınlığı 75 mikron bir PAA verir.
  2. Yavaşça cımbız kullanarak kuyucuklarda olarak damlacık için 12 mm lamel Alevli tarafını düşük.
  3. Sandviç PAA çözüm 15-30 dakika süreyle polimerize izin verin. Artık çözüm kontrol ederek polimerizasyonu doğrulayın.
  4. Her yemeğin 1x PBS 2 ml ekleyin ve cımbız ile 12 mm lamelleri kaldırın.
    Not: 10x PBS laboratuarda yapılan ve 0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M NaCI, ve 0.056 M Na-2 HPO 4 oluşmaktadır.
  5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x PBS, 2 ml ile mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.

3. PÇekiş Gücü Tahliller için PaaS onarımı

  1. Yumuşak PAA (% 8 akrilamid ve% 0.05 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 25 ul ve ultra saf su 566 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  2. Sabit PAA (% 8 akrilamid ve% 0.35 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 200 ul,% 2 BIS 175 ul ve ultra saf su 401 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  3. Katı PAA (% 12 akrilamid ve% 0.60 BIS) bir 1 ml çözelti için,% 40 akrilamid, 300 ul,% 2 BIS 300 ul ve ultra saf su 161 ul (Tablo 2) bir araya getirir.
  4. 15 dakika için çözümler degas. Sırasıyla, sert, yumuşak ve sert PAA çözümlerine 1 mg / ml insan plazma fibronektinin 200, 215, ve 230 ul ekle. Sonikasyon 30 saniye için 200 nm kırmızı flüoresan mikroküreler (580/605 nm uyarım / emisyon) 8 ul. Her çözüm için, 200 nm kırmızı floresan mikroküreler 8 ul ekleyin10 mg / ml akrilik asit, NHS esteri 1 ul, 100 mg / ml amonyum persülfat 5 ul ve TEMED (Tablo 2) 2 ul. Nazik pipetleme ile karıştırın ve çözümleri kabarcıkları oluşturarak kaçının.

PAA
(1 mi) 		% 40
AA
(Ul) 		% 2
BIS
(Ul) 		Ultrapure
Su
(Ul) 		1 mg / ml
FN
(Ul)
Mikro-küreler
(Ul) 		10 mg / ml
NHS ester
(Ul) 		100 mg / ml
APS
(Ul)
TEMED
(Ul) 		Elastik
Modül
(Pa)
Yumuşak 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Sert 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Sert 300 300 161 230 8 1 5 2 22.692

Tablo 2:. Madde hacimleri ve çekiş kuvveti deneylerinde kullanılan, sert, yumuşak ve sert PAAS için elastik modüle ortaya çıkan AA = akrilamid, FN fibronektin, APS = amonyum persülfat =.

  1. Her kuyucuklarda merkezine üzerine PAA çözeltisi 8.48 ul pipetle.
    Not: Bu birim teorik kalınlığı 75 mikron bir PAA verir.
  2. Yavaşça th Alevli tarafını düşürmekcımbız kullanarak kuyucuklarda olarak damlacık e 12 mm lamel.
  3. Sandviç PAA çözüm 15-30 dakika süreyle polimerize izin verin. Artık çözüm kontrol ederek polimerizasyonu doğrulayın.
  4. Her yemeğin 1x PBS 2 ml ekleyin ve cımbız ile 12 mm lamelleri kaldırın.
  5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x PBS, 2 ml ile mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.

Invadopodia Tahliller için ECM 4. hazırlanması

  1. 37 ° C'ye kadar jelatin solüsyonu (% 1 jelatin ve% 1 sukroz) ısıtın.
  2. 45 ° açıyla cam alt yemekleri tutarken mikro altından dikkatlice aspire sonra 1 dakika boyunca jelatin çözeltisi 150 ul PAAS davranın.
  3. 60 dakika boyunca kurutma optimize etmek için dik bir açı (60 ° veya daha yüksek), bir mikro-PAAS üzerindeki jelatin kalan ince bir tabaka kurutun.
  4. I soğutulmuş bir% 0.5 glutaraldehid çözeltisi 2 ml mikro tedavi30 dakika boyunca oda sıcaklığında, ardından 15 dakika boyunca ce.
  5. 5 dakika boyunca, bir 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  6. 1 dakika süre ile, bir sodyum borohidrit solüsyonu 2 ml mikro tedavi edin. Yavaşça jelatin yüzeyinde oluşturan kabarcıklarını çıkarmak için bankta yemekleri dokunun.
  7. Aspire 5 dakika için 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  8. 15 dakika boyunca 4 ° C'de 175,000 x g'de 50 ug / 1x PBS ilave edildi ve santrifüj bir FITC-işaretlenmiş insan fibronektin çözeltisi ile seyreltilir. Ya piyasada mevcut etiketli fibronektin satın almak veya aşağıdaki gibi etiket:
    1. Diyaliz tüpünden borat tampon maddesi (170 mM sodyum metaborat tetrahidrat ve 40 mM NaCI) ve yerine 10 ml fibronektin 5 mg eritin.
    2. Bir manyetik karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında çözülmüş FITC 6 mg borat tamponu, 200 ml borunun yerleştirilmesi ile fibronektin Etiketkaranlıkta 1.5 saat için en düşük ayarlanmış ve.
    3. İki hacim ile karanlık bir soğuk odada (4 ° C) 'de 3 gün boyunca düşük ayarlanmış ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde 1 x PBS, 500 ml diyaliz günde değiştirir.
    4. (1: 200) ile seyreltildi alikotları optik yoğunluğuna bağlı olarak hesaplayın FITC etiketli fibronektin konsantrasyonu 280 nm ve 493 nm olarak [OD 280 - (0.36 x OD 493)] / 1.4 kat 200 kat 2 seyreltme faktörü (hesaplarını mg / ml birimleri olarak elde edilen bir sonraki aşamada fibronektin konsantre gliserol) dir.
    5. Gece boyunca 4 ° C de karanlık bir soğuk odada düşük ayarlanmış ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde,% 50 gliserol çözeltisi, bir gece boyunca diyaliz).
  9. Karanlıkta 60 dakika boyunca oda sıcaklığında ve FITC ile işaretlenmiş fibronektin solüsyonundan 150 ul mikro tedavi edin.
  10. Cam alt yemekleri tutarken dikkatli mikro altından FITC etiketli fibronektin çözüm aspire45 ° 'lik açı ve daha sonra sterilizasyon için karanlık bir hücre kültürü kaputu 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanol çözeltisi ile cam alt yemekler doldurun. Ayrıca cam alt çanak kapaklarını doldurmak veya% 70 etanol batırılmış düşük tüy bırakmayan mendil ile silin.
  11. 5 dakika boyunca 1 x PBS ile doldurularak cam alt yemekler yıkayın. 15 dakikalık bir toplam 1x PBS ve 2 ml iki kez daha tekrarlayın.

Invadopodia Tahliller 5. hazırlanması ve Görüntüleme

  1. (1: DMEM ve% 5 düşük-protein serumu,% 10 fetal sığır serumu ve taze eklenen epidermal büyüme faktörü 20 ng / ml ile aynı miktarda RPMI 1640 1) cam alt yemek ve invadopodia ortamının 2 ml 25,000 kanser hücrelerini ekleme gece inkübe.
  2. Aspire hücreleri düzeltmek için 20 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında% 3.7 paraformaldehid, 2 ml ile mikro tedavi etmek ve.
  3. 1x PBS ve 2 ml iki pratik yıkamadan sonra, oda Tempe bir% 0.1 Triton X-100 çözeltisi, 2 ml ile mikro tedavi5 dakika süreyle karanlıkta rature hücreleri geçirgenliği.
  4. 1x PBS içinde 2 ml bir hızlı yıkamadan sonra,% 3 sığır serum albümini 60 dakika hücreleri engellemek için karanlıkta, oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi ile mikro-muamele.
  5. 60 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir çözüm engelleme: fare anti-cortactin antikoru (750 1), 150 ul mikro inkübe edin.
  6. 5 dakika boyunca 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  7. (: 1: 500) ve 546 falloidinle (1: 750) 60 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında çözelti bloke keçi 150 ul anti-fare antikoru 633 mikro inkübe edin.
  8. 5 dakika boyunca 1x PBS 2 ml mikro yıkayın. 15 dakikalık bir toplam iki kez daha tekrarlayın.
  9. Her kuyu doldurun ve 22 x 22 lamelleri ile karşılamak için montaj orta altı damla ekleyin.
  10. Resim cortactin aktin 632/647 nm'lik eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanılarak invadopodia tespit etmek ve556/570 nm, sırasıyla, bir geniş alan ters mikroskop ile, yüksek NA 40X yağa batırılmış objektif kullanarak. Benzer şekilde, görüntü fibronektin 492/518 nm'lik bir eksitasyon ve emisyon filtresi kullanılarak ECM bozulma tespit etmek.

6. Hazırlık ve Çekiş Gücü Tahliller Görüntüleme

  1. Cam alt yemekleri invadopodia ortamının 2 ml 15.000 kanser hücreleri ekleyin ve gece boyunca inkübe edilir.
  2. Cam alt tabaklarında Kültür ortamı basınçla aynı takviyeleri (% 5 düşük-protein serumu,% 10 fetal sığır serumu ve taze eklenen epidermal büyüme faktörü 20 ng / ml), Önceden L-15 ortamına 2 ml ile değiştirin 37 ° C -warmed.
  3. Bir ters mikroskop 1 saat boyunca yüksek nem ile 37 ° C'de önceden dengelendi ile bir çevre odasında cam alt yemekler inkübe edin.
  4. Hücresel pozisyonlarını işaretlemek için yüksek NA, otomatik evre bir geniş alan ters mikroskop 40X lens kullanarak görüntülerin dört setleri atın:
    1. Üzerine resim hücreleriFaz kontrast ("faz" resim) kullanarak PAAS p.
    2. PAAS üstündeki mikro kürelerinin birinci tabaka kadar hücreler biraz altında odaklanarak 560/645 nm'lik eksitasyon ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntü floresan mikrosferleri odağa geldiği (görüntü "stresli").
    3. Buna ek olarak, (belirteç olarak küreleri kullanılarak) PaaS altına odaklanmak ve ("alt" görüntü) bir görüntü almak. Not: Bu resim amacı Örnek Sonuçlar tarif edildiği gibi çekme gücü hesaplamaları için her pozisyondaki gerçek PAA kalınlığı elde etmek için z-pozisyonunu tespit etmektir.
    4. Bu görüntüler çoklu pozisyonlarda elde edilmiş sonra, yavaşça hücrelerin çıkarılması için% 10 Triton-X-çözeltisi 220 ul karıştırın. Daha önce tarif edildiği gibi ("sıfır" görüntü) her pozisyonda PAAS üstünde görüntü mikro-küreler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Invadopodia tahlilinde, invadopodia tipik olarak hücre gövdesi içinde birkaç noktalı yapı ile aktin ve cortactin gibi belirteçler (Şekil 1) bir sınırlama ile tanımlanır. Hem aktif bozundurucu ve bozmaz invadopodia sayılabilir ve bu yapıların FITC etiketli fibronektin (Şekil 1) 'deki flüoresan sinyal eksik siyah alanlar ile lokalize edilip ayırt edilir. Invadopodia el sayılır ve hücre başına ECM bozulma el hücre hatları olan bu siyah alanlar eşikleme belirlenir.

Çekiş kuvveti tahlilinde, dört resim sahne pozisyonuna (Şekil 2) ile işaretlenmiş her hücresel yerde yakalanır. Birincisi, "faz" ve görüntüleri ilgi hücreleri tüm alınır "vurguladı". PAA bir "alt" görüntü aynı zamanda hidrojel kalınlığının hesaplanması için her bir pozisyonda alınır. T ayrılmasından sonraO hücreleri, bir "boş" görüntü her işaretli sahne konumunda alınır. PaaS içinde deformasyonlar hesaplanan "vurguladı" ve "boş" görüntüleri arasında Microsphere pozisyonlarında değişiklik dayanmaktadır. Bu yer değiştirmeler ve PaaS (0.5 olarak kabul E ve Poisson oranı) mekanik özellikleri daha sonra çekiş güçleri (Şekil 2) hesaplamak için kullanılır. Birçok farklı yöntemler sonsuz elastik yarı alanı 25 Boussinesq çözümünün bazı formüle dayalı çekiş kuvvetleri 24 hesaplanması için var. Bu analizlerin detayları bu metnin kapsamı dışındadır iken, biz çekiş kuvvetleri 26 hesaplanması için daha önce açıklanan yöntemi kullanan Boston Üniversitesi'nde Micah Dembo gelen LIBTRC lisanslı yazılım oylandı. Bu özel hesaplama yöntemi di esas alınarak hesaplanır her pozisyonda PaaS kalınlığını gerektirir kendi hesaplamalarına sonlu kalınlıkları için telafi"vurguladı" ve "alt" görüntülerin z-pozisyonunda fference. Birçok araştırma grupları benzer bilgisayar paketleri mevcut olması veya kendi programlarını yazmak için seçin. Buna ek olarak, başka yöntemler de farklı matematiksel yaklaşımlar 24 göre çekme kuvvetlerinin hesaplanması için mevcuttur.

Şekil 1,
Şekil 1: invadopodia deney invadopodia ve ilgili ECM bozulma tespit etmek için kullanılabilir invadopodia Örnek geniş alan floresan görüntüleri bir SCC 61 (baş ve boyun yassı hücreli karsinom), hücre içinde,% 1 jelatin ve FITC- ile sert PAA ile. etiketli fibronektin. Invadopodia tipik olarak aktin ve cortactin iki markalama (katlamalı görüntüde kırmızı ve mavi, sırasıyla), bir sınırlama ile tanımlanır. Invadopodia olarak miktarı, her ikisi de aktif (siyah alanlar yoksundur ile birlikte lokalize aşağılayıcıFITC sarı oklarla gösterilen şekilde sinyal) ve beyaz oklarla gösterilen olmayan aşağılayıcı () ing. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. Çekiş kuvveti deneyi (sert PAA bir SCC 61 hücre PAAS Örnek geniş alan faz ve floresan görüntü gömülü mikro-yer değiştirme takip ederek, aktin hücre iskeleti tarafından oluşturulan hücre çekme kuvvetlerinin saptanması için kullanılabilir "faz"), ve PAA üst yüzeyinde hücrenin altında doğrudan mikroküreler () "vurguladı". PAA alt bir görüntü de daha sonra yerel kalınlığı ("alt") hesaplamak için alınabilir. Hücre kaldırıldıktan sonra, bir görüntü yeniden mikrosfer alınırPAA ("null") üst yüzeyinde s. Arasındaki mikroküre pozisyonları "vurguladı" ve "boş" görüntüleri elde etmek için izlenebilir "yer değiştirme alanı." Microsphere deplasmanlar ve PAA mekanik özellikleri daha sonra hesaplamak için kullanılabilir "çekiş vektör alanı." büyük halini görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu invaziv ve kontraktil hücresel davranış ilişkilendirmek için invadopodia ve çekiş kuvveti testleri için temel olarak kullanılabilir PAAS imal edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır. PAAS, hücrelerin üzerindeki sertlik etkilerine bakmak ve çekme kuvvetlerinin 18,24,27 hesaplamak için kullanılmış olsa da, bu protokol matrise karşılık invazif ve kontraktil hücresel davranışları ilişkili aynı bükülmezliklerde PAAS göre paralel analiz geliştirme ilk mekanik özellikleri. Düzgün cam alt yemekleri lamelleri aktive PAAS kendilerine bağlamak ve kapalı gelmeyecek sağlar. Bizim ve başkaları tarafından son 4,12,28 içinde PAAS yüzeyine jelatin bağlamak için örneğin sülfo-SANPAH ve akrilik asit, NHS ester gibi reaktif dayanıyordu birlikte, bu yöntemler, fibronektinin güvenilir muntazam yüzey tabakalarını üretmek olmadığı saptanmıştır . Gerçekleştirilen nedenle, fibronektin akrilik asit ester NHS kullanılarak gömülü ve PaaS boyunca çapraz bağlı edildidiğer gruplar 29,30 ile. Bununla birlikte, fibronektin artan konsantrasyonları, sert, yumuşak ve sert PAAS 5 yüzeylerinde aynı bağ yoğunluğu elde etmek amacıyla gerekli oldu. Buna ek olarak, fibronektin (fakat mikro-) eklenmesi, sırasıyla, PA 5 1023, 7307, ve 22692 ile 1071, 9299 ve 28283 Pa 4'ten, sert, yumuşak ve sert PAAS mekanik özellikleri azalır. Ancak, bu azaltılmış elastik modülü değerleri hala normal ve kanserli dokuların 23 aralığını kapsıyor. PAAS depolama modülleri kolayca reometri ile ölçülmektedir ve elastik modülünün 1,4 dönüştürülebilir.

Protokol düşürücü ve kaldırma, yalındır iken 12 mm lamelleri en zor adımlar ve pratik gerektirir. Bir lamel düşürücü büyük zorluk PAA çözüm herhangi kabarcıkları veya sıçramasına olmadan eşit olarak yayılır sağlamaktır. Bir lamel gerektirir Çıkarmaamacıyla sürekli el 12 mm lamel, cam alt 14 mm lamel, ya da PAA zarar değil. Bu ayrılmasına yardımcı olmak üzere 12 mm'lik bir örtücü cam üzerine hidrofobik kaplama çalıştı ama PAAS yüzeyleri desenlerle bırakılır bulmuşlardır. İnce ucu ve indirme ve 12 mm lamelleri kaldırmak için ince, kürek tarzı cımbız kullanımı, sırasıyla, şiddetle tavsiye edilir. Bazı hücre tipleri, mikroskop konsantre ışığa duyarlı Ek olarak, görüntü için kullanılan ışık miktarı hücrelerin en aza indirilmelidir. Bizim mikroskop çevre odası CO 2 için donanımlı olmadığı için Ayrıca, L-15 orta çekiş kuvveti deneyleri için kullanılmıştır. Aynı ek koşullar aynı tutmak için bir girişim olarak invadopodia ve çekiş kuvveti testleri için ortam içinde kullanılan birlikte CO2 seviyelerinin kontrol edilmesi durumunda, DMEM ve RPMI 1640 L-15 yerine kullanılabilir.

PAA çözeltinin hacmi, teorik olarak Y için seçildi ise75 um bir kalınlığa sahip ield jeller, kalınlıkları tipik olarak 30-60 um arasında değişmektedir. Ancak, bu aralık iyi hücreler cam alt yemekleri 31 lamelleri yatan katılık hissedebiliyorum hangi değerin üzerindedir. Buna ek olarak, ECM tabakasının kalınlığı, daha önce yaklaşık olarak 1 um kalınlığında, 12 bildirilmiştir bozulması (jelatin ve FITC-etiketli fibronektin PAAS için üzerine bindirilmiş) tespit etmek için kullanılır; Bu nedenle, bu ince tabaka PaaS ve katılıkları hücreleri kalkan değil. Bununla birlikte, katı enkaz, çatlak, ve PaaS ve / veya ECM tabakası ya diğer deformiteler tek tek hücresel invaziv ve kasılma özelliklerini etkileyebilir. Bu sorunlar, hidrojeller, ECM tabaka deforme kabarcıklar bırakabilir jel ve / veya jelatin aşırı kurutma ve sodyum borohidrid eksik aspirasyon çöpü tanıtmak kirli 12 mm kapak neden olabilir. Ce seçerken nedenle, dikkatli olmak gerekirgörüntüleme için rf onlar haksız yere numunelerin yüzeylerinde yerel düzensizlikler etkilenmez emin olmak için.

Kullanılmış ve (50 ug / ml jelatin ile kaplanmış) ECM tabakasının (200-230 ug / ml karışık) her iki PAAS fibronektinin nispeten yüksek konsantrasyonları; Bununla birlikte, her iki yüzeyi üzerindeki gerçek yüzey konsantrasyonları doğrudan ölçülmez edilmemiştir. Her yüzey fibronektin ile doymuş gibi görünüyor olsa da hücreler iki tahliller arasında aynı kesin ligand yoğunlukları deneyim ister, belli değildir. Çekiş gücü analizi için, 1 dilusyondaki 200 nm mikrosferler: 125 görüntüleme için en uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, farklı çaplarda veya dilüsyonlarının küreleri kullanılarak diğer grupları bulmak oldukça yaygındır. Daha büyük mikro-çatlaklar ve deformite yol açarken, bu sistemde, daha küçük mikro-küreler, PAAS içinde Brownian hareketi göstermiştir. Bu gözlemler nedeniyle PaaS fiziksel özelliklerinin büyük olasılıkla (yani

Genel olarak, bu deneysel faktörler gibi birçok diğer görüntüleme özelliklerine sahip farklı mekanik özelliklere sahip PAAS, invaziv ve kasılma özelliklerini değişen kanser hücrelerinde ve mikroskop sistemleri gibi, kullanıcının ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. akrilamid oranı: BIS benzer ya da farklı elastik modülünün ve 27 çapraz bağlama ile PAAS üretilmesi için değiştirilebilir. çekiş kuvveti deneyleri duyarlılığı sertliği ve / veya mikro olduğu zaman dilüe olabilme değiştirilerek farklı hücre gücü seviyeleri için hesaba ayarlanabiliriyonu temsil etmektedir. Farklı flüoroforlar da mikroskop özelliklerine dayalı immünfloresans ve fibronektin etiketleme için seçilebilir. FITC çamaşır suyu yok iken, oldukça parlak yapma ECM bozulması kolayca tanımlanabilir. Ancak, invadopodia ve küçük mikroküreler floresan görüntüleme genellikle optimum çözünürlük için yüksek NA hedeflerini gerektirir. Buna ek olarak, her iki çalışma yuvalı plakalar içinde cam lameller üzerine gerçekleştirilebilir. Ancak, cam alt yemekleri hazırlamak ve deneysel süreç boyunca kullanmak çok daha kolay. Gelecekte, birine bu deneyleri birleştirerek ECM bozulması ve hücresel kuvvet nesil hem doğrudan görselleştirme için izin verecek. Ancak, birkaç teknik zorluklar invadopodia ve microbead değiştirmeler için canlı hücre görüntüleme, ışığa artmış hücresel maruz FITC fibronektin ağartma da dahil olmak üzere ortaya çıkan ve olur çekiş güçleri tamamen PAA yüzeylere floresan bağlı çapraz etiketli ve ECM tabakası içinden transdük olup olmadığını .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu eser Ödülü Numarası K25CA143412 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü (Parekh) tarafından desteklenmiştir. Biz ek destek Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı tarafından sağlanan olduğunu kabul etmek istiyorum. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Acknowledgments

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Tags

Tıp Sayı 95 invadopodia çekiş kuvveti bozulma kontraktilite sertlik poliakrilamid
Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerrell, R. J., Parekh, A.… More

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter