Summary
Mekanisk styvhet i tumören mikromiljön spelar en avgörande roll i att driva malignt beteende genom att öka invadopodia aktivitet och aktomyosin kontraktilitet. Använda polyakrylamidgeler (PaaS), kan invadopodia och dragkraft analyser utnyttjas för att studera de invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller som svar på matris styvhet.
Abstract
Styva tumörvävnad har varit starkt inblandade i regleringen cancercellmigration och invasion. Invasiv migration genom tvärbundna vävnader underlättas av aktin-rika utsprång kallade invadopodia som proteolytiskt nedbryter den extracellulära matrisen (ECM). Invadopodia aktivitet har visat sig vara beroende av ECM styvhet och cancercell kontraktila krafter som tyder på att styvhet signaler kan reglera dessa subcellulära strukturer genom aktomyosin kontraktilitet. Invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller kan korreleras in vitro med användning invadopodia och dragkraft analyser baserade på polyakrylamidgeler (PaaS) av olika styvheter. Invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller kan korreleras in vitro med användning invadopodia och dragkraft analyser baserade på polyakrylamidgeler (PaaS) av olika styvheter. Medan vissa variationer mellan de två analyserna existerar, det protokoll som presenteras här ger en metod för att skapa PaaS thpå kan användas i båda analyserna och är lätt att anpassa till användarens specifika biologiska och tekniska behov.
Introduction
Styv av tumörassocierade ECM har identifierats som en betydande faktor i att driva malignt beteende genom att öka aktomyosin kontraktilitet 1-3. Även om denna effekt har främst visats med bröstcancerceller, har matris styvhet befunnits förändra invasiva egenskaper hos celler som härrör från en rad olika cancerformer 4-8 tyder på att tumör styvhet kan spela en roll i andra typer av cancer. Att tränga tvärbundna vävnader under invasiva migration, cancerceller använder aktin rika självhäftande utsprång kallas invadopodia som lokalisera proteinaser att fokalt försämra ECM 9. Invadopodia anses kännetecknande för invasiva celler och har implicerats i tumörcellinvasion och metastas 10,11. Tidigare arbete har visat att matris styvhet kan reglera invadopodia nummer och tillhörande ECM nedbrytning 4,12 genom myosin II aktivitet och mechanosensitive proteiner 12. Med tanke på denkorrelation mellan tumörtäthet och cancer aggressivitet 13,14, dessa resultat antyder en mekanism genom vilken cancerceller kan svara på styva tumörvävnad att driva invasion och metastas genom aktomyosin kontraktilitet.
In vitro ECM styvhet och in vivo vävnadsdensitet har visats reglera invasiva beteendet hos cancerceller 1,15-17. Medan aktomyosin kontraktilitet verkar vara viktiga i denna process, nuvarande studier konflikt om huruvida metastaser kapaciteten är korrelerad till ökad eller minskad kontraktila krafter 6,18-20. Dessutom är det fortfarande okänt om dessa krafter som direkt förmedlar invadopodia aktivitet 21. Vi fann nyligen att cancercellen kontraktila styrkor var beroende av matris styvhet och var prediktiva för ECM nedbrytning genom invadopodia 5. Dessa resultat tyder på att cellulära krafter kan spela en viktig roll vid cancerutveckling genom att mediera invadopodia activitet som svar på de mekaniska egenskaperna hos tumörens mikromiljö.
För att korrelera invasiva och kontraktila egenskaperna hos cancerceller 5, modifierade vi ett protokoll för att skapa PaaS med olika styvheter som tidigare användes för att undersöka styvhet beroende invadopodia aktivitet 4,12,22. Genom kemisk tvärbindning humant plasmafibronektin hela PaaS, kan dessa modifierade hydrogeler användas som grund för både invadopodia och dragkraft-analyser för att säkerställa att celler upplevt samma stelheten i båda experimenten 5. I invadopodia analyser tillhandahåller fibronektin en naturlig bindningsdomän för gelatin för att länka den överlagrade ECM till PaaS att detektera matrisnedbrytning. I dragkraften analyserna ger fibronektin en ligand för direkt cellulär adhesion att upptäcka mikrosfär förskjutningar används för att beräkna cellulära dragkrafter. Metoden ger det vi har kallat mjukt, hårt,och stela PaaS som är bundna till glas botten rätter och har elastiska moduler, E, av 1,023, 7307, och 22.692 Pa 5 som spänner över intervallet av mekaniska egenskaper som rapporterats för normala och cancervävnader 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av täckglas för PaaS
- Clean 12 mm täck med låga ludd våtservetter.
- Flame de 12 mm täck och 14 mm täck i mikro av varje 35 mm glas nedre skålen genom att passera dem genom en bunsenbrännare flamma med pincett.
- Behandla mikrobrunnarna med 200 ul av 0,1 N NaOH under 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera och lufttorka mikrobrunnarna under 30 min.
- Behandla mikrobrunnarna med 50-100 pl av 3-aminopropyltrimetoxisilan till 10 min vid rumstemperatur i dragskåp. Denna kemikalie reagerar med plast; Därför använder glaspipetter och inte fylla mikrobrunnarna helt för att undvika kontakt med skålen plasten.
- Tvätta mikrobrunnarna med ultrarent vatten i ca 10 min tills 3-aminopropyltrimetoxisilan blir klart.
- Skölj mikrobrunnarna med ultrarent vatten två gånger med hjälp av en sprutflaska.
- Tvätta mikrobrunnarna med 2 ml ultrarent vatten pert rumstemperatur på en vippa inställd på en medelhastighet (~ 1 Hz) under 10 min.
- Aspirera och lufttorka mikrobrunnarna under 30 min.
- Behandla mikrobrunnarna med 2 ml 0,5% glutaraldehydlösning vid rumstemperatur på en rocker inställd på en medelhastighet (~ 1 Hz) under 30 min.
- Tvätta mikrobrunnarna med 2 ml ultrarent vatten vid rumstemperatur på en rocker inställd vid medelhastighet (~ 1 Hz) under 10 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 30 min.
- Torra mikrobrunnarna vid en brant vinkel (60º eller senare) för 30 min.
Obs: Rätter kan lagras i 2 månader i en exsickator.
2. Beredning av PaaS för Invadopodia analyser
- För en 1 ml lösning av den mjuka PAA (8% akrylamid och 0,05% BIS), kombinera 200 pl av 40% akrylamid, 25 pl av 2% BIS, och 574 | il av ultrarent vatten (Tabell 1).
- För en 1 ml lösning av det hårda PAA (8% akrylamid och 0,35% BIS), kombinera 200 pl 40% akrylamid, 175 & #181; il av 2% BIS, och 409 | il av ultrarent vatten (Tabell 1).
- För en 1 ml lösning av den styva PAA (12% akrylamid och 0,60% BIS), kombinera 300 pl av 40% akrylamid, 300 | il 2% BIS, och 169 | il av ultrarent vatten (Tabell 1).
- Avgasa lösningar för 15 min. Lägg 200, 215, och 230 pl 1 mg / ml humant plasma fibronektin i ultrarent vatten till de mjuka, hårda och styva PAA lösningar, respektive. För alla lösningar, tillsätt 1 pl av 10 mg / ml akrylsyra-N-hydroxisuccinimid (NHS-ester), 5 | il av en 100 mg / ml ammoniumpersulfat, och 2 | il av N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED ; Tabell 1). Blanda med försiktig pipettering och undvika att skapa bubblor i lösningar.
PAA (1 ml) | 40% AA (Il) | 2% (Il) | Ultrarent Vatten (Il) | 1 mg / ml FN (Il) | 10 mg / ml NHS-ester (Il) | 100 mg / ml APS (Il) | TEMED (Il) | Elastisk Modul (Pa) |
| Mjuk | 200 | 25 | 574 | 200 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Hård | 200 | 175 | 409 | 215 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Styv | 300 | 300 | 169 | 230 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabell 1: Ingredienser VOLUMES och resulterande elasticitetsmoduler för mjuka, hårda, och styva PaaS används i invadopodia analyser. AA = akrylamid, FN = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.
- Pipettera 8,48 ul av PAA-lösningen på till centrum av varje brunn.
Obs: Denna volym ger teoretiskt en PAA av 75 mikrometer i tjocklek. - Sänk försiktigt ned flammade sidan av 12 mm täck till droppen i mikro med pincett.
- Låt inklämt PAA-lösning polymerisera under 15-30 min. Verifiera polymerisation genom att kontrollera överblivna lösningen.
- Tillsätt 2 ml av 1 x PBS till varje skål och ta bort de 12 mm täckglas med pincett.
Obs: 10x PBS görs i laboratoriet och består av 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M NaCl och 0,056 M Na 2 HPO 4. - Tvätta mikrobrunnarna med 2 ml 1 x PBS vid rumstemperatur under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
3. Preparation av PaaS för Dragkraft analyser
- För en 1 ml lösning av den mjuka PAA (8% akrylamid och 0,05% BIS), kombinera 200 pl av 40% akrylamid, 25 pl av 2% BIS, och 566 | il av ultrarent vatten (tabell 2).
- För en 1 ml lösning av den hårda PAA (8% akrylamid och 0,35% BIS), kombinera 200 pl av 40% akrylamid, 175 | il 2% BIS, och 401 | il av ultrarent vatten (tabell 2).
- För en 1 ml lösning av den styva PAA (12% akrylamid och 0,60% BIS), kombinera 300 pl av 40% akrylamid, 300 | il 2% BIS, och 161 | il av ultrarent vatten (tabell 2).
- Avgasa lösningar för 15 min. Lägg 200, 215, och 230 pl 1 mg / ml human plasma fibronektin till de mjuka, hårda och styva PAA lösningar, respektive. Sonikera 8 pl 200 nm rött fluorescerande mikrosfärer (excitation / emissions av 580/605 nm) för 30 sek. För varje lösning, tillsätt 8 pl 200 nm rött fluorescerande mikrosfärer,1 pl av 10 mg / ml akrylsyra NHS-ester, 5 | il av en 100 mg / ml ammoniumpersulfat, och 2 | il TEMED (tabell 2). Blanda med försiktig pipettering och undvika att skapa bubblor i lösningar.
PAA (1 ml) | 40% AA (Il) | 2% BIS (Il) | Ultrarent Vatten (Il) | 1 mg / ml FN (Il) | Mikro sfärer (Il) | 10 mg / ml NHS-ester (Il) | 100 mg / ml APS (Il) | TEMED (Il) | Elastisk Modul (Pa) |
| Mjuk | 200 | 25 | 566 | 200 | 8 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Hård | 200 | 175 | 401 | 215 | 8 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Styv | 300 | 300 | 161 | 230 | 8 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabell 2:. Ingrediens volymer och resulteelasticitetsmoduler för mjuka, hårda och styva PaaS används i dragkraften analyser AA = akrylamid, fn = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.
- Pipettera 8,48 ul av PAA-lösningen på till centrum av varje brunn.
Obs: Denna volym ger teoretiskt en PAA av 75 mikrometer i tjocklek. - Sänk försiktigt ned flammade sidan av the 12 mm täckglas på droppen i mikrobrunnen med pincett.
- Låt inklämt PAA-lösning polymerisera under 15-30 min. Verifiera polymerisation genom att kontrollera överblivna lösningen.
- Tillsätt 2 ml av 1 x PBS till varje skål och ta bort de 12 mm täckglas med pincett.
- Tvätta mikrobrunnarna med 2 ml 1 x PBS vid rumstemperatur under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
4. Beredning av ECM för Invadopodia analyser
- Värm gelatinlösning (1% gelatin och 1% sackaros) till 37 ° C.
- Behandla PaaS med 150 ul av gelatinlösningen under 1 min sedan försiktigt aspirera från botten av mikrobrunnarna vid håller glas botten skålar vid en 45 ° vinkel.
- Torka det återstående tunna skiktet av gelatin på PAAS i mikrobrunnarna i en brant vinkel (60 ° eller större) för att optimera torkning under 60 min.
- Behandla mikrobrunnarna med 2 ml av en kyld 0,5% glutaraldehyd lösning på ice under 15 min följt av rumstemperatur under 30 min.
- Tvätta mikrobrunnarna med 2 ml av en 1 x PBS under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
- Behandla mikrobrunnarna med 2 ml av en natriumborhydrid-lösning under 1 min. Knacka försiktigt rätter på bänken för att ta bort bubblor som bildas på ytan av gelatinet.
- Aspirera och tvätta mikrobrunnarna med 2 ml av en 1 x PBS under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
- Späd en FITC-märkt human plasmafibronektin lösning på 50 | ig / ml med en 1 x PBS och centrifugera vid 175.000 xg vid 4 ° C under 15 min. Antingen köper kommersiellt tillgängliga märkt fibronektin eller märka det på följande sätt:
- Lös 5 mg fibronektin i 10 ml boratbuffert (170 mM natriummetaborat-tetrahydrat och 40 mM NaCl) och placera i dialysrör.
- Märk fibronektin genom att placera slangen i 200 ml boratbuffert innehållande 6 mg upplöst FITC vid rumstemperatur på en magnetomrörarefastställas till den lägsta inställningen för 1,5 timmar i mörker.
- Dialyze med 500 ml av en 1x PBS på en magnetomrörare inställd på den lägsta inställningen i 3 dagar i ett mörkt kallt rum (4 ° C) med två volymer förändrar en dag.
- Beräkna FITC-märkt fibronektin koncentration baserad på den optiska densiteten av utspädda alikvoter (1: 200) vid 280 nm och 493 nm såsom [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 gånger den utspädningsfaktor på 200 gånger 2 (som svarar för glycerolen koncentrering av fibronektin i nästa steg) som resulterar i mg / ml enheter.
- Dialysera över natten i en 50% -ig glycerollösning på en magnetomrörare inställd på den lägsta inställningen över natten i ett mörkt kallt rum vid 4 ° C.)
- Behandla mikrobrunnarna med 150 pl av FITC-märkt fibronektin lösning vid rumstemperatur under 60 minuter i mörker.
- Aspirera FITC-märkt fibronektin lösning från botten av mikrobrunnarna försiktigt när du håller glas botten rätter påen 45 ° vinkel och sedan fylla de glas botten rätter med 70% etanollösning vid rumstemperatur under 10 min i en mörk cellkultur huva för sterilisering. Fyll också glas botten maträtt lock eller torka rent med låga ludd våtservetter indränkt i 70% etanol.
- Tvätta glas botten rätter genom att fylla dem med 1x PBS i 5 min. Upprepa två gånger med 2 ml 1 x PBS för totalt 15 min.
5. Upprättande och avbildning av Invadopodia Analyser
- Lägg 25000 cancerceller i 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM och RPMI 1640 med 5% låg-proteinserum, 10% fetalt bovint serum, och 20 ng / ml av nyligen tillsatt epidermal tillväxtfaktor) till glasbottenskålar och inkubera över natten.
- Aspirera och behandla mikrobrunnarna med 2 ml av en 3,7% paraformaldehydlösning vid rumstemperatur i mörker under 20 min för att fixera cellerna.
- Efter två snabba tvättar med 2 ml 1 x PBS, behandla mikrobrunnarna med 2 ml av en 0,1% Triton X-100-lösning på rummet tempeperatur i mörker under 5 min för att permeabilisera cellerna.
- Efter en snabb tvätt med 2 ml 1 x PBS, behandla mikrobrunnarna med 3% bovint serumalbumin blockerande lösningen vid rumstemperatur i mörker under 60 min för att blockera cellerna.
- Inkubera mikrobrunnarna med 150 | il mus-anti-cortactin antikropp (1: 750) i blockeringslösning vid rumstemperatur i mörker under 60 minuter.
- Tvätta brunnarna med 2 ml 1 x PBS under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
- Inkubera mikrobrunnarna med 150 pl av get-anti-mus-633-antikropp (1: 500) och 546 falloidin (1: 750) i blockeringslösning vid rumstemperatur i mörker under 60 minuter.
- Tvätta brunnarna med 2 ml 1 x PBS under 5 min. Upprepa ytterligare två gånger för totalt 15 min.
- Lägg sex droppar monteringsmedium för att fylla varje brunn och täck med 22 x 22 täck.
- Bild cortactin och aktin att identifiera invadopodia använder excitation och emissionsfilter av 632/647 nm och556/570 nm, respektive, med hjälp av en hög NA 40X oljeimmersionslins på ett brett fält inverterat mikroskop. Likaså att bild fibronektin identifiera ECM nedbrytning med hjälp av en excitation och utsläpp filter av 492/518 nm.
6. Beredning och avbildning av Dragkraft Analyser
- Lägg 15000 cancerceller i 2 ml invadopodia medium till glas botten rätter och inkubera över natten.
- Aspirera medium i de glas botten rätter och ersätta med 2 ml L-15-medium, med samma tillskott (5% låg proteinserum, 10% fetalt bovint serum, och 20 ng / ml av nyligen tillsatt epidermal tillväxtfaktor), pre -warmed till 37 ° C.
- Inkubera glas botten rätter i en miljökammare på ett inverterat mikroskop förekvilibrerad till 37 ° C med hög fuktighet under en timme.
- Ta fyra uppsättningar bilder med hjälp av en hög NA 40X objektiv på en brett fält inverterat mikroskop med en automatiserad skede att markera cellulära positioner:
- Bildens celler på attp av PaaS använder faskontrast ("fas" bild).
- Bildens fluorescerande mikrosfärer med användning av excitations- och emissionsfilter av 560/645 nm genom att fokusera något under cellerna tills det första skiktet av mikrosfärer vid toppen av PaaS kommer i fokus ("belastade" bild).
- Dessutom, fokus till botten av PaaS (med användning av de mikrosfärer som markörer) och ta en bild ("botten" bild). Obs: Syftet med denna bild är att spela in z-positionen för att få den faktiska PAA tjocklek vid varje position för dragkraft beräkningar som beskrivs i Representativa resultat.
- Efter dessa bilder har förvärvats till flera positioner, blanda försiktigt i 220 pl 10% Triton-X-lösning för att avlägsna celler. Bildens mikrosfärer vid toppen av PaaS vid varje position såsom tidigare beskrivits ("null" bild).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I invadopodia assay invadopodia typiskt identifieras genom colocalization av markörer såsom aktin och cortactin vid punktuell strukturer inom cellkroppen (Figur 1). Både aktivt förnedrande och icke-nedbrytande invadopodia kan räknas och skiljer sig genom huruvida dessa strukturer samlokaliserades med svarta områden som saknar fluorescerande signal i FITC-märkt fibronektin (Figur 1). Invadopodia manuellt räknade, och ECM nedbrytning per cell bestäms genom att manuellt tröskling dessa svarta områden inom konturerna av cellerna.
I dragkraft analysen, är fyra bilder tagna vid varje cellulär plats präglad av scenen läget (Figur 2). Först "fas" och "stressade" bilderna är tagna av alla celler av intresse. En "bottom" bild av PAA tas också vid varje position för att beräkna hydrogel tjocklek. Efter avlägsnande than celler, är en "null" bild vid varje markerad skede läge. Deformationer i PaaS beräknas utifrån förändringen i mikrosfärlägen mellan "stressad" och "null" bilder. Dessa förskjutningar och de mekaniska egenskaperna hos den PaaS (E och antas vara 0,5 Poissons tal) används sedan för att beräkna dragkrafter (Figur 2). Flera olika metoder finns för att beräkna dragkrafter 24 baserat på någon formulering av Boussinesq lösningen för ett oändligt elastisk halvutrymmet 25. Medan detaljerna i dessa analyser är utanför ramen för denna text har vi licensierat LIBTRC programvara från Micah Dembo vid Boston University som använder en tidigare beskriven metod för att beräkna dragkrafter 26. Denna speciella beräkningsmetoden kompenserar för ändliga tjocklekar i sina beräkningar som kräver tjockleken på PaaS vid varje position som beräknas utifrån den difference i z-position "stressade" och "bottom" bilder. Många forskargrupper har liknande dator paket tillgängliga eller välja att skriva sina egna program. Dessutom finns andra metoder för beräkning av dragkrafter som bygger på olika matematiska metoder 24.
Figur 1: Den invadopodia analysen kan användas för att identifiera invadopodia och tillhörande ECM-nedbrytning Exempel brett fält fluorescensbilder av invadopodia i ett SCC-61 (huvud och hals skivepitelkarcinom) cellen på en hård PAA med en% gelatin och FITC-. märkt fibronektin. Invadopodia vanligtvis identifieras genom colocalization av två markörer såsom aktin och cortactin (rött och blått i overlay bilden, respektive). Invadopodia kan kvantifieras som både aktivt förnedrande (samlokaliserades med svarta områden bristing FITC-signal som betecknas med gula pilar) och icke-nedbrytande (betecknas med vita pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Den dragkraft analysen kan användas för att bestämma cellulära dragkrafter som alstras av aktincytoskelettet genom att spåra förflyttningen av inbäddade mikrosfärerna i PaaS Exempel bredfälts fas- och fluorescensbilder av en SCC-61-cell på ett hårt PAA (. "fas"), och mikrosfärerna direkt under cellen vid den övre ytan av PAA ("belastade"). En bild av botten av PAA kan också vidtas för att senare beräkna dess lokala tjocklek ("botten"). Efter cellen avlägsnas, en bild en gång tagit av mikrosfärens vid den övre ytan av PAA ("null"). Mikrosfärlägen mellan "stressad" och "null" bilder kan spåras för att ge en "förskjutning fält." Mikrosfär förskjutningar och PAA mekaniska egenskaper kan sedan användas för att beräkna en "dragkraft vektorfält." Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en metod för att tillverka PaaS som kan användas som grund för invadopodia och dragkraft analyser för att korrelera invasiva och kontraktila cellulära beteenden. Medan PaaS har länge använts för att titta på styvhet effekter på celler och beräkna dragkrafter 18,24,27, är den första att utveckla parallella analyser baserade på PaaS med samma stelbenthet att korrelera invasiva och kontraktila cellulära beteenden som svar på matrisen detta protokoll mekaniska egenskaper. Korrekt aktivering täck av glas botten rätter säkerställer att PaaS binder till dem och inte lossna. Medan vi och andra har förlitat sig på reagens såsom sulfo-SANPAH och akrylsyra NHS-ester för att binda gelatinet till ytan av PaaS i det förflutna 4,12,28, fann vi att dessa metoder inte tillverkade tillförlitligt likformiga ytskikt av fibronektin . Därför var fibronektin inbäddad och tvärbunden i hela PaaS använder akrylsyra NHS-ester som utförtav andra grupper 29,30. Emellertid var ökande koncentrationer av fibronektin erfordras för att ge samma ligandtäthet på ytorna av de mjuka, hårda, och styva PaaS 5. Dessutom inkorporering av fibronektin (men inte mikrosfärerna) minskade de mekaniska egenskaperna hos de mjuka, hårda och styva PaaS från 1.071, 9299, och 28.283 Pa 4 till 1.023, 7307, och 22.692 Pa 5, respektive. Men dessa minskade elastiska modulvärden fortfarande omfattade området för normala och cancervävnader 23. Förvaring moduler av PaaS kan lätt mätas genom reometri och omvandlas till elasticitetsmoduler 1,4.
Medan protokollet är rakt fram, sänka och avlägsna de 12 mm täckglas är de svåraste steg och kräver praxis. Den största utmaningen vid sänkning ett täck är att se till att PAA lösningen breder ut jämnt utan några bubblor eller stänk. Ta bort en täck kräveren stadig hand för att inte skada 12 mm täck, glas botten 14 mm täck eller PAA. Vi har försökt hydrofoba beläggningar på 12 mm täck till stöd i avlägsna men fann att PaaS är kvar med mönster i sina ytor. Användningen av fin spets och tunna, paddla stil pincett för att sänka och ta bort de 12 mm täck respektive rekommenderas starkt. Dessutom, mängden ljus som används för att avbilda cellerna måste minimeras eftersom vissa celltyper är känsliga för koncentrerat ljus på mikroskopet. Dessutom var L-15 medium som används för dragkraften analyser sedan vår klimatkammare på vår mikroskop inte är utrustad för CO2. Medan samma kosttillskott användes i media för invadopodia och dragkraft analyser i ett försök att hålla förhållanden samma kunde DMEM och RPMI 1640 användas i stället för L-15 om CO 2 nivåer kan kontrolleras.
Medan volymen av PAA-lösning valdes för att teoretiskt yield geler med en tjocklek av 75 um, deras tjocklekar varierar typiskt mellan 30-60 | im. Dock är väl över det värde till vilket cellerna kan känna av underliggande styvhet täck av glasbotten rätter 31 detta intervall. Dessutom tjockleken hos ECM skiktet används för att detektera degradering (gelatin och FITC-märkt fibronektin över på till PaaS) har tidigare rapporterats som ca 1 | im i tjocklek 12; Därför går denna tunna skikt inte skydda cellerna från stelheten i PaaS. Emellertid kan fast skräp, sprickor och andra missbildningar i antingen PaaS och / eller ECM skiktet påverkar individuella cellulära invasiva och kontraktila egenskaper. Dessa problem kan orsakas av orena 12 mm täck som introducerar skräp i hydrogeler, överdriven torkning av geler och / eller gelatin, och ofullständig aspirations natriumborohydrid som kan lämna bubblor som deformerar ECM lagret. Därför måste man vara försiktig när man väljer cells för avbildning för att se till att de inte otillbörligt påverkas av lokala oregelbundenheter i ytorna på proverna.
Relativt höga koncentrationer av fibronektin i både PaaS (blandas i vid 200-230 ug / ml) och ECM skiktet (överlagras på gelatinet vid 50 | ig / ml) har använts; emellertid de faktiska koncentrationerna på endera ytan har nämligen inte direkt mäts. Även om varje yta verkar vara mättad med fibronektin, är det oklart om celler upplever exakt samma ligand densiteter mellan de två analyserna. För dragkraften analyserna, 200 nm mikrosfärer vid en utspädning av 1: har 125 beprövad optimal för avbildning. Det är dock ganska vanligt att hitta andra grupper som använder mikrosfärer av olika diametrar eller utspädningar. I detta system mindre mikrosfärer visade Brownsk rörelse inom PaaS, medan större mikrosfärer orsakade sprickor och missbildningar. Dessa observationer är mest sannolikt på grund av de fysikaliska egenskaperna hos PaaS (dvs.
Sammantaget många av dessa experimentella faktorer kan justeras utifrån användarens krav som PaaS med olika mekaniska egenskaper, cancerceller med varierande invasiva och kontraktila egenskaper och mikroskope system med andra bildhanteringsfunktioner. Förhållandet akrylamid: BIS kan varieras för att producera PaaS med liknande eller olika elasticitetsmoduler och tvärbindnings 27. Känsligheten av dragkraften analyser kan justeras för att redogöra för olika cellulära kraftnivåer genom att ändra styvhet och / eller mikrosfär dilutjon. Olika fluoroforer kan också väljas för immunofluorescens och fibronektin märkning baserad på mikroskopspecifikationer. Medan FITC gör blekmedel, är det ganska ljust gör ECM nedbrytning lätta att identifiera. Men fluorescens avbildning av invadopodia och små mikrosfärer kräver vanligtvis höga NA mål för optimal upplösning. Dessutom kan båda analyser utföras på glastäckglas i brunnsplattor. Men glas botten rätter är mycket lättare att förbereda och använda hela experimentella processen. I framtiden skulle kombinera dessa analyser i en medge direkt visualisering av både ECM nedbrytning och cellulära styrkebidraget. Dock skulle flera tekniska utmaningar uppstår inklusive levande cell imaging för invadopodia och microbead förskjutningar, ökad cellulär exponering för ljus, blekning av FITC fibronektin, och om dragkrafter är helt transduceras genom fluorescerande och tvärbunden ECM lager till PAA ytorna .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av National Cancer Institute of National Institutes of Health i Award Number K25CA143412 (Parekh). Vi vill tacka för att ytterligare stöd gavs av Institutionen för Otolaryngologi. Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Acknowledgments
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use 6 drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1x PBS to 0.5% |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10x PBS stock |
| Mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10x PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10x PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS |
| Sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining |
References
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
- Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
- Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
- Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
- Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
- Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
- Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
- Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
- Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
- Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
- Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
- Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
- Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
- Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
- Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
- Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).
