Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ג'לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.

Abstract

רקמות גידול נוקשה היו מעורבות מאוד בויסות נדידת תאי הסרטן ופלישה. נדידה פולשנית דרך רקמות צולבות היא הקלה על ידי בליטות אקטין עשיר בשם invadopodia שproteolytically לבזות את המטריצה ​​תאית (ECM). פעילות Invadopodia הוכחה להיות תלוי בכוחות קשיחות ECM והתכווצות תאים סרטניים המצביעים על כך אותות קשיחות יכולים לווסת מבני subcellular אלה באמצעות התכווצות actomyosin. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג'לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג'לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. בעוד כמה וריאציות בין שני מבחני קיימות, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה ליצירת PaaS הבניתן להשתמש בשני מבחני והם בקלות להתאמה לצרכים הביולוגיים וטכניים הספציפיים של המשתמש.

Introduction

הנוקשות של ECM גידולים הקשורים זוהתה כגורם משמעותי בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת התכווצות actomyosin 1-3. בעוד השפעה זו בעיקר הודגמה עם תאי סרטן השד, נמצאו נוקשות מטריצה ​​לשנות תכונות פולשנית של תאים שמקורם במגוון רחב של סוגי הסרטן 4-8 טוענים כי נוקשות גידול עשוי לשחק תפקיד בסוג אחר של סרטן. לחדור רקמות צולבות במהלך נדידה פולשנית, תאים סרטניים לנצל בליטות דבקים אקטין עשיר הידוע בשם invadopodia שלמקם proteinases להשפיל ECM 9 focally. Invadopodia נחשב לסימן היכר של תאים פולשניים והיה מעורב בפלישת תאי גידול וגרור 10,11. מחקרים קודמים הראו כי נוקשות מטריצה ​​יכולות לווסת מספרי invadopodia וקשורים השפלה ECM 4,12 באמצעות פעילות שרירן השני וחלבוני mechanosensitive 12. בהתחשב במתאם בין צפיפות גידול ותוקפנות סרטן 13,14, משתמע מתוצאות אלה מנגנון שבאמצעותו תאי הסרטן עשויים להגיב לרקמות גידול נוקשה לנהוג פלישה וגרורות דרך התכווצות actomyosin.

בקשיחות ECM מבחנה ובצפיפות רקמת vivo הוכח לווסת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים 1,15-17. בעוד התכווצות actomyosin נראית חשוב בתהליך זה, סכסוך לימודים נוכחי, האם יכולת גרורתי מתואמת לעלתה או ירד כוחות התכווצות 6,18-20. יתר על כן, הוא נשאר לא ידוע אם כוחות אלה ישירות לתווך פעילות invadopodia 21. מצאנו לאחרונה כי כוחות התכווצות תאי הסרטן היו תלויים בנוקשות מטריצה ​​והיו חזוי של השפלה ECM על ידי invadopodia 5. תוצאות אלו מצביעות על כך שכוחות סלולריים עשויים לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות סרטן על ידי תיווך ac invadopodiativity בתגובה לתכונות מכאניות של מייקרו-הסביבה של הגידול.

על מנת לתאם את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאים סרטניים 5, שינינו פרוטוקול ליצירת PaaS עם קשיחויות שונות ששימשו בעבר לחקירת פעילות invadopodia קשיחות תלויה 4,12,22. על ידי כימי crosslinking פיברונקטין פלזמה האנושי לאורך PaaS, יכול לשמש הידרוג שונה אלה כבסיס לשני invadopodia ומבחני כוח המתיחה על מנת להבטיח שתאים חוו את אותו הקשיחויות בשני הניסויים 5. במבחני invadopodia, פיברונקטין מספק תחום מחייב טבעי לג'לטין לקשר ECM המעולף לPaaS לזהות הפחתת מטריצה. במבחני כוח המתיחה, פיברונקטין מספק ליגנד להידבקות סלולרית ישירה לאתר התקות microsphere המשמשות לחישוב כוחות מתיחה הסלולר. תוצאות שיטה זו במה שאנו קוראים רכים, קשים,וPaaS הנוקשה שחייבים מנות תחתית זכוכית ויש לי moduli אלסטי, E, של 1,023, 7307, והאבא 22692 5 שמשתרעים על פני מגוון רחב של תכונות מכאניות דיווחו לרקמות נורמליות וסרטניות 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Coverslips הזכוכית לPaaS

  1. coverslips הנקי 12 מ"מ עם מגבוני מוך נמוכים.
  2. להבת coverslips 12 מ"מ וcoverslip 14 מ"מ בmicrowell של כל צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ על ידי העברתם באמצעות להבת מבער בונזן באמצעות פינצטה.
  3. פנק את microwells עם 200 μl של 0.1 N NaOH למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  4. לשאוב ואוויר יבש microwells למשך 30 דקות.
  5. פנק את microwells עם 50-100 μl של 3-aminopropyltrimethoxysilane במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר במנדף. כימיקל זה מגיב עם פלסטיק; לכן, השימוש בטפטפות זכוכית ולא למלא את microwells לחלוטין להימנע ממגע עם פלסטיק הצלחת.
  6. שטוף את microwells עם מים ultrapure במשך כ -10 דקות עד 3-aminopropyltrimethoxysilane מתבהר.
  7. יש לשטוף את microwells עם המים ultrapure פעמיים באמצעות בקבוק לחיץ.
  8. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של מים ultrapureטמפרטורת חדר לא על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) במשך 10 דקות.
  9. לשאוב ואוויר יבש microwells למשך 30 דקות.
  10. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של 0.5% פתרון glutaraldehyde בטמפרטורת חדר על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) למשך 30 דקות.
  11. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של מים ultrapure בטמפרטורת חדר על כיסא נדנדה להגדיר במהירות בינונית (~ 1 הרץ) במשך 10 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 30 דקות.
  12. microwells יבש בזווית תלולה (60º או יותר) למשך 30 דקות.
    הערה: כלים יכולים להיות מאוחסנים במשך 2 חודשים בdessicator.

2. הכנת למבחני PaaS Invadopodia

  1. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הרך (acrylamide 8% ו 0.05% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 25 μl של 2% BIS, וμl 574 של המים ultrapure (טבלת 1).
  2. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הקשה (acrylamide 8% ו -0.35% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 175 & #181; l של 2% BIS, וμl 409 של המים ultrapure (טבלת 1).
  3. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הנוקשה (acrylamide 12% ושל 0.60% BIS), לשלב 300 μl של acrylamide 40%, 300 μl של 2% BIS, וμl 169 של המים ultrapure (טבלת 1).
  4. דגה הפתרונות במשך 15 דקות. הוסף 200, 215, ו -230 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין פלזמה האנושי במי ultrapure לפתרונות PAA הרכים, קשים, ונוקשה, בהתאמה. לכל הפתרונות, להוסיף 1 μl של 10 מ"ג חומצה אקרילית N-hydroxysuccinimide מיליליטר אסתר / (NHS), 5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר persulfate אמוניום, ו -2 μl של N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED ; טבלת 1). מערבבים עם pipetting העדין ולהימנע מיצירת בועות בפתרונות.

PAA
(1 מיליליטר) 		40%
AA
(Μl) 		2%
(Μl) 		Ultrapure
מים
(Μl) 		1 מ"ג / מיליליטר
FN
(Μl) 		10 מ"ג / מיליליטר
NHS אסתר
(Μl) 		100 מ"ג / מיליליטר
APS
(Μl)
TEMED
(Μl) 		Elastic
מודול
(אבא)
רך 200 25 574 200 1 5 2 1,023
קשה 200 175 409 215 1 5 2 7307
נוקשה 300 300 169 230 1 5 2 22692

טבלת 1: מרכיב volumes וכתוצאה מכך moduli אלסטי לPaaS רך, קשה, ונוקשה המשמש במבחני invadopodia. AA = acrylamide, FN = פיברונקטין, APS = persulfate אמוניום.

  1. פיפטה 8.48 μl של פתרון PAA למרכזו של כל microwell.
    הערה: כרך זה באופן תיאורטי מניב PAA של 75 מיקרומטר בעובי.
  2. בעדינות להוריד את צד הבערה של coverslip 12 מ"מ על הטיפה בmicrowell באמצעות פינצטה.
  3. אפשר פתרון PAA דחוק לפלמר במשך 15-30 דקות. ודא פילמור על ידי בדיקת פתרון השאריות.
  4. הוסף 2 מיליליטר של 1x PBS לכל מנה ולהסיר 12 מ"מ coverslips עם פינצטה.
    הערה: 10x PBS נעשה במעבדה ומורכבת מ0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M NaCl, ו0.056 M Na 2 4 HPO.
  5. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.

3. Pפיצוי של PaaS למבחני כוח מתיחה

  1. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הרך (acrylamide 8% ו 0.05% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 25 μl של 2% BIS, ו- 566 μl מים ultrapure (טבלה 2).
  2. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הקשה (acrylamide 8% ו -0.35% BIS), לשלב 200 μl של acrylamide 40%, 175 μl של 2% BIS, וμl 401 של המים ultrapure (טבלה 2).
  3. לפתרון 1 מיליליטר של PAA הנוקשה (acrylamide 12% ושל 0.60% BIS), לשלב 300 μl של acrylamide 40%, 300 μl של 2% BIS, וμl 161 של המים ultrapure (טבלה 2).
  4. דגה הפתרונות במשך 15 דקות. הוסף 200, 215, ו -230 μl של 1 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין פלזמה אנושית לפתרונות PAA הרכים, קשים, ונוקשה, בהתאמה. Sonicate 8 μl של 200 ננומטר microspheres האדום ניאון (עירור / פליטה של ​​580/605 ננומטר) למשך 30 שניות. לכל פתרון, להוסיף 8 μl של 200 microspheres ניאון האדום ננומטר,1 μl של 10 מ"ג / מיליליטר חומצה אקרילית NHS אסתר, 5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר persulfate אמוניום, ו -2 μl של TEMED (טבלה 2). מערבבים עם pipetting העדין ולהימנע מיצירת בועות בפתרונות.

PAA
(1 מיליליטר) 		40%
AA
(Μl) 		2%
BIS
(Μl) 		Ultrapure
מים
(Μl) 		1 מ"ג / מיליליטר
FN
(Μl)
מיקרו-התחומים
(Μl) 		10 מ"ג / מיליליטר
NHS אסתר
(Μl) 		100 מ"ג / מיליליטר
APS
(Μl)
TEMED
(Μl) 		Elastic
מודול
(אבא)
רך 200 25 566 200 8 1 5 2 1,023
קשה 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
נוקשה 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

טבלה 2:. כרכי מרכיב וכתוצאה מכך moduli אלסטי לPaaS רך, קשה, ונוקשה המשמש במבחני כוח המתיחה AA = acrylamide, FN = פיברונקטין, APS = persulfate אמוניום.

  1. פיפטה 8.48 μl של פתרון PAA למרכזו של כל microwell.
    הערה: כרך זה באופן תיאורטי מניב PAA של 75 מיקרומטר בעובי.
  2. בעדינות להוריד את צד הבערה של הדואר 12 מ"מ coverslip לאגל בmicrowell באמצעות פינצטה.
  3. אפשר פתרון PAA דחוק לפלמר במשך 15-30 דקות. ודא פילמור על ידי בדיקת פתרון שאריות.
  4. הוסף 2 מיליליטר של 1x PBS לכל מנה ולהסיר 12 מ"מ coverslips עם פינצטה.
  5. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.

4. הכנת ECM למבחני Invadopodia

  1. מחממים את פתרון ג'לטין (ג'לטין 1% וסוכרוז 1%) ל -37 מעלות צלזיוס.
  2. פנק את PaaS עם 150 μl של פתרון ג'לטין 1 דקות לאחר מכן בזהירות לשאוב מעומק microwells כאשר מחזיקים את המנות תחתית הזכוכית בזווית של 45 מעלות.
  3. ייבש את השכבה שנותרה דקה של ג'לטין על PaaS בmicrowells בזווית תלולה (60 ° או יותר) כדי לייעל את הייבוש למשך 60 דקות.
  4. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של פתרון glutaraldehyde 0.5% צונן על iCe במשך 15 דקות ואחריו בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  5. שטוף את microwells עם 2 מיליליטר של PBS 1x במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
  6. פנק את microwells עם 2 מיליליטר של פתרון borohydride נתרן 1 דקות. לטפוח בעדינות מנות על ספסל כדי להסיר בועות כי טופס על פני השטח של ג'לטין.
  7. לשאוב ולשטוף את microwells עם 2 מיליליטר של PBS 1x במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
  8. לדלל פתרון פיברונקטין הפלזמה אנושי FITC שכותרתו 50 מיקרוגרם / מיליליטר עם PBS 1x ו צנטריפוגות ב 175,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כך או לרכוש פיברונקטין שכותרתו זמין מסחרי או לתייג אותו באופן הבא:
    1. ממיסים 5 מ"ג פיברונקטין ב 10 מיליליטר של חיץ borate (tetrahydrate metaborate 170 נתרן מ"מ ו -40 מ"מ NaCl) ומקום בצינורות דיאליזה.
    2. תווית פיברונקטין על ידי הנחת צינורות ב200 מיליליטר של חיץ borate המכיל 6 מ"ג FITC המומס בטמפרטורת חדר על stirrer מגנטילהגדיר בהגדרה הנמוכה ביותר עבור 1.5 שעות בחושך.
    3. Dialyze עם 500 מיליליטר של PBS 1x על stirrer מגנטי מוגדר בהגדרה הנמוכה ביותר במשך 3 ימים בחדר קר כהה (4 ° C) עם שני נפח משתנה ביום.
    4. ריכוז פיברונקטין FITC שכותרתו לחשב על בסיס הצפיפות האופטית של aliquots המדולל (1: 200) ב 280 ננומטר וnm 493 כ[ OD 280 - (0.36 x OD 493)] / 1.4 פעמים גורם לדילול של 200 פעמים 2 (המהווה לגליצרול ריכוז פיברונקטין בשלב הבא) וכתוצאה מכך ביחידות מיליליטר / מ"ג.
    5. Dialyze הלילה בפתרון גליצרול 50% על stirrer מגנטי מוגדר בהגדרה הנמוכה ביותר ללילה בחדר קר וחשוך על 4 מעלות צלזיוס.)
  9. פנק את microwells עם 150 μl של פתרון פיברונקטין FITC שכותרתו בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות בחושך.
  10. בזהירות לשאוב פתרון פיברונקטין שכותרתו FITC מהחלק התחתון של microwells כאשר מחזיקים את המנות תחתית הזכוכית בבזווית של 45 מעלות ולאחר מכן למלא את מנות תחתית כוס עם 70% אתנול פתרון בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות במכסת מנוע תרבית תאים חשוכות לעיקור. כמו כן למלא מכסי צלחת תחתית זכוכית או לנגב לנקות עם מגבוני מוך נמוכים הספוגים באתנול 70%.
  11. לשטוף כלים תחתית זכוכית על ידי מילוי אותם עם 1x PBS במשך 5 דקות. חזור פעמים נוספות עם 2 מיליליטר של 1x PBS עבור הסכום כולל של 15 דקות.

5. הכנה והדמיה של מבחני Invadopodia

  1. להוסיף 25,000 תאים סרטניים ב 2 מיליליטר של מדיום invadopodia (1: 1 DMEM וRPMI 1640 עם 5% בסרום דל חלבון, 10% בסרום שור עוברי, ו- 20 / מיליליטר ng של גורם גדילה באפידרמיס הוסיף טרי) למאכלי תחתית הזכוכית ו דגירה הלילה.
  2. לשאוב ולטפל microwells עם 2 מיליליטר של פתרון paraformaldehyde 3.7% בטמפרטורת חדר בחושך במשך 20 דקות כדי לתקן את התאים.
  3. לאחר שתי שטיפות מהירות עם 2 מיליליטר של 1x PBS, טיפול בmicrowells עם 2 מיליליטר של 0.1% פתרון Triton X-100 בטמפה החדרrature בחושך במשך 5 דקות כדי permeabilize התאים.
  4. לאחר שטיפה מהירה אחד עם 2 מיליליטר של 1x PBS, טיפול בmicrowells עם 3% אלבומין בסרום שור חסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות כדי לחסום את התאים.
  5. דגירה microwells עם 150 μl של נוגדן עכבר נגד cortactin (1: 750) בחסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות.
  6. לשטוף microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
  7. דגירה microwells עם 150 μl של עז אנטי עכבר 633 נוגדן (1: 500) וphalloidin 546 (1: 750) בחסימת פתרון בטמפרטורת חדר בחושך במשך 60 דקות.
  8. לשטוף microwells עם 2 מיליליטר של 1x PBS במשך 5 דקות. חזור על פי שניים יותר עבור הסכום כולל של 15 דקות.
  9. להוסיף שש טיפות של הרכבה בינונית כדי למלא בכל microwell ולכסות עם 22 x 22 coverslips.
  10. cortactin תמונה ויקטין לזהות invadopodia באמצעות מסנני עירור ופליטה של ​​632/647 ננומטר ו556/570 ננומטר, בהתאמה, באמצעות עדשת טבילת שמן גבוה NA, 40X על מיקרוסקופ הפוך רחב בתחום. באופן דומה, פיברונקטין התמונה לזהות השפלה ECM באמצעות מסנן עירור ופליטה של ​​492/518 ננומטר.

6. הכנה והדמיה של מבחני כוח מתיחה

  1. להוסיף 15,000 תאים סרטניים ב 2 מיליליטר של מדיום invadopodia למנות תחתית הכוס ודגירת הלילה.
  2. לשאוב בינוני במנות תחתית הזכוכית ולהחליף עם 2 מיליליטר של L-15 בינוני, עם אותו התוספים (5% בסרום דל חלבון, 10% בסרום שור עוברי, ו- 20 / מיליליטר ng של גורם גדילה באפידרמיס הוסיף טרי), מראש -warmed עד 37 מעלות צלזיוס.
  3. דגירה המנות תחתית זכוכית בתא סביבתי על מיקרוסקופ הפוכה מראש equilibrated עד 37 ° C עם לחות גבוהה עבור שעה 1.
  4. קח ארבעה סטים של תמונות באמצעות NA גבוה, 40X עדשה על מיקרוסקופ שדה רחב הפוך עם שלב אוטומטי לציון עמדות סלולריות:
    1. תאי תמונה לp של PaaS באמצעות ניגוד שלב (תמונת "שלב").
    2. microspheres ניאון תמונה באמצעות מסנני עירור ופליטה של ​​560/645 nm על ידי התמקדות במקצת עד שהשכבה הראשונה של microspheres בחלק העליון של PaaS מתחת לתאים מתחדד ("הדגיש" תמונה).
    3. בנוסף, יתמקד לתחתית PaaS (באמצעות microspheres כסמנים) ולקחת את תמונה (תמונה "מלמטה"). הערה: המטרה של תמונה זו היא להקליט z-העמדה כדי לקבל את עובי PAA בפועל בכל עמדה לחישובי כוח המתיחה כפי שמתואר בנציגי תוצאות.
    4. לאחר תמונות אלה נרכשו במספר עמדות, לערבב בעדינות ב220 μl של 10% פתרון Triton-X כדי להסיר תאים. microspheres תמונה בחלק העליון של PaaS בכל עמדה כ( תמונת "null") שתוארה קודם לכן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בassay invadopodia, invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של סמנים כמו אקטין וcortactin במבני punctate בתוך גוף התא (איור 1). שני invadopodia פעיל המשפיל ולא משפיל ניתן לספור ונבדלים באם מבנים אלה colocalized עם אזורים שחורים חסרי אות ניאון בפיברונקטין FITC שכותרתו (איור 1). Invadopodia נספרים באופן ידני, והשפלה ECM לכל תא נקבעה על ידי thresholding ידני האזורים השחורים האלה בתוך קווי המתאר של התאים.

בassay כוח המתיחה, ארבע תמונות שנתפסו בכל מקום סלולארי מתאפיין בעמדת שלב (איור 2). ראשון, "שלב" ו- "הדגיש" תמונות שצולמו של כל התאים של עניין. תמונה "תחתונה" של PAA נלקחה גם בכל עמדה על מנת לחשב עובי הידרוג'ל. לאחר הסרת tהוא תאים, תמונה "null" נלקחת במיקום כל שלב מסומן. עיוותים בPaaS מחושבים על בסיס השינוי בעמדות microsphere בין "הדגיש" ותמונות "null". התקות אלה ואת התכונות מכאניות של PaaS (E ומקדם פואסון להניח כ0.5) משמשים לאחר מכן לחישוב כוחות מתיחה (איור 2). כמה שיטות שונות קיימות לחישוב כוחות המתיחה 24 המבוססים על כמה גיבוש פתרון Boussinesq למחצית שטח אלסטיות אינסופי 25. בעוד הפרטים של ניתוחים אלה הם מעבר להיקף של הטקסט הזה, יש לנו רישיון תוכנת LIBTRC ממיכה דמבו באוניברסיטת בוסטון שמשתמש בשיטה שתוארה לעיל לחישוב כוחות המתיחה 26. שיטה חישובית מסוימת זה מפצה על עובי סופי בחישוביה המחייב את העובי של PaaS בכל עמדה שמחושב על בסיס difference בz-העמדה ותמונות ", הדגישו" "מלמטה". יש קבוצות מחקר רבות חבילות מחשב דומות זמינות או בוחרות לכתוב תוכניות משלהם. בנוסף, קיימות שיטות אחרות לחישוב כוחות מתיחה המבוססים על גישות מתמטיות שונות 24.

איור 1
איור 1: assay invadopodia יכול לשמש כדי לזהות invadopodia והשפלה ECM הקשורים תמונות הקרינה רחב בתחום דוגמא invadopodia בתא SCC-61 (ראש וקרצינומה של תאי קשקש צוואר) על PAA קשה עם ג'לטין 1% וFITC-. פיברונקטין שכותרת. Invadopodia מזוהה בדרך כלל על ידי colocalization של שני סמנים כגון אקטין וcortactin (אדום וכחול בתמונה השכבה, בהתאמה). Invadopodia ניתן נרשמת כשני פעילים המשפילים (colocalized עם אזורים שחורים מחוסרing אות FITC ככונתה על ידי חצים צהובים) ולא משפיל (כונה על ידי חצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: assay כוח המתיחה יכול לשמש כדי לקבוע כוחות מתיחה סלולריים שנוצרו על ידי cytoskeleton אקטין על ידי מעקב העקירה של microspheres המשובץ בתמונות שלב וקרינה רחב בתחום PaaS דוגמא של תא SCC-61 על PAA קשה (. "שלב"), וmicrospheres ישירות מתחת לתא במשטח העליון של PAA ("הדגיש"). יכולה גם לקחת תמונה של החלק התחתון של PAA מאוחר יותר לחישוב העובי המקומי שלה ("מלמטה"). לאחר התא מוסר, תמונה נלקחה שוב של microsphereים במשטח העליון של PAA ("ריק"). עמדות Microsphere בין "הדגישו" וניתן לעקוב תמונות "null" להניב "שדה עקירה." התקות Microsphere ותכונות מכאניות PAA לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב "שדה כיוון מתיחה." לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים שיטה לבודת PaaS שיכול לשמש כבסיס למבחני invadopodia וכוח המתיחה לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות. בעוד PaaS כבר מזמן משמש להסתכל על השפעות נוקשות בתאים ולחשב כוחות המתיחה 18,24,27, פרוטוקול זה הוא ראשון לפתח מבחני מקבילים המבוססים על PaaS עם אותו הקשיחויות לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות בתגובה למטריצה תכונות מכאניות. כראוי הפעלת coverslips של המנות תחתית הזכוכית מבטיחה כי PaaS יהיה לאגד אותם ולא יורד. אמנם יש לנו ואחרים הסתמכו על חומרים כימיים כגון sulfo-SANPAH ואסתר NHS חומצה אקרילית להיקשר ג'לטין אל פני השטח של PaaS ב4,12,28 האחרונים, מצאנו כי שיטות אלה לא לייצר שכבות משטח אחידות באופן מהימן של פיברונקטין . לכן, פיברונקטין היה משובץ וcrosslinked ברחבי PaaS באמצעות אסתר NHS חומצה אקרילית כפי שבוצעעל ידי קבוצות אחרות 29,30. עם זאת, ריכוזים הולכים וגדל של פיברונקטין נדרשו כדי להפיק את אותו הצפיפות ליגנד במשטחים של PaaS הרך, קשה, ונוקשה 5. בנוסף, שילוב של פיברונקטין (אך לא microspheres) הפחית את התכונות מכאניות של PaaS הרך, קשה, ונוקשה מ1,071, 9299, ו28283 4 אבא ל1,023, 7307, ואבא 22692 5, בהתאמה. עם זאת, ערכי moduli אלה מופחתים אלסטי עדיין הקיפו מגוון רחב של רקמות נורמליות וסרטניות 23. moduli האחסון של PaaS יכול בקלות להיות שנמדד על ידי rheometry והמיר לmoduli אלסטי 1,4.

בעוד הפרוטוקול הוא ישר קדימה, הורדה והסרת 12 מ"מ coverslips הם הצעדים הקשים ביותר ודורש אימון. האתגר הגדול ביותר בעת הורדת coverslip הוא להבטיח כי פתרון PAA מתפשט באופן שווה ללא כל בועות או התזות. הסרת coverslip מחייביד יציבה על מנת שלא לפגוע בcoverslip 12 מ"מ, 14 מ"מ הזכוכית תחתון coverslip, או PAA. יש לנו ניסינו ציפוי הידרופובי על coverslip 12 מ"מ כדי לסייע בהסרה אך נמצא כי PaaS נשאר עם דפוסים בשטח שלהם. השימוש בטיפ נאה ופינצטה להורדה והסרת 12 מ"מ coverslips הדק, בסגנון ההנעה, בהתאמה, מומלץ מאוד. בנוסף, כמות האור משמשת לתמונת התאים חייבים להיות ממוזערת מאז כמה סוגי תאים רגישים לאור המרוכז במיקרוסקופ. כמו כן, L-15 בינוניים שימש למבחני כוח המתיחה מאז קאמרי הסביבתית שלנו במיקרוסקופ שלנו אינו מצויד לCO 2. בעוד אותו התוספים שמשו בתקשורת למבחני invadopodia וכוח המתיחה בניסיון לשמור על תנאים זהים, יכולים לשמש DMEM וRPMI 1640 במקום L-15 אם ניתן לשלוט CO 2 רמות.

בעוד שהיקף פתרון PAA נבחר באופן תיאורטי yג'לי ield בעובי של 75 מיקרומטר, עובייהם להשתנות בדרך כלל בין 30-60 מיקרומטר. עם זאת, טווח זה הוא הרבה מעל הערך שבו תאים יכולים לחוש את הקשיחות הבסיסית של coverslips של מנות תחתית כוס 31. בנוסף, עובי שכבת ECM משמש לאיתור השפלה (ג'לטין ופיברונקטין FITC שכותרתו מעולף על לPaaS) דווח ככ 1 מיקרומטר בעובי 12 בעבר; לכן, שכבה דקה זה לא להגן על התאים מהקשיחויות של PaaS. עם זאת, פסולת מוצקה, סדקים, ועיוותים אחרות באו PaaS ו / או שכבת ECM יכולים להשפיע על תכונות פולשניות והתכווצות סלולריות אישיות. יכולות להיגרם בעיות אלו על ידי coverslips 12 מ"מ טמא שמציג את הפסולת לתוך הידרוג, ייבוש מוגזם של ג'לים ו / או ג'לטין, ושאיפה שלמה של borohydride נתרן שיכול להשאיר את הבועות שלעוות את שכבת ECM. לכן, יש להקפיד בעת בחירת ceLLS הדמיה כדי לוודא שהם אינם מושפעים יתר על המידה על ידי אי-סדרים מקומיים במשטחים של הדגימות.

ריכוזים גבוהים יחסית של פיברונקטין בשני PaaS (מעורב ב200-230 מיקרוגרם / מיליליטר) ושכבת ECM (מעולף על ג'לטין ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר) היה בשימוש; עם זאת, הריכוזים בפועל משני פני השטח לא היו למדוד באופן ישיר. למרות שכל פני השטח נראה שרוויים בפיברונקטין, לא ברור אם תאים לחוות את אותה צפיפות יגנד מדויקת בין שני מבחני. למבחני כוח המתיחה, 200 ננומטר microspheres בדילול של 1: 125 הוכיח אופטימלי להדמיה. עם זאת, זה די נפוץ למצוא קבוצות אחרות באמצעות microspheres של קטרים ​​או דילולים שונים. במערכת זו, microspheres הקטן יותר מוצג תנועה בראונית בתוך PaaS, בעוד microspheres הגדול גרם לסדקים ועיוותים. תצפיות אלה הן ככל הנראה בשל התכונות הפיסיקליות של PaaS (כלומר

בסך הכל, רב של גורמים הניסיוניים אלה יכולים להיות מותאם על בסיס הדרישות של המשתמש כגון PaaS עם תכונות מכאניות שונות, תאי סרטן עם משתנה תכונות פולשניות והתכווצות, ומערכות מיקרוסקופיה עם יכולות הדמיה אחרות. היחס של acrylamide: BIS יכול להיות מגוון כדי לייצר PaaS עם moduli אלסטי דומה או שונה וcrosslinking 27. הרגישות של מבחני כוח המתיחה יכולה להיות מותאמת לחשבון לרמות כוח סלולארי שונות על ידי שינוי dilut הנוקשות ו / או microsphereיון. יכולה להיות גם שנבחרה fluorophores שונה לתיוג immunofluorescence ופיברונקטין מבוסס על מפרטי מיקרוסקופ. בעוד FITC עושה אקונומיקה, זה השפלה ECM קבלת בהירה למדי לזיהוי בקלות. עם זאת, הדמיה הקרינה של microspheres invadopodia וקטן בדרך כלל דורשת מטרות NA גבוהות לרזולוציה אופטימלית. בנוסף, ניתן לבצע שני מבחני על coverslips זכוכית בצלחות גם. עם זאת, כלים מזכוכית תחתונה הם הרבה יותר קלים להכין ולהשתמש בכל התהליך הניסיוני. בעתיד, שילוב מבחני אלה לאחד יאפשר להדמיה ישירה של שתי השפלה ECM ודור כוח סלולארי. עם זאת, כמה אתגרים טכניים תקומנה כוללים הדמיה חיה תא להתקות invadopodia וmicrobead, חשיפה מוגברת לאור סלולארי, הלבנה של פיברונקטין FITC, ואם כוחות המתיחה הם transduced לחלוטין דרך שכבת ECM שכותרתו fluorescently וצולבים למשטחי PAA .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס K25CA143412 (פארח). ברצוננו להכיר בכך שתמיכה נוספת סופקה על ידי המחלקה אף אוזן הגרון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

Acknowledgments

יש לי המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Tags

רפואה גיליון 95 invadopodia כוח מתיחה השפלה התכווצות נוקשות polyacrylamide
ג'לים polyacrylamide לInvadopodia וגרירת חיל מבחני בתאי הסרטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerrell, R. J., Parekh, A.… More

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter