קשיחות מכאנית במייקרו-הסביבה של הגידול ממלא תפקיד מכריע בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת פעילות invadopodia וactomyosin התכווצות. ג'לים באמצעות polyacrylamide (PaaS), יכולים להיות מנוצלים מבחני invadopodia וכוח המתיחה ללמוד את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן בתגובה למטריצת קשיחות.
רקמות גידול נוקשה היו מעורבות מאוד בויסות נדידת תאי הסרטן ופלישה. נדידה פולשנית דרך רקמות צולבות היא הקלה על ידי בליטות אקטין עשיר בשם invadopodia שproteolytically לבזות את המטריצה תאית (ECM). פעילות Invadopodia הוכחה להיות תלוי בכוחות קשיחות ECM והתכווצות תאים סרטניים המצביעים על כך אותות קשיחות יכולים לווסת מבני subcellular אלה באמצעות התכווצות actomyosin. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג'לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. מאפיינים פולשנית והתכווצות של תאי סרטן יכולים להיות מתואמים במבחנה באמצעות מבחני invadopodia וכוח המתיחה המבוססים על ג'לים polyacrylamide (PaaS) של קשיחויות שונות. בעוד כמה וריאציות בין שני מבחני קיימות, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה ליצירת PaaS הבניתן להשתמש בשני מבחני והם בקלות להתאמה לצרכים הביולוגיים וטכניים הספציפיים של המשתמש.
הנוקשות של ECM גידולים הקשורים זוהתה כגורם משמעותי בהתנהגות נהיגה ממארת על ידי הגדלת התכווצות actomyosin 1-3. בעוד השפעה זו בעיקר הודגמה עם תאי סרטן השד, נמצאו נוקשות מטריצה לשנות תכונות פולשנית של תאים שמקורם במגוון רחב של סוגי הסרטן 4-8 טוענים כי נוקשות גידול עשוי לשחק תפקיד בסוג אחר של סרטן. לחדור רקמות צולבות במהלך נדידה פולשנית, תאים סרטניים לנצל בליטות דבקים אקטין עשיר הידוע בשם invadopodia שלמקם proteinases להשפיל ECM 9 focally. Invadopodia נחשב לסימן היכר של תאים פולשניים והיה מעורב בפלישת תאי גידול וגרור 10,11. מחקרים קודמים הראו כי נוקשות מטריצה יכולות לווסת מספרי invadopodia וקשורים השפלה ECM 4,12 באמצעות פעילות שרירן השני וחלבוני mechanosensitive 12. בהתחשב במתאם בין צפיפות גידול ותוקפנות סרטן 13,14, משתמע מתוצאות אלה מנגנון שבאמצעותו תאי הסרטן עשויים להגיב לרקמות גידול נוקשה לנהוג פלישה וגרורות דרך התכווצות actomyosin.
בקשיחות ECM מבחנה ובצפיפות רקמת vivo הוכח לווסת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים 1,15-17. בעוד התכווצות actomyosin נראית חשוב בתהליך זה, סכסוך לימודים נוכחי, האם יכולת גרורתי מתואמת לעלתה או ירד כוחות התכווצות 6,18-20. יתר על כן, הוא נשאר לא ידוע אם כוחות אלה ישירות לתווך פעילות invadopodia 21. מצאנו לאחרונה כי כוחות התכווצות תאי הסרטן היו תלויים בנוקשות מטריצה והיו חזוי של השפלה ECM על ידי invadopodia 5. תוצאות אלו מצביעות על כך שכוחות סלולריים עשויים לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות סרטן על ידי תיווך ac invadopodiativity בתגובה לתכונות מכאניות של מייקרו-הסביבה של הגידול.
על מנת לתאם את המאפיינים פולשנית והתכווצות של תאים סרטניים 5, שינינו פרוטוקול ליצירת PaaS עם קשיחויות שונות ששימשו בעבר לחקירת פעילות invadopodia קשיחות תלויה 4,12,22. על ידי כימי crosslinking פיברונקטין פלזמה האנושי לאורך PaaS, יכול לשמש הידרוג שונה אלה כבסיס לשני invadopodia ומבחני כוח המתיחה על מנת להבטיח שתאים חוו את אותו הקשיחויות בשני הניסויים 5. במבחני invadopodia, פיברונקטין מספק תחום מחייב טבעי לג'לטין לקשר ECM המעולף לPaaS לזהות הפחתת מטריצה. במבחני כוח המתיחה, פיברונקטין מספק ליגנד להידבקות סלולרית ישירה לאתר התקות microsphere המשמשות לחישוב כוחות מתיחה הסלולר. תוצאות שיטה זו במה שאנו קוראים רכים, קשים,וPaaS הנוקשה שחייבים מנות תחתית זכוכית ויש לי moduli אלסטי, E, של 1,023, 7307, והאבא 22692 5 שמשתרעים על פני מגוון רחב של תכונות מכאניות דיווחו לרקמות נורמליות וסרטניות 23.
אנו מציגים שיטה לבודת PaaS שיכול לשמש כבסיס למבחני invadopodia וכוח המתיחה לתאם התנהגויות סלולריות פולשנית והתכווצות. בעוד PaaS כבר מזמן משמש להסתכל על השפעות נוקשות בתאים ולחשב כוחות המתיחה 18,24,27, פרוטוקול זה הוא ראשון לפתח מבחני מקבילים המבוססים על PaaS עם אותו הקשיחויו…
The authors have nothing to disclose.
יש לי המחברים אין לחשוף.
3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |