Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Механическая жесткость в опухоли микроокружения играет решающую роль в стимулировании злокачественной поведение, увеличивая invadopodia деятельность и актомиозин сократимость. Использование гелей полиакриламида (ЧУК), invadopodia и тяговое усилие анализы могут быть использованы для изучения инвазивных и сократительные свойства раковых клеток в ответ на матрицу жесткости.

Abstract

Жесткие ткани опухоли были сильно вовлечены в регулирование миграции раковых клеток и вторжения. Инвазивные миграции через сшитых тканей способствует актин-богатых выступов, называемых invadopodia, что протеолитически ухудшают внеклеточный матрикс (ВКМ). Invadopodia деятельность было показано, что в зависимости от жесткости ECM и сократительных клеток рака сил, предполагая, что жесткость сигналы могут регулировать эти субклеточные структуры, посредством актомиозинового сократительной. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. В то время как некоторые различия между двумя анализов существуют, протокол, представленные здесь относится к способу создания Paas йна может быть использован в обоих анализах и легко адаптируются к конкретным биологических и технических потребностей пользователя.

Introduction

Жесткость опухолеассоциированному ECM была определена в качестве важного фактора в движении злокачественной поведение, увеличивая актомиозина сократимость 1-3. В то время как этот эффект, прежде всего, было продемонстрировано с клетками рака молочной железы, матрица жесткости было обнаружено, чтобы изменить свойства инвазивных клеток, полученных из различных видов рака 4-8 предположить, что жесткость опухоли может играть роль в других типов рака. Чтобы проникнуть сшитых тканей при инвазивной миграции, раковые клетки используют актин-богатых клейкие выступы, известные как invadopodia, что локализовать протеиназ в очаговым ухудшить ECM 9. Invadopodia рассматриваются признаком инвазивных клеток и участвуют в инвазии клеток опухоли и метастазов 10,11. Предыдущая работа показала, что матрица жесткости может регулировать число invadopodia и связанные с деградацией ECM 4,12 через миозина II деятельности и механочувствительных белков 12. УчитываяКорреляция между плотностью опухоли и рак агрессивности 13,14, эти результаты показывают, механизм, с помощью которого раковые клетки могут реагировать на жестких тканей опухоли для управления инвазию и метастазирование через актомиозинового сократимости.

В пробирке ECM жесткости и в естественных плотности ткани, как было показано, чтобы регулировать инвазивной поведение раковых клеток 1,15-17. В то время как актомиозин сократимость представляется важным в этом процессе, в настоящее время исследования конфликтов, чтобы метастатического потенциала коррелирует ли увеличение или уменьшение сократительной силы 6,18-20. Кроме того, остается неизвестным, являются ли эти силы непосредственно посредником invadopodia деятельность 21. Мы недавно обнаружили, что клетки рака сократительные силы зависят от матрицы жесткости и были прогнозирования деградации ЕСМ invadopodia 5. Эти результаты показывают, что сотовые силы могут играть важную роль в прогрессировании рака по посреднические invadopodia переменного токательность в ответ на механические свойства микроокружения опухоли.

Для того, чтобы соотнести инвазивных и сократительные свойства раковых клеток 5, мы изменили протокол для создания PaaS с различной жесткостью, который ранее использовался для исследования жесткости в зависимости от invadopodia деятельность 4,12,22. К химическим сшиванием человеческого фибронектина в плазме в течение всего ЧУК эти модифицированные гидрогели могут быть использованы в качестве основы для обоих invadopodia и тяговое усилие анализов, чтобы гарантировать, что клетки испытывали те же жесткость в обоих экспериментах 5. В invadopodia анализов, фибронектин обеспечивает естественный связывающий домен желатина, чтобы связать наложенное ЕСМ в ЧУК, чтобы обнаружить деградации матрицы. В силу тяги анализов, фибронектин обеспечивает лиганд для прямого клеточной адгезии, чтобы обнаружить микросфер смещения, используемые для расчета сотовой тяговые силы. Этот метод приводит к тому, что мы назвали мягкий, твердый,и жесткие ЧУК, которые связаны с стеклянным дном посуды и имеют модули упругости Е, из 1023, 7307 и 22692 Па 5, которые охватывают диапазон механических свойств, представленных за нормальными и раковыми тканями 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка покровные стекла для ЧУК

  1. Чистые 12 мм покровные с низким салфетки волокна.
  2. Пламя мм покровные 12 и 14 мм покровное в микролунку каждого 35 мм со стеклянным дном блюдо, пропуская их через пламени горелки Бунзена с помощью пинцета.
  3. Обработать лунки 200 мкл 0,1 N NaOH в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Отберите и воздух сухой микролунки в течение 30 мин.
  5. Обработать лунки с 50-100 мкл 3-аминопропилтриметоксисилан в течение 10 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Это химическое вещество вступает в реакцию с пластиком; Поэтому, использовать стеклянные пипетки и не заполнять лунки полностью, чтобы избежать контакта с блюдом пластика.
  6. Вымойте лунки с особо чистой воды в течение 10 мин до 3-аминопропилтриметоксисилан не станет ясно.
  7. Промыть лунки сверхчистой водой в два раза с использованием бутыли.
  8. Вымойте лунки с 2 мл сверхчистой воды апри комнатной температуре трет на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 10 мин.
  9. Отберите и воздух сухой микролунки в течение 30 мин.
  10. Обработать лунки с 2 мл 0,5% раствора глутаральдегида при комнатной температуре на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 30 мин.
  11. Промыть лунки с 2 мл сверхчистой воды при комнатной температуре на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 10 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 30 мин.
  12. Сухие лунки под крутым углом (60 ° или более) в течение 30 мин.
    Примечание: Блюда могут быть сохранены в течение 2 месяцев в эксикаторе.

2. Подготовка ЧУК для Invadopodia Анализы

  1. Для 1 мл раствора мягкого ПАК (8% акриламида и 0,05% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 25 мкл 2% BIS и 574 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  2. Для 1 мл раствора на жестком ПАК (8% акриламида и 0,35% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 175 & #181; л 2% БИС, и 409 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  3. Для 1 мл раствора твердого ПАА (12% акриламида и 0,60% BIS), объединить 300 мкл 40% акриламида, 300 мкл 2% BIS и 169 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  4. Дега решения в течение 15 мин. Добавить 200, 215, и 230 мкл 1 мг / мл человеческого фибронектина плазмы в особо чистой воды для мягких, жестких и жестких решений ПАК, соответственно. Для всех решений, добавить 1 мкл 10 мг / мл акриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (NHS) эфир, 5 мкл 100 мг / мл персульфата аммония в и 2 мкл N, N, N ', N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED ; таблица 1). Смешать с осторожно пипеткой и избежать образования пузырьков в растворах.

ПАК
(1 мл) 		40%
А.А.
(Мкл) 		2%
(Мкл) 		Ultrapure
Вода
(Мкл) 		1 мг / мл
FN
(Мкл) 		10 мг / мл
NHS эфир
(Мкл) 		100 мг / мл
APS
(Мкл)
TEMED
(Мкл) 		Эластичный
Модуль
(Па)
Мягкий 200 25 574 200 1 5 2 1023
Жесткий 200 175 409 215 1 5 2 7307
Жесткий 300 300 169 230 1 5 2 22692

Таблица 1: Ингредиент VoluМЧС и в результате упругих модулей для мягких, жестких и твердых ЧУК, используемых в invadopodia анализов. AA = акриламид, FN = фибронектин, APS = персульфат аммония.

  1. Пипетировать 8,48 мкл раствора ПАА на центр каждого микролунку.
    Примечание: Этот объем теоретически дает ПАК 75 мкм в толщину.
  2. Осторожно опустите пылали сторону 12 мм покровного стекла капельке в микролунку с помощью пинцета.
  3. Разрешить зажатой решение ПАК для полимеризации в течение 15-30 мин. Проверьте полимеризации путем проверки остатки раствора.
  4. Добавить 2 мл 1x PBS в каждую чашку и удалить 12 мм покровные с помощью пинцета.
    Примечание: 10x PBS, выполнен в лаборатории и состоит из 0,011 М КН 2 РО 4, 1,54 М NaCl, и 0,056 М Na 2 HPO 4.
  5. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.

3. Pвозмещение ЧУК для Тяговое усилие Анализы

  1. Для 1 мл раствора мягкого ПАК (8% акриламида и 0,05% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 25 мкл 2% BIS и 566 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  2. Для 1 мл раствора на жестком ПАК (8% акриламида и 0,35% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 175 мкл 2% BIS и 401 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  3. Для 1 мл раствора жесткой ПАК (12% акриламида и 0,60% BIS), объединить 300 мкл 40% акриламида, 300 мкл 2% BIS и 161 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  4. Дега решения в течение 15 мин. Добавить 200, 215, и 230 мкл 1 мг / мл плазмы человека фибронектина в мягких, жестких и жестких решений ПАК, соответственно. Ультразвук 8 мкл 200 нм красный флуоресцентный микросфер (возбуждение / выбросов из 580/605 нм) в течение 30 сек. Для каждого решения, добавить 8 мкл 200 нм красный флуоресцентный микросфер,1 мкл 10 мг / мл акриловой кислоты NHS эфира, 5 мкл 100 мг / мл персульфата аммония в и 2 мкл TEMED (таблица 2). Смешать с осторожно пипеткой и избежать образования пузырьков в растворах.

ПАК
(1 мл) 		40%
А.А.
(Мкл) 		2%
BIS
(Мкл) 		Ultrapure
Вода
(Мкл) 		1 мг / мл
FN
(Мкл)
Микро-сферы
(Мкл) 		10 мг / мл
NHS эфир
(Мкл) 		100 мг / мл
APS
(Мкл)
TEMED
(Мкл) 		Эластичный
Модуль
(Па)
Мягкий 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Жесткий 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Жесткий 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Таблица 2:. Объемы ингредиента и в результате упругих модулей для мягких, жестких и твердых ЧУК, используемых в Тяговое усилие анализов AA = акриламид, FN = фибронектин, APS = персульфат аммония.

  1. Пипетировать 8,48 мкл раствора ПАА на центр каждого микролунку.
    Примечание: Этот объем теоретически дает ПАК 75 мкм в толщину.
  2. Осторожно опустите пылали сторону гоE 12 мм покровное на капли в микролунку с помощью пинцета.
  3. Разрешить зажатой решение ПАК для полимеризации в течение 15-30 мин. Проверьте полимеризации путем проверки остатки раствора.
  4. Добавить 2 мл 1x PBS в каждую чашку и удалить 12 мм покровные с помощью пинцета.
  5. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.

4. Подготовка контроллера ЭСУД на Invadopodia Анализы

  1. Нагреть раствор желатина (1% желатина и 1% сахарозы) до 37 ° С.
  2. Обработать Paas с 150 мкл раствора желатина в течение 1 мин, затем тщательно аспирата из нижней части лунки при проведении со стеклянным дном тарелки под углом 45 °.
  3. Сушат оставшийся тонкий слой желатина на ЧУК в лунки под крутым углом (60 ° или более), чтобы оптимизировать сушку в течение 60 мин.
  4. Обработать лунки с 2 мл охлажденного 0,5% раствора глутаральдегида на Iсе в течение 15 мин с последующим комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Вымойте лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  6. Обработать лунки с 2 мл раствора боргидрида натрия в течение 1 мин. Слегка постучите блюда на скамейке, чтобы удалить пузырьки, которые образуют на поверхности желатина.
  7. Отберите и мыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  8. Развести в FITC-меченого человеческого фибронектина в плазме решение 50 мкг / мл с 1x PBS и центрифуге при 175000 х г при 4 ° С в течение 15 мин. Либо приобрести имеющийся в продаже с надписью фибронектин или обозначить его следующим образом:
    1. Растворите 5 мг фибронектина в 10 мл боратного буфера (тетрагидратом метабората 170 мм натрия и 40 мМ NaCl) и место в диализной трубке.
    2. Этикетка фибронектин, поместив трубку в 200 мл боратного буфера, содержащего 6 мг растворенного FITC при комнатной температуре с помощью магнитной мешалкиустановлен на минимальное значение в течение 1,5 ч в темноте.
    3. Диализировать с 500 мл 1x PBS с помощью магнитной мешалки, установленной на самом низком уровне в течение 3 дней в темном холодном помещении (4 ° С) с двумя тома меняет день.
    4. Рассчитать FITC-меченного концентрации фибронектина на основе оптической плотности разбавленных аликвоты (1: 200) на длине волны 280 нм и 493 нм в качестве [OD 280 - (0,36 х OD 493)] / 1,4 раза коэффициент разбавления в 200 раз 2 (на долю которого приходится для концентрирования глицерина фибронектин на следующей стадии), в результате чего мг / мл единиц.
    5. Диализировать в течение ночи в 50% -ном растворе глицерина с помощью магнитной мешалки, установленной на самом низком уровне в течение ночи в темном холодном помещении при 4 ° С.)
  9. Обработать лунки с 150 мкл FITC-меченного фибронектина растворе при комнатной температуре в течение 60 мин в темноте.
  10. Тщательно аспирата FITC-меченного фибронектина решение от нижней части лунки при проведении стеклянным дном блюда вугол 45 °, а затем заполнить стеклянным дном блюда с 70% -ным раствором этанола при комнатной температуре в течение 10 мин в темном капот культуре клеток для стерилизации. Также заполнить стеклянным дном тарелки крышки или протрите низких салфеток нибудь вкусненькое, пропитанные 70% этанола.
  11. Вымойте со стеклянным дном блюда, заполняя их с 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза с 2 мл 1x PBS в общей сложности 15 мин.

5. Подготовка и обработка изображений в Invadopodia Анализы

  1. Добавить 25000 раковых клеток в 2 мл среды invadopodia (1: 1 DMEM и RPMI 1640 с 5% сыворотки с низким содержанием белка, 10% фетальной бычьей сыворотки и 20 нг / мл свеже добавленной эпидермального фактора роста) к стеклянным дном посуды и инкубировать в течение ночи.
  2. Аспирируйте и лечения лунки с 2 мл 3,7% раствора параформальдегида при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин, чтобы зафиксировать клетки.
  3. После двух быстрых промывок 2 мл 1x PBS, относиться к лунки с 2 мл 0,1% Тритон Х-100 в растворе при комнатной Tempeратура в темноте в течение 5 мин до клетки проницаемыми.
  4. После одной промывки быстрого 2 мл 1x PBS, относиться к лунки с блокирования 3% бычьего сывороточного альбумина раствор при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин, чтобы блокировать клетки.
  5. Инкубируйте лунки с 150 мкл мышиного анти-cortactin антитела (1: 750) в блокирующем растворе при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин.
  6. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  7. Инкубируйте лунки со 150 мкл козьего антитела против мышиных антител 633 (1: 500) и 546 фаллоидином (1: 750) в блокирующем растворе при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин.
  8. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  9. Добавьте шесть капель монтажа среды, чтобы заполнить каждый микролуночные и накрыть 22 х 22 покровные.
  10. Cortactin изображений и актина, чтобы определить invadopodia с помощью возбуждения и эмиссии фильтры 632/647 нм и556/570 нм, соответственно, с использованием масляной иммерсии объектив высокой числовой апертурой, 40X на широкого поля инвертированного микроскопа. Кроме того, изображение фибронектин, чтобы определить деградации ECM с помощью возбуждения и испускания фильтр 492/518 нм.

6. Подготовка и обработка изображений силы тяги Анализы

  1. Добавить 15000 раковых клеток в 2 мл среды invadopodia к стеклянным дном посуды и инкубировать в течение ночи.
  2. Аспирируйте среды в стеклянным дном посуды и заменить 2 мл L-15 среды с аналогичными добавками (5% сыворотки с низким содержанием белка, 10% фетальной бычьей сыворотки и 20 нг / мл свеже добавленной эпидермального фактора роста), предварительно -warmed до 37 ° С.
  3. Выдержите стеклянным дном блюда в климатическую камеру на инвертированный микроскоп, предварительно уравновешенную 37 ° C с высокой влажностью в течение 1 часа.
  4. Возьмите четыре наборов изображений с использованием высокой Н.А., 40X объектив на широкоугольный поле инвертированного микроскопа с автоматизированной стадии, чтобы отметить сотовой позиции:
    1. Клетки изображение на кР ЧУК с использованием фазового контраста ("фаза" изображения).
    2. Изображение флуоресцентные микросферы с помощью возбуждения и излучения фильтров 560/645 нм не фокусировки слегка под клеток пока первый слой микросфер в верхней части ЧУК входит в центр ("подчеркнуто" изображение).
    3. Кроме того, фокус на нижней части ЧУК (с использованием микросфер в качестве маркеров) и принимают изображение ("нижний" изображение). Примечание: Цель этого образа для записи Z-позицию, чтобы получить фактическую толщину ПАК в каждом положении для расчетов сила тяги, как описано в представительных результатов.
    4. После того как эти изображения были приобретены в нескольких положениях, осторожно перемешать в 220 мкл 10% Triton-X раствором, чтобы удалить клетки. Микросферы изображение в верхней части ЧУК в каждом положении, как описано выше ("нулевой" изображения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В invadopodia анализа, invadopodia, как правило, определены колокализации маркеров, таких как актина и cortactin на точечных структур в теле клетки (рисунок 1). Оба активно деградирует и не унижающие invadopodia можно подсчитать и дифференцируются в зависимости от того, эти структуры локализуются с черными районах, где отсутствует флуоресцентный сигнал в FITC-меченого фибронектина (рис 1). Invadopodia вручную пересчитать, и деградация ECM в клетки определяется вручную пороговой эти черные области в пределах контуров клеток.

В тяговое усилие анализа, четыре изображения передаются при каждом клеточном расположение отмечено положение ступени (рис 2). Во-первых, "фаза" и "подчеркнуть," изображения взяты из всех клеток, представляющих интерес. "Дно" образ ПАК также принимается в каждом положении для того, чтобы рассчитать толщину гидрогеля. После удаления Тон клеток, "нулевой" Изображение взято на каждом обозначенном месте на сцене. Деформации в ЧУК рассчитываются на основе изменения в микросфер позиций между "подчеркнул, что" и "NULL" изображений. Эти смещения и механические свойства ЧУК (Е и принятой за 0,5 коэффициента Пуассона) затем используется для расчета тяговых усилий (рис 2). Существует несколько различных методов расчета тяговых усилий 24 на основе какой-то композиции раствора Буссинеска для бесконечной упругого полупространства 25. Хотя детали этих анализов выходит за рамки этого текста, мы лицензионное программное обеспечение LIBTRC от Мика Дембо в Бостонском университете, который использует описанный ранее метод для расчета тяговых сил 26. Это особенно вычислительный метод компенсирует конечной толщины в своих расчетах, которые требует толщину ЧУК в каждом положении, которое вычисляется на основе диfference в Z-позиции, "ударяется" и "низ" изображений. Многие исследовательские группы имеют аналогичные компьютерные пакеты доступны или решили написать свои собственные программы. Кроме того, существуют другие методы расчета тяговых усилий на основе различных математических подходов 24.

Рисунок 1
Рисунок 1: invadopodia анализ может быть использован для идентификации invadopodia и связанного с деградацией ECM флуоресценции Пример широкого поля изображения invadopodia в SCC-61 (головы и шеи плоскоклеточный рак) клетки на жестком ПАА с 1% желатина и FITC-. помечены фибронектин. Invadopodia, как правило, определены колокализации двух маркеров, таких как актина и cortactin (красный и синий в накладываемого изображения, соответственно). Invadopodia может быть количественно и как активно унижающих достоинство видов (локализуется с черными районах не хватаетсиг- нала FITC, как обозначено желтыми стрелками) и не деградацию (обозначается белыми стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2: тяговое усилие анализ может быть использован для определения клеточных тяговых сил, возникающих при актинового цитоскелета, отслеживая перемещение встроенных микросфер в ЧУК Пример фазы и флуоресцентные изображения с широким полем SCC-61 клетки на жестком ПАК (. "фаза"), а микросферы непосредственно под ячейку на верхней поверхности ПАА ("подчеркнул, что"). Изображение в нижней части ПАА также могут быть приняты, чтобы затем рассчитать свою локальную толщину ("дна"). После клеток удаляется, изображение вновь принимать во внимание микросферыс на верхней поверхности ПАА ("NULL"). Микросфер позиции между "подчеркнул, что" и "нулевые" изображения могут быть отслежены с получением "поля смещений." Микросфер перемещения и ПАА механические свойства могут быть использованы для расчета "векторное поле тяги." Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию из этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем способ изготовления PaaS, которые могут быть использованы в качестве основы для invadopodia и тяговое усилие анализов коррелируют с инвазивными и сократительные сотовой поведения. В то время как ЧУК уже давно привык смотреть на жесткость воздействия на клетки и рассчитать тяговые силы 18,24,27, этот протокол является первым для разработки параллельных анализов, основанных на ЧУК с теми же жесткости соотнести инвазивных и сократительные сотовой поведения в ответ на матрице механические свойства. Правильно активации покровные из стеклянным дном посуды гарантирует, что ЧУК будет связываться с ними, а не оторваться. В то время как мы и другие опирались на реагентами, такими как сульфо-SANPAH и акриловой кислоты NHS эфира связывать желатин к поверхности ЧУК в прошлом 4,12,28, мы обнаружили, что эти методы не производит однородные надежно поверхностные слои фибронектина , Таким образом, фибронектин был встроен и сшитые в течение всего ЧУК с использованием акриловой кислоты NHS сложный эфир, как выполняетсядругими группами 29,30. Тем не менее, повышение концентрации фибронектина были необходимы для того, чтобы, получая такую ​​же плотность лиганда на поверхности мягких, жестких и твердых ЧУК 5. Кроме того, включение фибронектина (но не микросфер) уменьшается на механические свойства мягких, жестких и твердых ЧУК от 1071, 9299 и 28283 Па 4 1023, 7307 и 22692 Па 5, соответственно. Тем не менее, эти уменьшенные упругие значения модулей еще охватывает диапазон нормальных, так и раковых тканях 23. Хранение модулей ЧУК можно легко измерить с помощью реометрии и преобразуется в модули упругости 1,4.

В то время как протокол прямо вперед, опускания и удаления 12 мм покровные являются наиболее трудные шаги и требуют практики. Самой большой проблемой при опускании покровного стекла является обеспечение ПАК решение распространяется равномерно, без каких-либо пузырьков или брызг. Удаление покровное требуеттвердая рука, чтобы не повредить 12 мм покровное стекло снизу 14 мм покровное, или ПАП. Мы постарались гидрофобных покрытий на 12 мм покровным, чтобы помочь в удалении, но обнаружили, что ЧУК остаются с узорами в их поверхностей. Использование тоненького кончика и тонкого, пинцеты весло стиля для снижения и устранения 12 мм покровные, соответственно, настоятельно рекомендуется. Кроме того, количество света, используются для изображения клетки должны быть сведены к минимуму, так как некоторые типы клеток чувствительны к концентрированной света на микроскопе. Кроме того, L-15 среду использовали для тягового усилия анализов, так как наша экологическая палата по нашей микроскопом не оборудован для CO 2. В то время как те же самые добавки были использованы в средствах массовой информации для invadopodia и тяговое усилие анализов в попытке сохранить условиях же, DMEM, RPMI 1640, и может быть использован вместо L-15, если уровень СО 2 можно управлять.

В то время как объем ПАК решения была выбрана, чтобы теоретически уIELD гели с толщиной 75 мкм, их толщина, как правило, варьируются между 30-60 мкм. Тем не менее, этот диапазон значительно выше значения, при котором клетки могут ощутить лежащую в основе жесткость покровные стекла нижних блюд 31. Кроме того, толщина слоя ЕСМ используется для обнаружения деградации (желатин и FITC-меченый фибронектин накладывается на в ЧУК) уже сообщалось ранее в приблизительно 1 мкм по толщине 12; Таким образом, этот тонкий слой не защищает клетки от жесткости в ЧУК. Тем не менее, твердый мусор, трещины и другие деформации либо в ЧУК и / или ECM слоя может повлиять на отдельные клеточные инвазивных и сократительные свойства. Эти проблемы могут быть вызваны нечистыми 12 мм покровные, которые вводят мусора в гидрогелей, чрезмерное высушивание гелей и / или желатин, и неполный аспирации боргидрида натри, который может оставить пузырьки, которые деформируют ECM слой. Таким образом, необходимо позаботиться при выборе CEзаполняет для визуализации для того, чтобы они не слишком зависит от местных нарушений в поверхности образцов.

Относительно высокие концентрации фибронектина как в ЧУК (смешанный, по меньшей 200-230 мкг / мл) и ECM слоя (накладывается на желатине при 50 мкг / мл) были использованы; Тем не менее, фактические концентрации по обе поверхности не были непосредственно измерены. В то время как каждая поверхность по-видимому, насыщают фибронектина, неясно, клетки испытывают ли одни и те же точные плотности лиганда между двумя анализов. Для силовых анализов тяговых, 200 нм микросфер в разведении 1: 125, оказались оптимальным для визуализации. Тем не менее, это довольно часто, чтобы найти других групп с использованием микросфер различного диаметра или разведений. В этой системе, мелкие микросферы отображается броуновское движение внутри ЧУК, а более крупные микросферы причиной трещин и деформации. Эти наблюдения, скорее всего, из-за физических свойств ЧУК (т.е.

В целом, многие из этих экспериментальных факторов может быть скорректирована в зависимости от требований пользователя, такие как ЧУК с различными механическими свойствами, раковые клетки с различной инвазивных и сократительные свойства, и микроскопии систем с другими возможностями визуализации. Соотношение акриламида: БИС можно варьировать для получения Paas с аналогичным или различными модулями упругости и сшивающего 27. Чувствительность Тяговое усилие анализов могут быть скорректированы с учетом различных уровней сотовой силовых путем изменения жесткости и / или микросфер dilutиона. Различные флуорофоры также могут быть выбраны для иммунофлюоресценции и фибронектина маркировки на основе спецификаций микроскопом. В то время как FITC делает отбеливатель, он довольно яркий деградация решений ECM легко идентифицировать. Однако, флуоресценция визуализации invadopodia и малых микросфер, как правило, требует высоких целей НС за оптимальное разрешение. Кроме того, оба анализы могут быть выполнены на покровные стекла в луночных планшетах. Тем не менее, со стеклянным дном блюда намного легче подготовить и использовать в течение экспериментального процесса. В дальнейшем, сочетание этих анализов в один позволит непосредственной визуализации как деградации ECM и генерации сотовой силы. Тем не менее, некоторые технические проблемы будут возникать в том числе живого изображения клеток для invadopodia и MicroBead перемещений, усилению клеточной воздействию света, отбеливание фибронектина FITC, и будет ли тяговые усилия полностью трансдуцировали через флуоресцентно-меченного и сшитого ECM слоя к ПАК поверхностей ,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эта работа была поддержана Национальным институтом рака Национального института здоровья в рамках премии номер K25CA143412 (Parekh). Мы хотели бы признать, что дополнительная поддержка была оказана кафедры отоларингологии. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Acknowledgments

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Tags

Медицина выпуск 95 invadopodia тяговое усилие деградация сократимость жесткость полиакриламид
Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerrell, R. J., Parekh, A.… More

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter