Механическая жесткость в опухоли микроокружения играет решающую роль в стимулировании злокачественной поведение, увеличивая invadopodia деятельность и актомиозин сократимость. Использование гелей полиакриламида (ЧУК), invadopodia и тяговое усилие анализы могут быть использованы для изучения инвазивных и сократительные свойства раковых клеток в ответ на матрицу жесткости.
Жесткие ткани опухоли были сильно вовлечены в регулирование миграции раковых клеток и вторжения. Инвазивные миграции через сшитых тканей способствует актин-богатых выступов, называемых invadopodia, что протеолитически ухудшают внеклеточный матрикс (ВКМ). Invadopodia деятельность было показано, что в зависимости от жесткости ECM и сократительных клеток рака сил, предполагая, что жесткость сигналы могут регулировать эти субклеточные структуры, посредством актомиозинового сократительной. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. В то время как некоторые различия между двумя анализов существуют, протокол, представленные здесь относится к способу создания Paas йна может быть использован в обоих анализах и легко адаптируются к конкретным биологических и технических потребностей пользователя.
Жесткость опухолеассоциированному ECM была определена в качестве важного фактора в движении злокачественной поведение, увеличивая актомиозина сократимость 1-3. В то время как этот эффект, прежде всего, было продемонстрировано с клетками рака молочной железы, матрица жесткости было обнаружено, чтобы изменить свойства инвазивных клеток, полученных из различных видов рака 4-8 предположить, что жесткость опухоли может играть роль в других типов рака. Чтобы проникнуть сшитых тканей при инвазивной миграции, раковые клетки используют актин-богатых клейкие выступы, известные как invadopodia, что локализовать протеиназ в очаговым ухудшить ECM 9. Invadopodia рассматриваются признаком инвазивных клеток и участвуют в инвазии клеток опухоли и метастазов 10,11. Предыдущая работа показала, что матрица жесткости может регулировать число invadopodia и связанные с деградацией ECM 4,12 через миозина II деятельности и механочувствительных белков 12. УчитываяКорреляция между плотностью опухоли и рак агрессивности 13,14, эти результаты показывают, механизм, с помощью которого раковые клетки могут реагировать на жестких тканей опухоли для управления инвазию и метастазирование через актомиозинового сократимости.
В пробирке ECM жесткости и в естественных плотности ткани, как было показано, чтобы регулировать инвазивной поведение раковых клеток 1,15-17. В то время как актомиозин сократимость представляется важным в этом процессе, в настоящее время исследования конфликтов, чтобы метастатического потенциала коррелирует ли увеличение или уменьшение сократительной силы 6,18-20. Кроме того, остается неизвестным, являются ли эти силы непосредственно посредником invadopodia деятельность 21. Мы недавно обнаружили, что клетки рака сократительные силы зависят от матрицы жесткости и были прогнозирования деградации ЕСМ invadopodia 5. Эти результаты показывают, что сотовые силы могут играть важную роль в прогрессировании рака по посреднические invadopodia переменного токательность в ответ на механические свойства микроокружения опухоли.
Для того, чтобы соотнести инвазивных и сократительные свойства раковых клеток 5, мы изменили протокол для создания PaaS с различной жесткостью, который ранее использовался для исследования жесткости в зависимости от invadopodia деятельность 4,12,22. К химическим сшиванием человеческого фибронектина в плазме в течение всего ЧУК эти модифицированные гидрогели могут быть использованы в качестве основы для обоих invadopodia и тяговое усилие анализов, чтобы гарантировать, что клетки испытывали те же жесткость в обоих экспериментах 5. В invadopodia анализов, фибронектин обеспечивает естественный связывающий домен желатина, чтобы связать наложенное ЕСМ в ЧУК, чтобы обнаружить деградации матрицы. В силу тяги анализов, фибронектин обеспечивает лиганд для прямого клеточной адгезии, чтобы обнаружить микросфер смещения, используемые для расчета сотовой тяговые силы. Этот метод приводит к тому, что мы назвали мягкий, твердый,и жесткие ЧУК, которые связаны с стеклянным дном посуды и имеют модули упругости Е, из 1023, 7307 и 22692 Па 5, которые охватывают диапазон механических свойств, представленных за нормальными и раковыми тканями 23.
Мы представляем способ изготовления PaaS, которые могут быть использованы в качестве основы для invadopodia и тяговое усилие анализов коррелируют с инвазивными и сократительные сотовой поведения. В то время как ЧУК уже давно привык смотреть на жесткость воздействия на клетки и рассчитать тя?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы не имеют ничего раскрывать.
3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1X PBS |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use six drops to fill microwells |
BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 °C |
Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1X PBS to 0.5% |
goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10X PBS stock |
mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10X PBS stock |
NaCl | RPI | S23020 | use to make 10X PBS stock and borate buffer |
NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS |
sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining |