Introduction
Geschat wordt dat de helft van de Amerikaanse bevolking ervaart een fractuur door de leeftijd van 65 1. Voor die patiënten met fracturen behandeld chirurgisch, 500.000 procedures gepaard met het gebruik van een bottransplantatie 2 en dit aantal zal naar verwachting stijgen met de toenemende vergrijzing 3 . Hoewel bot is een van de weinige organen die het vermogen volledig genezen zonder littekens heeft, zijn er gevallen waarin het mislukt 3,4. Afhankelijk van de omstandigheden en de kwaliteit van de behandeling, 2-30% van de lange botbreuken mislukken, wat resulteert in niet-union 3,5. Hoewel er enige discussie over de definitie, pseudoartrose, kritisch-sized of non-union verwondingen bot blijft over het algemeen verwijst naar een blessure die niet geneest over de natuurlijke levensduur van het onderwerp 6. Voor experimentele doeleinden wordt de looptijd verkort tot de gemiddelde tijd vereist voor volledige genezing van een middelgroot botletsel. Non-union botlaesies optreden voor numerous redenen, maar de belangrijkste factoren zijn onder extreme trauma resulteert in een kritisch-sized gat, infectie, slechte angiogenese, het gebruik van tabak, of geremd osteoregenerative capaciteit als gevolg van ziekte of leeftijd 7. Hoewel non-unions succesvol behandeld kan kosten dan $ 60.000 per procedure, afhankelijk van het type van verwonding en de benaderingen toegepast 8.
In matige gevallen wordt autologe bottransplantatie tewerkgesteld. Deze strategie omvat herstel van bot van een donor plaats en implantatie op de plaats van verwonding. Deze aanpak is bijzonder effectief, de hoeveelheid beschikbare donor afgeleide bot is beperkt en de procedure omvat een nieuwe ingreep, waardoor aanhoudende pijn bij veel patiënten 9,10. Bovendien is de effectiviteit van de autoloog bottransplantaat is afhankelijk van de gezondheid van de patiënt. Botsubstituten gemaakt van synthetische materialen of verwerkt cadaveric bot zijn overvloedig beschikbaar 11-13, maar ze have belangrijke beperkingen, met inbegrip van slechte gastheer-cel adhesie eigenschappen, verminderd osteoconductiviteit, en de kans op afstoting 14. Er is dan ook dringend behoefte aan regeneratie van bot technologieën die veilig, effectief en op grote schaal beschikbaar zijn.
Ons vermogen om bot regeneratieve strategieën verbeteren kritisch afhankelijk van het vermogen om serieuze bot trauma nabootsen proefdieren, maar de vorming en stabilisatie van grote botletsels is technisch uitdagend. In de meeste gevallen wordt ernstig lange bot trauma experimenteel nagebootst door de oprichting van een defect dat van nature niet zal genezen. Hoewel het kan variëren met soorten 15, dit wordt bereikt door volledige verwijdering van een bot segment die groter is dan 1,5 maal de diameter van het bot doorsnede 16. Het bot wordt vervolgens gestabiliseerd met een metalen implantaat juiste oriëntatie van de breuk randen bewaren en de mobiliteit. Door hun kleine formaat en de kwetsbaarheid vanhun lange botten, oprichting van dergelijke letsels bij muizen zijn dan de mogelijkheden van de meeste onderzoeksgroepen. Als zodanig zijn lange botdefecten modellen beperkt tot ratten en grotere dieren. Toch muizen veroorloven belangrijk onderzoek voordelen in dat ze genetisch kunnen worden gemodificeerd en gefokt als immuun-gecompromitteerde stammen die geen menselijke cellen en weefsels niet in geloven.
Voor menselijke cel-gebaseerde applicaties, immuun-gecompromitteerde muizen zijn aantrekkelijk om mee te werken, omdat ze fysiologisch goed gekarakteriseerd, gemakkelijk te huis, kosteneffectief en eenvoudig geanalyseerd radiologisch en histologisch. Van groot belang is dat immuun-gecompromitteerde muizen geen cellen van verschillende soorten, waaronder de mens wijzen. Hun kleine formaat maakt ook het testen van zeer kleine aantallen cellen of volumes van experimentele steigers in orthopedische toepassingen. Verscheidene muizen orthopedische modellen gemeld dat verschillende mate been stabiliteit 17,18 veroorloven. Die systems die resulteren in zeer hoge stabiliteit, zoals externe fixators en sluitplaten voornamelijk genezend intramembraneuze ossificatie hoewel endochondrale genezing is gemeld 19. Daarentegen, die een aantal micro- en / of macro-beweging, zoals gebruik losgemaakt of gedeeltelijk vaste medullaire kunnen toestaan algemeen genezen met een overwicht van endochondrale ossificatie 20,21. Vertraagd unie of non-union defecten van lange botten zijn bijzonder moeilijk te bereiken bij muizen te wijten aan de extra niveau van stabilisatie nodig. Echter, een aantal benaderingen waargenomen, inclusief medullaire kunnen met elkaar verbindende spijkers, sluitplaten en externe fixators 22. Deze systemen over het algemeen goed te werken, maar gezien hun ingewikkelde ontwerp kunnen ze technisch uitdagend te installeren zijn. Bijvoorbeeld, Garcia et al. 23 bedacht elegante interlocking pin voor gebruik in muizen, maar de procedure omvat incisies op twee aparte sites en uitgebreide modificatie van de femur de pennen passen. Deze procedures werden uitgevoerd onder een dissectie microscoop.
Hierin beschrijven we een eenvoudige femorale medullaire pen met een centrale kraag ontworpen om sluiting van een 3 mm tekort bot voorkomen en ook toespitsen op het oorspronkelijke randen van het defect. Terwijl de pen is niet bevestigd aan het bot zelf, nauwkeurige dimensionering van de pendiameter en ruimen van de mergholte resultaten voldoende interferentie torsie- beweging (figuur 1) te verminderen. Met een zorgvuldige selectie van ingeteelde leeftijd, geslacht en stam afgestemd muizen, het resultaat is een zeer reproduceerbare hypertrofische niet- uniondefect 22 die gemakkelijk radiologisch kunnen worden geëvalueerd. Bovendien gebieden die van belang kan reproduceerbaar worden bepaald na micro-computertomografie (μCT) voor het meten van de novo botvorming en histomorfologische parameters. De pennen werden prototyped in ons laboratorium met behulp van gemakkelijk beschikbare hulpmiddelen.
Figuur 1: Experimentele principe Schematische samenvatting van het segmentaal defect model.. De centrale 3 mm segment van 9-10 mm muis femur chirurgisch uitgesneden (links). Een 3 mm lang, 19 gauge chirurgisch stalen buis wordt over een 9 mm lang, 22 G roestvrijstalen buis Gelijmde precies in het midden (rechts). De resulterende pen wordt aangebracht in de medullaire kanalen van de resterende proximale en distale delen van het femur met 19 G kraag vervangen van 3 mm segment been (hierna, midden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Dit protocol is bedoeld voor vrouwelijk naakt (Nu / J) muizen (18-25 g, 6 weken) overgenomen van Jackson Laboratories. Sinds stammen van muizen enigszins variëren in termen van de anatomie en de groeisnelheid, adviseren wij dat de fabricage van de pinnen is geoptimaliseerd om de stam, geslacht en leeftijd van de ontvangers voorafgaand aan implantatie in live-onderwerpen. Als de stammen zorgvuldig zijn afgestemd, de passing tussen de pen en de mergholte is zeer reproduceerbaar. Procedures voor huisvesting, voeding en algemene veehouderij vallen buiten het bestek van dit protocol, maar alle muizen werden gehuisvest in overeenstemming met de door de Institutional Animal Care en stel Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (8 e editie) en institutionele beleid Gebruik Comité (IACUC) en de Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde (DCM) bij Scott en White Ziekenhuis.
1. Fabrication van Pins
- Snijd een 9 mm lengte van 22 G roestvrij onderhuidse slangen, en een 3 mm lengte van 19 G buizen met behulp van een 23,8 mm diameter glasvezel versterkte zware cut-off wiel gemonteerd op een draaiend gereedschap. Gebruik kleine-fijne getipt tang om de slang (Figuur 2A, hierboven) immobiliseren. Draag geschikte oogbescherming en handvat draaiend gereedschap met zorg.
- Plaats een kleine hoeveelheid (ongeveer 10 pl) van cyanoacrylaat lijm naar het midden van de 9 mm as. Leid de 3 mm kraag via 9 mm as tot in het midden en draai de lijm tussen de kraag en de schacht verdelen. Meet afmetingen met een paar digitale schuifmaat en vergelijk figuur 1. Laat gedurende 15 uur (figuur 2A centrum) instellen.
- Gebruik een 220 grit-Emery geïmpregneerde schijf om bramen en overtollige lijm te verwijderen.
- Met behulp van de roterende gereedschap, polijst de pin met behulp van een vilten polijstschijf.
- Spoelen met gedemineraliseerd water en droog met compressed lucht.
- Betrouwbaarheidstoetsing door het plaatsen van een 19 G onderhuidse stompe naald over de as van de nieuw gemaakte pin en duw tegen de kraag. Zorg ervoor dat de kraag ongeveer 25 g van het gewicht kan weerstaan.
- Spoel de pen steriel gefiltreerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (Figuur 2B, boven). Zorg ervoor dat de as van de pen past precies in de femorale mergholte met de kraag tegen de randen van de snede bot (figuur 2C). Prototype verschillende configuraties voor de specifieke doeleinden van de studie en de ontvanger (figuur 2D). Zorg ervoor dat de uiteinden van de pen dringen in het trabeculaire bot van de diafyse om fixatie te maximaliseren en betere passing (figuur 2E).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de pasvorm is getest op het bot exemplaren vóór implantatie in levende muizen (bijvoorbeeld figuur 2C). - Gebruik een diameter van 4 mm punch-biopsie snijder om een cilinder te snijdeneen 5 mm dikke plaat chirurgische gelatine spons. Gebruik een scalpel om de cilinder 3 mm lengte knippen en langs een 20 G injectienaald langs de lengte van de cilinder een opening (Figuur 2A, hieronder) genereren.
OPMERKING: Wij hebben gevonden dat de positionering van een gelatine of collageen steiger op de plaats van het defect bevordert celretentie en induceert lengtegroei langs de as van het bot. - Leid de gelatineschuim cilinder via pin en lijn met de kraag (figuur 2B, midden) en autoclaaf op een droogcyclus bij 120 ° C bij 15 psi. De gelatine schuim zal opdrogen en donkerder van kleur (figuur 2B, hieronder).
2. Chirurgische Techniek
OPMERKING: De volgende procedure is geschreven observeren van alle door de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (8 e editie) in te stellen richtlijnen. Neem alle aanvullende verzekeringendoor de lokale IACUC stellen en zorgen voor een IACUC-goedgekeurde gebruik dier protocol (of gelijkwaardig) is op zijn plaats voordat u doorgaat met de volgende paragrafen.
Figuur 3: Chirurgische instrumenten. (A) chirurgische kit. Micro-boor (1), het snijden wiel (2), resorbeerbaar garen (3), buitenste hechtdraad (4), scalpelmesjes (5), scalpel handvat (6), steriele medullaire pennen verpakt in folie (7), medullaire dieptemeter maakte vorm onderhuidse buis (8), fijne nosed tang (9), rat-tanden tang (10), stompe ruimen naalden (11), naald drivers (12), kleine arterieklem (13), fijne schaar (14), periostale elevator (15), gemodificeerd Kern forceps (16) (B). wijzigingen moeten Kern-style been grepen produceren muizen.
- Selecteer een chirurgische ingreep kamer of schoon laboratorium met een afsluitbare deur en geen doorgaand verkeer. Ontsmetten van een geschikte werk surface met een klinische kwaliteit quaternaire-gebaseerde desinfecterende reiniger.
- Tijdens het dragen van disposable steriele handschoenen en een mantel, het opzetten van een steriel gebied van ongeveer 60 x 90 cm 2 op het gesaneerde werkblad met geautoclaveerd doek gordijnen.
OPMERKING: Het is raadzaam om een assistent verwijder de buitenste verpakking en presenteren van de steriele materialen om de onderzoeker het opzetten van het veld. - Plaats een gesaneerde verwarming pad gemonteerd op een warm water re-circulatiepomp op het laken en dek af met steriele disposable gordijnen. Verwarm een kraal sterilisator op bedrijfstemperatuur (250-265 ° C, dit duurt maximaal 30 minuten).
- Op het steriele veld, schik de chirurgische kit (figuur 3A) om gemakkelijke toegang tot alle componenten. Ook bieden steriel gaasje (2 x 2 cm 2), steriele wattenstaafjes, een steriele stalen kom (500 ml) met steriele zoutoplossing (0,9% g / v) en chloorhexidine / isopropylalcohol chirurgisch ontsmettingsmiddel applicators.
- Monteer een kleinedier verdoving unit naast het steriele veld met een inductie kamer en neus-kegelassemblage volgens de veterinaire begeleiding en de gebruikershandleiding. Gebruik klinische kwaliteit zuurstof als de gastoevoer en isofluraan, USP.
Figuur 4: Chirurgische procedure. (AC) Aanpak en de blootstelling van het dijbeen. (DE) Elevation en snijwonden. (FK) Ruimen en dimensionering van medullaire grachten.
Figuur 5: Chirurgische procedure. (AB) Installatie van de pin. (CD) sluiting. (E) Typisch beeld van de juiste positie pen 24 uur na de operatie.
- Plaats een muis in de inductie kamer van de anesthesie-systeem en set de uitgang 2 Lmin -1 O 2 en isofluraan concentratie 3% (v / v).
- Controleer of de muis is bewusteloos binnen 1 min; de concentratie te verhogen tot 4% (v / v) indien nodig. Verwijder de muis, plaats op steriele veld met de verwarming pad eronder geplaatst en de neuskegel van toepassing. Transportstroming de conus en reduceren de isofluraan tot 2,5%, wacht nog 20 seconden en testen adequate chirurgische vliegtuig in overeenstemming met de institutionele politiek. Typisch ontbreken van een achterpoot reflex als zacht geperst voldoende voor het bepalen adequate anesthesie.
- Gedurende het hele proces, hebben een assistent-monitor voor een sterke regelmatige ademhaling en de roze kleur van de extremiteiten en mond regio om een passend niveau van zuurstof tijdens het onbewuste te garanderen. Pas anesthesie volgens de veterinaire begeleiding en institutioneel beleid indien nodig. Breng steriele kunstmatige tranen glijmiddel zalf (15% (v / v) minerale olie, 83% (v / v) white petrolatum) aan de ogen.
- Draai de muis op één zijde met de achterste ledematen naar boven gericht op een nieuwe disposable laken. Verwijder indien nodig de vacht met een elektrisch scheerapparaat of ontharingscrème. Veeg de site met een steriele zoutoplossing en verwijder de extra laken met een overmaat bont. Plaats een nieuw doek met opening over de muis, zodat alle onderdelen, maar de hele achterste ledematen (figuur 4A) te dekken, maar uitzicht op het gezicht en de poot behouden om verkleuring en de ademhaling te controleren.
- Zoek de proximale en distale einden van het dijbeen en de huid incisie 5-10 mm langs de longitudinale as (Figuur 4B). Scheid de huidlaag van de fascia met een # 15 scalpel, het blootstellen van een laterale benadering van het dijbeen via de biceps femoris en de vastus lateralis. Lokaliseren waar de septa van beide spieren te voldoen (het is een lijn van witte weefsel tegen de roze kleur van de spier). Met een scalpel, zorgvuldig ontleden langs de intermusculaire grens totde femur zichtbaar (Figuur 4B).
- Ontwikkel de incisie met stompe periostale lift zodat de gehele diafyse (figuur 4C) blootstellen. Gebruik de lift naar de centrale tweederde verder bloot van het dijbeen, terwijl de zorg voor de achterste neurovasculaire bundel aan de mediale zijde (figuur 4D) te behouden. Voorzichtig schrapen zacht weefsel af van het bot met een scalpel, en droog met een steriel wattenstaafje of gelijkwaardig.
- Zoek het midden van het dijbeen met remklauwen indien nodig en merk met een steriel scalpel of marker, markeer 1,5 mm proximaal en distaal van het centrum. Zachtjes begrijpen het dijbeen met behulp van een paar fijne-nosed tang eerder gevormd in de Kern stijl om overmatige druk op het bot te voorkomen.
Let op: exacte afmetingen voor modificaties worden verschaft in Figuur 3B. Het is raadzaam om de tang te testen op een gedood monster vóór gebruik het bot garanderen niet breken onder druk vereisend immobilisatie tijdens het snijden. - Met behulp van een fijne boor voorzien van een fijne diamant korrel gecoate snijwiel (8 mm diameter x 0,1 mm breedte), maken de eerste snede met de lift in plaats om weefsel te beschermen hieronder (Figuur 4E). Het verhogen van de snede dijbeen tot 45 °, terwijl stevig vast te houden het uiteinde van de diafyse, maken de tweede snede, het verwijderen van een 3 mm segment.
LET OP: Het Gezicht van bescherming wordt aanbevolen in dit stadium. - Met het bot geïmmobiliseerd door een tang, zorgvuldig ruimen de medullaire holten van elk uiteinde met een stompe 23 G injectienaald. Met een pre diepte gauge uit een lengte van 22 G buis geplaatst in 19 G buis (figuur 3A i tem 8), beoordeelt de diepte van het geruimde medullaire holte verzekeren het 3 mm (Figuur 4F-K) . Als de mergholte weerstaat de 22 G dieptemeter, ruimen opnieuw met een botte 22 G injectienaald.
- Steek de medullaire pin in het proximale dan distale medullaire cavities de femur terug stabiel 3mm (Figuur 5A, B) brengen naar zijn oorspronkelijke lengte en stellen. Indien nodig, een kleine hoeveelheid handmatige stress een goede passing van de stang te verwezenlijken met het corticale bot van het dijbeen. Zorg ervoor dat de pin past precies in de medullaire holten van beide kanten en de randen van de snede bot zijn gelijk met de kraag. Als er een gat, ruimen wederom met een 22 G stompe naald.
- De positie van de spieren en perifere weefsels over de pen en sluit met een doorlopende absorbeerbare 5-0 hechtdraad (Figuur 5C). Nauw huid incisie met 5-7 vierkante knoop nylon 5-0 hechtingen en afdichting met chirurgische lijm (Figuur 5D).
3. Postoperatieve Procedures
- Na het sluiten van de incisie in de huid, trekken anesthesie, maar laat O 2 te blijven stromen totdat de muis begint te bewegen; Dit zou minder dan 1 minuut duren. Als de muis bewegingsloos blijft na 5 minO 2 administratie, zie institutionele beleid inzake veterinaire interventie.
- Wanneer de muis begint te bewegen, voorzichtig overbrengen naar een kooi die bij voorkeur droog, geautoclaveerd beddengoed.
- Een iglo-type nest in elke kooi en de muis zal terugtrekken in het, het verminderen van de beweging. Controleer of de muis herstelt achterste ledematen mobiliteit 5-10 min na herstel van het bewustzijn.
- Voer dagelijks postoperatieve bewaking in overeenstemming met de institutionele beleid. Bieden ontsloten hydratatie en eten op de vloer van de kooi voor de eerste 5-7 dagen en beheren analgesie en postoperatieve bewaking in overeenstemming met institutioneel goedgekeurd beleid.
OPMERKING: We toedienen 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfine 24 met 0,25 ml zoutoplossing subcutaan, tweemaal daags gedurende de eerste 3 dagen en daarna als de muis niet weer normaal nut.
- Na de eerste 24 uur van herstel, live-dier röntgenbeeldvorming under anesthesie aan pin plaatsing (Figuur 4E) te visualiseren. Als de pin wordt ontwricht, overwegen onmiddellijke herziening chirurgie.
- Op dag 7 na de operatie, verwijderen hechtingen onder narcose en huis in groepen in overeenstemming met de institutionele veeteelt beleid.
- Na 2-5 weken, humaan euthanaseren dieren in overeenstemming met de American Veterinary Medical Association goedgekeurde methoden voor euthanasie 25.
OPMERKING: Een intraperitoneale injectie van in de handel verkrijgbare barbituraat-combinatie euthanasie cocktail is effectief en humaan, maar de lokale institutionele beleid inzake euthanasie moet worden gevolgd. - Zorgvuldig ontleden weg de achterste ledematen door het blootstellen van het proximale dijbeen en het bekken van de mediale zijde. Druk voorzichtig op de gezamenlijke naar binnen vanaf de zijkant van de ledemaat, terwijl het losmaken van de heupkop uit de heupkom (de heupkom) met een scalpel. Snijd de resterende spieren en huid met een scherp scalpel of micro-schaar, het vrijgevenhet gehele onderdeel vormen het bekken. Met een scherp paar rongeurs of zware schaar, knip de onderste achterste ledematen (tibia / fibula) ongeveer 5 mm onder het kniegewricht.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat alle exemplaren worden opgeslagen op een identieke wijze voorafgaand aan de analyse. - Verwijder het vel, maar laat spier in zijn plaats. Bevestig het weefsel in 10% gebufferde formaline aangevuld met 10 mM CaCl2 fixatief 1 week, gevolgd door opslag in met fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met 10 mM CaCl2 tot 1 maand voor beeldvorming. Voer fixatie en opslag bij 4 ° C. Als alternatief, scannen exemplaren onmiddellijk zonder fixatie.
4. Analyse van Specimens
OPMERKING: Bone genezing kan worden beoordeeld door een breed scala van methodieken die buiten het bestek van dit protocol. Het volgende is een methode die we met succes hebben ingezet met behulp van een specimen microCT (μCT) imager. Het wordt aanbevolen dat de volgende parameters are getest in eerste instantie, dan is geoptimaliseerd voor de specifieke behoeften van het project.
- Wikkel model in een dunne laag plastic afdichting folie en plaats het verticaal in het instrument kamer. Zorg ervoor dat het dijbeen loodrecht op de monstertafel gedurende de hele scan. Stel de scan naar de volgende parameters; spanning = 29 kV, stroom = 661 uA, macht = 19 W, afbeelding pixelgrootte (micrometer) = 21.00; 360 graden rotatie = yes; lijst middeling = op (5); rotatie stap (deg) = 1.00, willekeurige beweging = op. Beelden opslaan als JPEG-bestanden in één doelmap per scan (bijv Figuur 6A).
OPMERKING: De scan moet volledig zijn in 57 min. - Gebruik de reconstructie software axiale afbeeldingen op basis van de volgende parameters te genereren; smoothing = op (4), foutieve uitlijning compensatie = op, ring artefact reductie = op (5), beam hardening correctie (40%), CS rotatie (deg) = 0.00. Stel output naar 2,000-15,000 Hounsfield eenheden. Beelden opslaan als JPEG-bestandenin één doelmap per scan.
- De axiale afbeeldingen en analysesoftware, definieert het gebied van belang (ROI) door eerst het proximale en distale randen van het oorspronkelijke defect. Dit te bereiken door het selecteren van de secties alleen de kraag omvatten. Omdat de kraag is dikker dan het medullaire pen, zijn deze secties gemakkelijk te definiëren (figuur 6B, links). Sluit de kraag uit berekeningen door trekken uitsluiting zone eromheen (met een marge van 100 urn) en overdracht van de zone van elk van de secties in het ROI (figuur 6B, rechts).
OPMERKING: Polaire traagheidsmomenten, 3D reconstructies en berekeningen zoals het volume van nieuw bot (Figuur 6C, D) gemakkelijk worden bereikt met behulp van de software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muizen meestal herstellen bewustzijn en achterbenen ledematen mobiliteit 5-10 minuten na de terugtrekking van de anesthesie. Gedurende de eerste 5 dagen, is het raadzaam om muizen afzonderlijk huis en voeren milieu verrijking overmatig gebruik van de ledemaat voorkomen. Voor dit doel, iglo-type nesten verminderen de noodzaak voor nestbouw en rusten te moedigen. We hebben ook waargenomen dat levering van voedsel en hydrogel op de vloer van de kooi vermindert de kans op pin verplaatsing. Gedurende de periode van 5 dagen, moet analgesie worden toegediend als vereist overeenkomstig institutioneel-goedgekeurde beleid. Gewichtsverlies tot ongeveer 15% van het oorspronkelijke pre-operatieve gewicht kan tijdens de 5-daagse postoperatieve periode. Vierentwintig uur na de operatie, worden röntgenstralen van het getroffen ledemaat aanbevolen pin-positie bepalen. De pennen moeten volledig worden ingebracht in de proximale en distale medullaire kanalen met de randen van het defect strak tegen de kraag (figuur 2C,2E, figuur 5E en figuur 6A). In zeldzame gevallen (<5% van de gevallen), kan kunnen raken ontwricht in vroege stadia van genezing en dierlijk gebruik protocollen te voorzien revisiechirurgie als dit gebeurt. Hoewel het technisch uitdagend om torsie beweging op muizen femurs kwantificeren, manuele palpatie van specimens bevestigd dat torsie en longitudinale beweging is marginaal na 7 dagen als bindweefsel zich ophoopt rond de pen. Na 5 dagen van postoperatieve monitoring, kunnen de muizen worden teruggebracht naar standaard gemeentelijke huisvesting als per institutioneel-goedgekeurde beleid.
Zonder therapeutische interventie, de randen van het defect typisch uitstrekken 0,5 mm gedurende 21 dagen, maar in zeldzame gevallen kunnen nieuwe botgroei tot 1 mm (figuur 6A) zijn. Botgroei arrestaties na deze periode de inflammatoire en anabole fasen regeneratie niet langer resulteert in een non-union defect. Na 14-21 dagen van genezing, het volume of de novo bot kan gemakkelijk worden bepaald door de axiale beelden gegenereerd door μCT scannen. Met de scanning, axiale reconstructie en ROI selectieprocedures in het protocol beschreven, het volume van nieuw bot gegenereerd met de tijd toeneemt, maar in het algemeen niet meer dan in totaal 1 mm3 in afwezigheid van therapeutische interventie (figuur 6C) vergeleken met 6- 7 mm 3 in een anatomisch equivalent gebied van niet gewonde dijbeen. Terwijl conventionele biomechanische testen technisch uitdaging omdat het monster omvang en aard van de fixatie methode, het polaire traagheidsmoment (PMI), een schatting van het vermogen van een materiaal om torsie weerstaan basis van dwarsdoorsnede en dichtheid is getoond om een geschikte schatting van kracht te vertegenwoordigen in de lange beenderen 26,27. Met deze methode kan axiale dwarsdoorsneden op verschillende afstanden van de laesie randen worden geselecteerd voor analyse. Na 21 dagen, de PMI van de novo bot 0,25 mm frOM de laesie randen varieert van tussen 0,05-0,35 mm 4 vergeleken met 0,02-0,08 mm 4 in het midden van de laesie verdere bevestiging van de aanwezigheid van non-union in onbehandelde gevallen (figuur 6D). De PMI van niet gewonde dijbeen bij een anatomisch gelijkwaardige locatie varieert meestal tussen de 0,5-0,7 mm 4 met behulp van de hier beschreven voorwaarden.
Figuur 6: Typische resultaten. (A) X-ray scans van dijbeen op dag 7, 14 en 21 na de operatie tonen beperkte ingroei van bot Paneel B:. Schematische weergave van de ROI parameters voor volumetrische meting bot. Representatieve axiale doorsnede met een verboden zone (EX) over de pin-kraag, waaronder een 100 micrometer marge om de meting van artefacten uit te sluiten bij de metal-weefsel interface (links). Volledige botscan (rechts, boven) waaruit de longitudinale ROI gedefinieerd door de gedeelten van het bot tussen de randen van de kraag met originele botweefsel uitgesloten (EX). De originele laesie randen bevinden zich in de axiale secties met het verschil tussen de diameter van de pen en de kraag (rechts onder). (C) Typische volumetrische metingen op dag 7, 14 en 21 na de operatie zonder therapeutische interventie (middelen met standaarddeviaties, n = 3). (D) PMI meting bij axiale secties 0.25 mm vanaf het proximale en distale laesie randen en middelpunt (middelen met standaarddeviaties, n = 3). (E) Masson-trichroom gekleurde paraffine-ingebedde gedeelte (links) uitgesneden in de lengterichting tonen been uitgroei bestaande uit kraakbeen (ca) en poreus bot (b) (schaalbalk = 0,5 mm). De positie van het veld wordt aangegeven op de X-ray scan (rechts). (F) Niet-decalcified, methyl methacrylaat ingebed coronale doorsnede van 1 dag oud defect gekleurd met hematoxyline en eosine (schaal bar = 1,0 mm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Ontkalking van de weefsels duurt meestal 10-14 dagen onder standaardomstandigheden, en wordt gemakkelijk gevolgd door röntgenaftasting. Het is raadzaam om wat spieren op de monsters te behouden tijdens het ontkalken om de stabiliteit tijdens de behandeling te verbeteren. Na ontkalking, kan pinnen voorzichtig worden verwijderd met een scherp scalpel toelaat inbedden in paraffine en histologie. Masson trichroomkleuring van longitudinale secties maakt visualisatie van enchondrale bot uitgroei met een leidende rand van kraakbeen (CA), gevolgd door poreus bot (ter) (figuur 6E). Terwijl sommige schade zal onvermijdelijk optreden tijdens dissectie, de histologische structuur van het boten bindweefsel blijft onduidelijk of de pen voorzichtig verwijderd. Alternatief kan methylmethacrylaat inbedding en snijden van niet-gedemineraliseerd secties uitgevoerd met de pen op zijn plaats (figuur 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin is een eenvoudige methode beschrijven we een kritisch-sized-pins gestabiliseerd defect van het muizen femur met standaard laboratorium en veterinaire apparatuur genereren. Terwijl de assemblage van de pennen en de chirurgische procedure zelf vereist oefening, het is ruim binnen de mogelijkheden van een goed opgeleide biomedisch onderzoek wetenschapper of dierenarts.
De pen wordt geplaatst in het medullaire kanaal zonder extra fixatie, waardoor de procedure technisch haalbaar dan ingewikkelder benaderingen die externe fixators of in elkaar grijpende schroeven gebruiken. Terwijl sommige torsie beweging kan optreden tijdens de vroege stadia van genezing, dit wordt geminimaliseerd door zorgvuldige aandacht voor de pin diameter en voldoende uitboren van het medullaire kanaal teneinde een stevige passing tussen het implantaat en endosteum bereiken. Met een zorgvuldige selectie van inteelt stam en matching van leeftijd en geslacht, de pasvorm wordt reproduceerbaar robuuste binnen een paar dagen. Toch with de komst van 3D druktechnieken, wordt verwacht dat torsie beweging verder kan worden verminderd door meer geavanceerde versies van de pen die geruwde oppervlakken en / of weerhaken bevestigingsplaatsen nemen. Het gemak van pen fabricage en de beschikbaarheid van diverse hypodermische buis afmetingen ook mogelijk de optimalisatie van de techniek voor vrijwel alle volwassen muis te kweken, ongeacht natuurlijke of experimentele bot fenotype.
De unieke pin-kraagontwerp dient twee doelen: (i) afwijkende vernauwing van het defect en beschadiging van het bot uiteinden door longitudinale wegglijden, en (ii) naar bezienswaardigheden die de oorspronkelijke randen van het defect te omschrijven. Als zodanig, volumetrische en PMI metingen gemakkelijk kan worden gemaakt met behulp van een specimen μCT scanner zoals een Skyscan 1174. Inderdaad, deze aanpak het mogelijk om een niveau van kwantificering die niet gemakkelijk wordt verkregen met standaard niet-kritische en kleinbedrijf breuk technieken die vaak vertonen variabele of poeprly gedefinieerd verwondingen. Terwijl een μCT apparaat voorkeur kwantificering van genezing, evaluatie door objectieve beoordeling van orthogonale röntgenbeelden of 2D analyse technieken haalbare alternatieven kunnen vormen. Door hun kleine formaat en de relatief lage gehalte aan mineralen, kunnen muizen ledematen gemakkelijk worden bereid voor histologie en gemonteerd als geheel exemplaren voor conventionele histomorfometrie. Dit ontslaat bemonstering kwesties vaak geconfronteerd met onderzoekers uitvoeren histomorfometrische analyses van groot dier fracturen.
In de hier beschreven experimenten was betrekkelijk kort 3 weken, hetgeen overeenkomt met een snelle, anabole fase van botgenezing de genezingstijd. Daarna botremodellering is een zeer langzaam proces 28. In het algemeen, als overbrugging niet is waargenomen na 4 weken, genezing is onwaarschijnlijk en in overleg stellen we zeer weinig extra botgroei na 4 weken in dit systeem. Bovendien is een 3 mm gat voldoet aan de criteria van Key et eenl. 16 voor een kritische formaat gebrek en Garcia et al. aangetoond dat de spleet niet breder dan 1,8 mm onvoldoende genezen na 10 weken en dit kan worden uitgesteld tot 15 weken met gestripte perichondrium 23.
Hoewel de omvang en kwetsbaarheid van hun botten huidige grote technische uitdagingen voor orthopedisch onderzoek het gebruik van muizen is voordelig op tal van manieren. Zo is er een verscheidenheid aan immuun gecompromitteerde stammen die testen van menselijke cellen en eiwitten mogelijk zonder angst voor immunologische afstoting, en hun geringe omvang vermindert de noodzaak grote hoeveelheden kostbare experimentele materialen, cellen of verbindingen. Dit wordt geïllustreerd door onze recente studie tonen de werkzaamheid van volwassen menselijke stamcellen en hun extracellulaire eiwitten voor osteoregeneration 29. De relatief korte levensduur van muizen ook de gelegenheid stellen voor onderzoek naar veroudering 30 en de grote verscheidenheid van ingeteelde stammen peRMIT de studie van de wereldwijde genotype op genezing 31. Er zijn ook diverse ziektemodellen die gemakkelijk worden vastgesteld muizen zoals diabetes en osteoporose 32,33. Belangrijke opmerking is de beschikbaarheid van vele transgene muizen die kunnen worden gebruikt met deze techniek om ons begrip van regeneratieve botfysiologie onder omstandigheden van extreme trauma bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken het personeel en dierenartsen bij de Scott & White Ziekenhuis Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde, Temple, Texas, voor hun waardevolle advies en hulp bij de ontwikkeling van deze techniek. Dit werk werd deels gefinancierd door het Institute for Regenerative Medicine Program Funds, Scott & White RGP subsidie # 90.172, NIH 2P40RR017447-07 en NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Wij danken Dr Suzanne Zeitouni voor proofing het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C.
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V.
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H.
- Aro, H. T., Aho, A. J.
- Burstein, F. D.
- Kao, S. T., Scott, D. D.
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A.
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
