Introduction
これは、治療骨折を有する患者のために外科的に50万手続きは骨移植片2の使用を含む。米国の人口の半分は65 1歳までに骨折を経験していると推定されており、この数は、ますます高齢化、人口3に上昇すると予想されている。骨が完全に瘢痕なしに治癒する能力を有するいくつかの臓器の一つであるが、プロセスは3,4失敗する場合がある。状況や処理の品質に応じて、長骨骨折の2〜30％は、非組合3,5で得られた、失敗。定義、偽関節、大きさのクリティカルまたは非組合骨損傷上のいくつかの議論が残っているものの、一般的に被検体6の自然な寿命にわたって治癒しない怪我を指します。実験目的のために、この期間は、平均的なサイズの骨損傷の完全な治癒に必要な平均時間に短縮される。非組合骨病変はNUMのために起こるerousの理由が、主な要因は、原因疾患や年齢7に批判的にサイズのギャップ、感染、貧しい血管新生、タバコの使用、または阻害osteoregenerative容量になり、極端な外傷が含まれる。非組合が正常に処理されたとしても、それは損傷の種類と8を採用アプローチに応じて、手順6万ドルを超える費用がかかる。
中程度の場合には、自家骨髄移植が用いられる。この戦略は、損傷部位でのドナー部位および移植から骨の回復を伴う。このアプローチは非常に有効であるが、利用可能なドナー由来の骨の量は限られており、手順は、多くの患者9,10において持続性疼痛をもたらす追加の手術を伴う。また、自家骨移植片の有効性は、患者の健康状態に依存する。合成材料または処理死体の骨から作られた代用骨は11-13豊富に利用可能ですが、彼 らはヘクタール乏しい宿主細胞の接着性、骨伝導性減少、および免疫拒絶14の可能性を含め、重大な制限VEの。安全で、効果的であり、広く利用可能な骨再生技術が緊急に必要とされている。
骨再生の戦略を改善する当社の能力は、試験動物に深刻な骨の外傷を模倣する能力に決定的に依存しているが、大きな骨病変の発生と安定化は技術的に困難である。ほとんどの場合、深刻な長骨の外傷が自然治癒しない欠陥を確立することによって実験的に模倣される。それは種15によって変化し得るが、これは骨の断面16の直径の1.5倍よりも大きい骨セグメントを完全に除去することによって達成される。骨は、その後骨折エッジの適切な配向を維持し、移動性を可能にするために、金属インプラントで安定化される。その小さなサイズとの脆弱性に起因する彼らの長い骨は、マウスではそのような病変の確立が最も研究グループの能力を超えている。このように、長骨欠損モデルは、ラットおよび大型動物に限定される。それにもかかわらず、マウスは、それらが遺伝的に修飾されたヒト細胞および組織を拒絶しない、免疫不全株として育種することができるという点で、重要な研究の利点をもたらす。
彼らは生理的によく特徴付けているため、ヒト細胞ベースのアプリケーションでは、免疫不全マウスはで動作するように魅力的で、家に簡単に、効果的なコスト、簡単に放射線学的および組織学的に分析した。最も重要な免疫不全マウスは、ヒトを含む異なる種からの細胞を拒絶しないことである。その小さなサイズはまた、細胞または整形外科用途で実験的な足場の体積の非常に少数のテストを可能にします。いくつかのマウスモデルが整形外科用骨安定17,18の様々な程度を与えることが報告されている。これらのsyste軟骨内の治癒が19に報告されているが、外部固定器とロッキングプレートとしての安定性の非常に高いレベルをもたらすmsが主に膜内骨化によって治癒する。対照的に、未修正または部分的に固定された髄ピンを用いたものなど、いくつかのミクロおよび/ またはマクロ運動を可能にするものは、一般的に軟骨内骨化20,21が優勢で治癒する。長骨の遅延組合や非組合欠陥が必要な安定化の余分なレベルに起因したマウスで達成することが特に困難である。しかし、多くのアプローチが、プレートと外部固定器22をロックする、インターロック爪と髄ピンを含む、報告されている。これらのシステムは、一般的にはうまく動作しますが、その複雑な設計与えられた彼らは、インストールすることが技術的に挑戦することができます。例えば、ガルシアら 23は、マウスにおける使用のための優雅なインターロックピン方式を考案したが、手順は、2つの別々の部位における切開を伴いピンを収容するための大腿骨の広範な修正。これらの手順は、解剖顕微鏡下で行った。
ここで、我々は、3ミリメートルの骨欠損の閉鎖を防止し、また、欠陥のオリジナルのエッジを描くように設計され、中央襟付きのシンプルな大腿骨髄ピンについて説明します。ピンは、骨自体に固定されなかったが、十分な干渉髄腔結果のピン径、およびリーマの正確なサイジングがねじれ運動（ 図1）を最小化する。近交系、年齢、性別及び歪みを一致させたマウスを慎重に選択すると、結果は簡単に放射線学的に評価することが可能で再現性の高い肥大非uniondefect 22です。また、関心領域は、再現デノボ骨形成および組織形態学的パラメータを測定するためのマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）の後に定義することができる。ピンは、容易に入手可能なツールを使用して、我々の研究室で試作された。
図1：実験原理分節欠損モデルの図的要約。 9〜10ミリメートルマウス大腿骨の中央の3ミリメートルのセグメントは、（ 左 ）外科的に切除されている。長さ3mm、19ゲージの外科用鋼管は、正確な中心（ 右 ）での長い9ミリメートル、22 Gステンレス管の上を通過し、接着剤で固定されている。得られたピンは、骨の3mmのセグメントを置き換える19 Gのカラー（ 以下、センター ）と大腿骨の残りの近位および遠位部分の髄運河に嵌め込まれている。
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Protocol
注：このプロトコルは、ジャクソン·ラボラトリーズから取得した女性のヌード（民/ J）マウス（18〜25グラム、6週間）のために設計されています。マウスの系統は解剖学と成長率の点で若干異なるので、私たちは、ピンの製作がライブの被験者への移植の前に、受信者の株、性別や年齢に合わせて最適化されていることを助言する。株を注意深く一致した場合に、ピンと髄腔との間の締まり嵌めは、再現性が高い。住宅、食事療法および一般的な畜産のための手順は、このプロトコルの範囲を超えていますが、すべてのマウスは、実験動物の管理と使用に関する指針（ 第8版）と動物実験で設定された機関の方針に従って収容し、スコットと白病院で使用委員会（IACUC）と比較医学部（DCM）。
ピンの1の作製
- 22 Gステンレス皮下チューブの9ミリメートルの長さ、及び回転工具に取り付けられた23.8ミリメートルの直径のガラス繊維強化ヘビーデューティカットオフホイールを使用して、19 Gチューブの3ミリメートルの長さをカット。チューブ（ 上記の 図2Aを 、）固定化するために小型の先の細いペンチを使用してください。適切な眼の保護具を着用し、注意して回転工具を取り扱う。
- 9ミリメートルシャフトの中央にシアノアクリレート接着剤を少量（約10μL）を配置します。中央にまで9ミリメートルシャフト上に3ミリメートルの襟をパスし、均等にカラーとシャフトの間に接着剤を分配するためにねじる。デジタルノギス一対の寸法を測定し、 図1と比較する。少なくとも15時間（ 図2A、 中央 ）に設定できるようにします。
- バリや過度の接着剤を除去するために220グリットエメリー含浸ディスクを使用してください。
- 回転工具を使用して、感じた研磨ディスクを使用してピンを磨く。
- 脱イオン水ですすぎ、COMPREとドライssed空気。
- 襟に対して新たに作らピンとプッシュのシャフトの上に19 G皮下注射鈍針を配置することによって、テストの整合性。カラーは重量の約25グラムに抵抗できることを確認してください。
- 滅菌濾過したリン酸緩衝生理食塩水（ 図2B、 上部 ）にピンをすすぐ。ピンの軸がカット骨（ 図2C）の端に襟フラッシュと大腿骨髄腔にぴったりとフィットしていることを確認してください。研究者と受信者（ 図2D）の特定の目的のためのプロトタイプの様々な構成。固定を最大化し、締まりばめ（ 図2E）を向上させるために、ピンの端部は骨幹部の骨梁骨に浸透することを確認します。
注：それはフィット感が生きたマウス（ 例えば 図2C）で移植前に骨の標本でテストすることをお勧めします。 - シリンダーをカットする4ミリメートルの直径のパンチ生検カッターを使用してください外科ゼラチンスポンジの5ミリメートル厚のシートから。 3ミリメートル長にシリンダーをトリミングし、穴（ 下の 図2Aを 、）を生成するために、シリンダの長さに沿って20 Gの皮下注射針を渡すためにメスを使用してください。
注：我々は、欠陥部位のゼラチンまたはコラーゲン足場の配置は細胞保持を改善し、骨の軸に沿った長手方向の成長を誘導することを見出した。 - ピンの上ゼラチン泡シリンダーをパスし、15 psiで120℃のドライサイクル上の襟（ 図2B、 中央 ）、オートクレーブに整列。ゼラチン発泡体は乾燥して（ 下の 図2B、）色に暗くなります。
2.手術手技
注：以下の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針（ 第8版）で設定されたすべてのガイドラインを観察書かれている。すべての追加のポリシーを遵守してください地元のIACUCによって設定され、次のセクションに進む前に整備されている（または同等の）IACUC承認の動物使用プロトコルを確認してください。
図3：手術器具。 （A）外科キット。マイクロドリル（1）、ホイールを切断（2）、吸収性縫合糸（3）、外側縫合糸（4）、外科用メスの刃（5）、メスハンドル（6）箔で包み、無菌髄ピン（7）、髄デプスゲージ製フォーム皮下チューブ（8）、微鼻鉗子（9）、ラット歯鉗子（10）、鈍いリーミング針（11）、ニードルドライバ（12）、小さな止血（13）、微細なハサミ（14）、骨膜エレベーター（15）、修正されたカーン鉗子（16）（B）：マウスでカーンスタイル骨グリップを生成するために必要な改変。
- 閉鎖可能なドアと、外科的処置室やクリーン研究室を選択し、[なしスルートラフィック。適切な仕事surfacサニタイズ臨床グレードの四ベースの除菌洗浄剤とE。
- 使い捨て滅菌手袋とローブを身に着けている間、オートクレーブ布のカーテンで消毒作業台の上に約60×90 cm の滅菌野を設定します。
注：これは、アシスタントが外箱を削除し、フィールドを設定する調査員に無菌の材料を提示していることをお勧めします。 - ドレープ上の温水の再循環に装着サニタイズ加熱パッドを配置し、滅菌使い捨てドレープでカバー。作動温度までビーズ滅菌を温める（250から265℃で、これは30分までかかる）。
- 無菌のフィールドでは、すべてのコンポーネントへの便利なアクセスを提供するために、外科的なキット（ 図3A）を配置する。また、無菌の綿ガーゼ（2×2インチ2）、滅菌綿棒（w / vの0.9％）、滅菌生理食塩水を含む滅菌製のボウル（500ml）に提供し、クロルヘキシジン/イソプロピルアルコール外科用消毒剤アプリケータ。
- 小さなを組み立てる獣医ガイダンスとユーザーマニュアルに従って誘導室とノーズコーンアセンブリと無菌のフィールドの横にある動物麻酔ユニット。ガスの供給およびイソフルラン、USPとして臨床グレードの酸素を使用してください。
図4：外科的手技。 （AC）アプローチと大腿骨の露出。（DE）標高とカット。（FK）リーマと髄質運河のサイジング。
図5：外科的手技。ピンの（AB）インストール。（CD）閉鎖。（E）手術後適切に位置決めピン24時間の典型的なイメージ。
- 麻酔システム及びそれの誘導チャンバ内にマウスを置きtは2分-1 O 2 L 3％のイソフルラン濃度出力（v / v）である。
- マウスは1分以内に意識不明であることを確認してください。必要に応じて、（v / v）の4％に濃度を上げる。下に位置して加熱パッドで無菌のフィールド上でマウス、場所を削除して、ノーズコーンを適用します。転送は、制度の方針に従ってコーンに流れ、そして2.5％イソフルランを削減、さらに20秒間待ってから、適切な外科的な平面のためのテスト。一般的に、静かに絞ら後肢反射の欠如は、十分な麻酔を決定するための十分である。
- 全体のプロセスの間に、無意識ながら酸素化の適切なレベルを確保するために、強力な規則的な呼吸と手足と口領域のピンク色のアシスタントモニタを有する。必要に応じて獣医指導や機関方針に従って麻酔を調整します。無菌人工涙潤滑軟膏（15％（v / v）の鉱油、83％（v / v）でのwhを適用目にITEワセリン）。
- 新しい使い捨てドレープに上向きに後肢で片面にマウスの電源を入れます。必要に応じて、電気かみそりや脱毛クリームで毛皮を削除します。滅菌生理食塩水でサイトを拭き、過剰毛皮を持つ追加ドレープを削除します。すべての部分が、全体の後肢（ 図4A）をカバーが、着色や呼吸を監視するために、顔と足のビューを維持するために、マウスの上に新しい有窓ドレープを配置します。
- 大腿骨の近位端と遠位端の位置を確認し、縦軸（ 図4B）に沿って5〜10ミリメートルのために皮膚を切開。 大腿二頭筋と外側広筋を経由して、大腿骨への側方アプローチを暴露、＃15メスで筋膜からスキン層を分離してください。両方の筋肉のセプタムが（それは筋肉のピンク色に対する白い組織のラインである）を満たす場所を特定。メスで、慎重になるまでintermuscular境界に沿って解剖する大腿骨（ 図4B）は、可視である。
- 全体骨幹（ 図4C）を露出するように鈍い骨膜エレベーター付切開を開発する。内側（ 図4D）上の後部神経血管バンドルを保存するために注意しながら、さらに、大腿骨の中央の三分の二を露出するためにエレベーターを使用してください。静かに無菌Q-先端または同等のソフトなメスを用いて骨のオフ組織、ドライをこすり。
- 滅菌メスまたはマーカーとのキャリパー必要に応じて、マークと大腿骨の中央の位置を確認し、その後、中心から近位と遠位に1.5ミリメートルをマーク。ゆっくりと骨に過度の圧力を防ぐために、以前にカーンスタイルで作ら細かい鼻鉗子のペアを使用して大腿骨を把握する。
注：修飾の厳密な寸法は、 図3Bに設けられている。それは、必要とする圧力下では成立しません骨を確保するために、使用前に安楽死させた試料に鉗子をテストすることをお勧めします切削時固定化のための開発。 - 微細ダイヤモンド·グリット被覆切削ホイール（直径8mm X 0.1ミリメートル幅）を装着細かいドリルを使用して、（ 図4E）の下に組織を保護するための場所にエレベーター付最初のカットを作る。しっかりと3ミリメートルのセグメントを除去し、第二のカットを行い、骨幹の先端を保持した状態で45℃にカット大腿骨を上げる。
注：顔の保護は、この段階で推奨されます。 - 鉗子により固定化骨と、慎重に鈍23 G皮下注射針で、各端の髄空洞をリーマ。 19 Gチューブに配置された22のGチューブの長さから作られた既製の深さゲージを使用する（ 図3（a）は 、 私は 8をTEM）、リーマ髄空洞の深さを評価し、それが3ミリメートルであることを確認します（ 図4F-K） 。骨髄腔が22のG深さゲージに抵抗する場合は、鈍い22 G皮下注射針で再びリーマ。
- 慎重その後、近位遠位髄Cに髄ピンを挿入avities元の長さに外に戻って大腿骨を持参し、安定した3ミリメートルギャップ（ 図5A、B）を確立する。必要に応じて、大腿骨の皮質骨とロッドの良好な締まりばめを達成するために手動の応力を少量適用する。ピンは両側の髄腔にぴったりとフィットし、カット骨のエッジが襟と同一平面にあることを確認します。ギャップがある場合は、22 G鈍針で再度リーマ。
- ピンの上の筋肉や末梢組織の位置を変更し、継続的な吸収性縫合糸5-0（ 図5C）で閉じます。外科用接着剤（ 図5D）と5-7正方形の結び目のナイロン5-0縫合糸およびシールとの緊密な皮膚切開。
3.術後の手順
- 皮膚切開を閉じた後、麻酔を撤回するが、マウスが動き始めるまで、O 2を流したままにし、これは、1分未満を取る必要があります。マウスの5分後に動かないままである場合O 2投与、獣医介入上の制度的政策を参照してください。
- マウスが動き始めると、優しく好ましくは乾燥、オートクレーブ処理のベッドを含むケージに移す。
- 各ケージにイグルー型の巣を置き、マウスの動きを減らすこと、その中に後退します。マウスは、意識の回復後に後肢モビリティ5〜10分を回復することを確認してください。
- 制度的方針に従って毎日の術後のモニタリングを行います。最初の5〜7日間ケージの床に糊化水分補給と食料を提供し、制度的に承認された方針に従って鎮痛と術後監視を管理する。
注：マウスは、通常のユーティリティを回復しない場合、我々は0.25ミリリットル生理食塩水を皮下、一日二回最初の3日間、その後に0.05〜0.1 mgのキロ-1ブプレノルフィン24を管理する。
- 回復の最初の24時間後に、未定義生動物のX線撮影を行うピン配置（ 図4E）を可視化するには、r麻酔。ピンがずれている場合は、すぐに修正手術を検討してください。
- 7日目、手術後では、制度的畜産方針に従ってグループで麻酔し、家の下で縫合糸を取り除く。
- 2-5週間後、人道的に安楽死25のための方法を承認したアメリカン獣医師会に合わせて動物を安楽死させる。
注：市販のバルビツールコンビネーション安楽死カクテルの腹腔内注射は、効果的かつ人道的ですが、安楽死のローカルの機関の方針に従ってください。 - 慎重に、近位大腿骨と内側から骨盤を暴露することにより後肢を離れて解剖。メスで寛骨臼 （股関節ソケット）から大腿骨頭を取り外しながら、ゆっくりと手足の側面から内側のジョイントを押してください。解放する、鋭いメスまたはマイクロはさみで残りの筋肉と皮膚をカット全体手足は骨盤を形成する。骨鉗子または重いハサミを使用すると、下位後肢（脛骨/腓骨）膝関節の下約5ミリメートルをカット。
メモ：すべての検体が分析前に同一の方法で保存されていることをお勧めします。 - 皮膚を除去するが、所定の位置に筋肉を残す。 1月までの前にイメージングするための10のCaCl 2を添加したリン酸緩衝生理食塩水でストレージが続く1週間のために10のCaCl 2固定液を補充した10％緩衝ホルマリンで組織を固定してください。 4℃で固定し、ストレージを実行します。また、固定せずにすぐに検体をスキャンします。
標本4.分析
NOTE：骨治癒は、このプロトコルの範囲を超えている方法論の様々によって評価することができる。以下は、私たちが成功した検体マイクロCT（μCT）イメージャを使用して採用している方法です。それは、次のパラメータARのことをお勧めしますeは、プロジェクトの特定のニーズに合わせて最適化され、最初に試験。
- プラスチック封止フィルムの薄い層で試料をラップし、計器室に垂直に配置します。大腿骨は全体のスキャン中に試料ステージに垂直であることを確認してください。次のパラメータにスキャンを設定します。電圧= 29 kVの、現在= 661μA、パワー= 19 W、画像のピクセルサイズ（μm）を= 21.00。 360度の回転= YES; （5）上のフレーム平均=;上の回転ステップ（度）= 1.00、ランダムな動き=。スキャンごとに単一の保存先のフォルダ（ 例えば 図6A）内のJPEGファイルとして画像を保存します。
注：スキャンは57分で完了する必要があります。 - 次のパラメータに基づいてアキシャル画像を生成するために再構築ソフトウェアを利用する。 （5）、ビームハードニング補正（40％）上のリングアーチファクト低減=、CS回転（度）= 0.00、上=（4）、位置ずれ補正に=スムージング。 2,000〜15,000ハウンズフィールド単位に出力を設定します。 JPEGファイルとして画像を保存スキャンごとに単一の先のフォルダに。
- アキシャル画像及び分析ソフトウェアを用いて、第一の元欠陥の近位端および遠位端を設定することにより、関心領域（ROI）を定義する。唯一の襟を含むセクションを選択することにより、これを達成する。カラーは延髄ピンよりも厚いため、これらのセクションでは、簡単に（ 左 図6B、）が定義されている。 （ 右 、 図6B）（100μmの余裕をもって）その周囲の除外ゾーンを描画し、ROI内のセクションのそれぞれにゾーンを転送することによって計算から襟を除外します。
注：このような新たな骨の体積（ 図6C、D）のような慣性、3D再構成及び計算の極性モーメントが容易にソフトウェアを用いて達成することができる。
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Representative Results
マウスは、一般的に意識を回復し、後肢の移動に麻酔の中止後5〜10分。最初の5日間、それは個別にマウスを収容し、四肢の過剰使用を防止するための環境エンリッチメントを導入することをお勧めします。この目的のために、イグルー型の巣は、巣の建物の必要性を低減し、休息をお勧めします。また、ケージの床に食品及びヒドロゲルの提供は、ピンの変位の確率を減少させることを観察した。制度的に承認されたポリシーに従って、必要に応じて、5日間の期間中、鎮痛は、投与されるべきである。元の術前の体重の約15％までの重量損失は、5日間の術後期間中に可能である。二十四時間、手術後、患肢のX線は、ピン配置を評価することをお勧めします。ピンは、完全に、カラーに対して欠陥フラッシュのエッジと近位および遠位髄運河（ 図2Cに挿入されるべきである図2E、 図5E、および図6A）。これが発生した場合、修正手術のために提供すべきである（症例の<5％）まれに、ピンは、治癒および動物使用プロトコルの初期段階でずれになり得る。それは、マウスの大腿骨にねじれ運動を定量化することは技術的に困難であるが、標本の触診は、結合組織は、ピンの周りに蓄積するねじれと縦運動が7日後にわずかであることを確認した。術後モニタリングの5日後、マウスは、制度が承認したポリシーに従って、標準的な共同住宅に戻すことができる。
治療的介入なしで、欠損の縁は、典型的には21日間は0.5mm延びるが、まれに、新しい骨の成長は、1mm（ 図6A）までとすることができる。非組合欠陥が生じる回生停戦の炎症との同化の段階として、この期間の後に骨成長逮捕。治癒の14-21日後、ボリュームoをfのデノボ骨が容易にμCTスキャンによって生成されたアキシャル画像から決定することができる。プロトコールに記載の走査軸方向及びROI再選択手順を使用して、新しい骨の体積は時間とともに増加し生成されたが、一般的に6と比較して、治療的介入（ 図6C）の非存在下で1mm 3の合計を超えない無傷の大腿骨の解剖学的に同等の領域では7ミリメートル3。従来の生体力学的試験による固定法の標本の大きさおよび性質、慣性（PMI）極モーメント、断面積および密度に基づいてねじれに耐える材料の能力の推定に技術的に困難であるが、されている長骨26,27に強度の適切な推定値を表すことが示された。この方法を用いて、病変の縁から様々な距離における軸方向断面は、分析のために選択することができる。 21日後、 新たに骨のPMI 0.25ミリメートルのFR0.02〜0.08ミリメートル病変の中心にある4は、さらに未処理の場合（ 図6D）における非組合の存在を確認するに比べ4 0.05〜0.35ミリメートルの間から、病変の縁の範囲オム。解剖学的に等価な位置における無傷の大腿骨のPMIは、典型的には、ここに記載した条件を用いて、4 0.5〜0.7ミリメートルの間の範囲である。
図6：典型的な結果。 7日目に大腿骨の（A）X線スキャンは、14と21、術後の骨の限られた内方成長を示すパネルB：体積、骨の測定のためのROIパラメータの図的表現が。 （ 左 ）、金属-組織界面での成果物の測定を除外する100μmのマージンを含めピンカラーのオーバー除外ゾーン（EX）との代表軸方向の断面。フルは、骨スキャン（RIGHT、トップ）は除外され、元の骨組織（EX）との襟の端の間に骨のセクションで定義された縦方向のROIを実証する。オリジナルの病変エッジはピンの直径と襟（ 右、下 ）との間の差を使用して、軸方向のセクションに配置されています。（C）は 7日目、14のない治療的介入で21手術後での典型的な体積測定が（と意味標準偏差、n = 3）であった。（D）、近位および遠位の病変の縁と中点0.25ミリメートル（標準偏差を意味する軸方向セクションにおけるPMI測定値はn = 3）。（E）、マッソン三色染色パラフィン包埋セクション（ 左 ）、骨軟骨（約）からなる伸長および海綿骨（b）は、（スケールバー= 0.5 mm）を実証し、長手方向に切断した。フィールドの位置は、X線スキャン（ 右 ）に示されている。（F）非decalcifiED、ヘマトキシリン及びエオシン（スケールバー= 1.0ミリメートル）で染色した1日齢の欠陥のメチルメタクリレート埋め込 まれた冠状断面。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
組織の脱灰は、一般的に標準的な条件を用いて10〜14日かかり、容易にX線スキャニングによってモニターされる。それは、取り扱い中の安定性を向上させるために脱灰中に標本上のいくつかの筋肉組織を保持することをお勧めします。脱灰後、ピンを注意深くパラフィン包埋および組織学を可能に鋭いメスで除去することができる。縦断のマッソンの三重染色は、海綿骨（CB）（ 図6E）が続く軟骨（CA）の立ち上がりに軟骨内骨の成長の可視化を可能にする。いくつかの損傷が必然的に解剖中に発生しますが、骨の組織学的構造ピンを慎重に除去されている場合と結合組織は透明なまま。代替的に、メチルメタクリレートの埋め込 みおよび非脱灰切片の切片は、代わりに、ピン（ 図6F）を用いて行うことができる。
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Discussion
ここで、我々は、標準的な実験および獣医装置を使用して、マウスの大腿骨の臨界サイズのピンで安定化された欠陥を生成する簡単な方法を説明する。ピンのアセンブリと、外科的処置自体は練習が必要ですが、それはよくよく訓練された生物医学研究者や獣医師の能力の範囲内である。
ピンは、技術的により実現可能な外部固定またはインターロックねじを採用し、より複雑なアプローチよりも手続きをする、追加の固定せずに髄管内に位置している。いくつかのねじれ運動は、治癒の初期段階の間に起こるかもしれないが、インプラントと骨内膜との間にしっかりと締まり嵌めになるように、これは、ピンの直径と、髄管のリーミング十分に注意することによって最小化される。年齢や性別の近交系とのマッチングを慎重に選択することで、フィット感は数日以内に、再現性、堅牢になります。それにもかかわらず、ウィスコンシン3D印刷技術の出現番目は、ねじれ運動をさらに粗面及び/または有刺付着部位を組み込んピンのより洗練されたバージョンで低減できることが期待される。ピンの製造の容易さ及び皮下チューブサイズの多種多様の利用可能性も関わらず、天然のまたは実験の骨表現型の、実質的に任意の成体の近交系マウスのための技術の最適化を可能にする。
（I）縦滑りを通じて骨の四肢の欠陥や損傷の異常な狭小化を防止するための、および（ii）欠陥の元のエッジを定義する目印を提供するために：ユニークなピン襟のデザインは2つの目的があります。このような、容積及びPMI測定値がそのような実際Skyscan 1174として試料μCTスキャナを用いて容易に行うことができるように、このアプローチは、多くの場合、変数またはうんちを示す簡単に標準的な非臨界サイズの骨折技術では得られない定量のレベルを可能にするRLY怪我を定義しました。 μCT単位が好ましいが、直交X線画像または2D画像解析技術を客観的に評価することにより治癒、評価の定量のために実行可能な代替物を表すことができる。サイズが小さいと、比較的低いミネラル含有量を、マウスの四肢は容易に組織学のために調製することができ、従来の組織形態計測のための全検体としてマウント。これは頻繁に大型動物骨折の組織形態計測分析を行う研究者が直面しているサンプリングの問題を閉じる。
ここに記載した実験では、治癒時間は、骨治癒の迅速な同化相に対応する、3週目には比較的短かった。その後、骨リモデリングは、非常にゆっくりとしたプロセス28である。一般的にブリッジングが4週間後に観察されない場合、治癒は起こりにくいと一致して、我々は、このシステムで4週間後にはほとんど追加の骨の成長を観察する。さらに、3ミリメートルギャップがキーらAの基準を満たしている臨界サイズの欠陥及びガルシアらためリットル16は 1.8 mmの狭い間隙が十分に10週間後に治癒しないと、これが取り除か軟骨膜23と15週間まで遅らせることができることを実証した。
整形外科の研究のためのそれらの骨の大きさと脆さが存在し、重大な技術的挑戦が、マウスの使用は、多くの点で有利である。例えば、そこに免疫学的拒絶の恐れなしに、ヒト細胞およびタンパク質の試験を可能にする免疫低下株の多様であり、それらの小さなサイズは、貴重な実験材料、細胞又は化合物の過剰な量の必要性を低減する。これはosteoregeneration 29成人幹細胞およびそれらの細胞外タンパク質の有効性を実証する我々の最近の研究が挙げられる。マウスの比較的短い寿命も30老化の研究および近交系peは、多種多様な機会を提示するヒーリング31上のグローバル遺伝子型の研究をRMIT。簡単に、糖尿病および骨粗鬆症32,33としてマウスで確立された疾患モデルの数もある。かなりの注目すべきは、極端な外傷の条件で再生骨生理学の理解を促進するために、この手法で使用することができる多くのトランスジェニックマウスの利用可能です。
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Acknowledgments
私たちは、この技術の開発中に彼らの貴重な助言と支援のために、比較医学、寺院、テキサス州のスコット＆ホワイト病院部門のスタッフや獣医師に感謝します。この作品は、再生医療プログラムの資金のための研究所、スコット＆ホワイトRGP助成＃90172、NIH 2P40RR017447-07及びNIH R01AR066033-01（NIAMS）によって部分的に資金を供給した。私たちは、原稿を校正するための博士スザンヌ·ゼイトゥーニーに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
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