Introduction
Estima-se que metade da população dos EUA experimentar uma fratura por 65 anos de idade 1. Para aqueles pacientes com fraturas tratadas cirurgicamente, 500.000 procedimentos envolvem o uso de um enxerto ósseo 2 e este número deverá aumentar com uma população cada vez mais envelhecida 3 . Embora o osso é um dos poucos órgãos que tem a capacidade de curar completamente sem formação de cicatrizes, existem casos em que o processo falha 3,4. Dependendo das circunstâncias e qualidade do tratamento, 2-30% das fraturas de ossos longos falhar, resultando na não-união 3,5. Embora ainda haja alguma debate para a definição, pseudo-artrose, lesões ósseas críticas porte ou não sindicalizados geralmente se refere a uma lesão que não cicatriza sobre a vida natural do sujeito 6. Para fins experimentais, a sua duração for encurtado para o tempo médio necessário para a cura completa de uma lesão óssea de tamanho médio. Lesões ósseas não-sindicalizados ocorrer numerous razões, mas os principais fatores incluem trauma extremo resultando em uma lacuna crítica porte, infecção, má angiogênese, o uso do tabaco, ou a capacidade osteoregenerative inibido devido a doença ou 7 anos de idade. Mesmo se não uniões são tratados com sucesso, pode custar mais de US $ 60.000 por procedimento, dependendo do tipo de lesão e as abordagens empregadas 8.
Nos casos moderados, enxerto ósseo autólogo é empregado. Esta estratégia envolve a recuperação do osso a partir de um local dador e o implante no local da lesão. Enquanto esta abordagem é extremamente eficaz, o volume disponível de osso derivadas de dador é limitada e o procedimento envolve uma cirurgia adicional, que resulta em dor persistente em muitos pacientes 9,10. Além disso, a eficácia do enxerto ósseo autólogo é dependente da saúde do paciente. Substitutos ósseos feitos de materiais sintéticos ou de osso de doador falecido processados estão disponíveis em abundância 11-13, mas eles have limitações significativas, incluindo propriedades fraca adesão da célula hospedeira, reduzida osteocondutividade, e do potencial de rejeição imunológica 14. Há, portanto, uma necessidade urgente de tecnologias de regeneração óssea que são seguros, eficazes e amplamente disponível.
A nossa capacidade de melhorar as estratégias de regeneração óssea é extremamente dependente da capacidade de imitar trauma ósseo grave em animais de laboratório, mas a geração e estabilização das lesões ósseas grandes é tecnicamente desafiador. Na maioria dos casos, o trauma grave ossos longos é mimetizado experimentalmente através da criação de um defeito que não irá naturalmente curar. Embora possa variar com as espécies de 15, isto é conseguido por remoção completa de um segmento de osso que é maior do que 1,5 vezes o diâmetro da secção transversal do osso 16. O osso é então estabilizada com um implante de metal para manter a orientação adequada das arestas de fractura e para permitir a mobilidade. Devido ao seu pequeno tamanho e da fragilidade doseus ossos longos, o estabelecimento de tais lesões em camundongos estão além das capacidades da maioria dos grupos de pesquisa. Como tal, os modelos de defeitos dos ossos longos são confinadas a ratos e animais maiores. No entanto, os ratinhos proporcionam vantagens significativas de investigação em que eles podem ser modificados geneticamente e criadas estirpes como o sistema imunitário comprometido que não rejeitam as células e tecidos humanos.
Para aplicações baseadas em células humanas, os ratos imunocomprometidos são atraentes para trabalhar com eles, porque são fisiologicamente bem caracterizado, fácil de casa, de baixo custo e facilmente analisados radiologicamente e histologicamente. De suma importância é que os ratos imunocomprometidos não rejeitam as células de diferentes espécies, incluindo os seres humanos. O seu pequeno tamanho também permite o teste de um pequeno número de células ou volumes de andaimes experimentais em aplicações ortopédicas. Vários modelos murinos ortopédicos têm sido relatado que proporcionam vários graus de estabilidade óssea 17,18. Aqueles systems que resultam em níveis muito elevados de estabilidade, como fixadores externos e placas de bloqueio predominantemente curar por ossificação intramembranosa embora a cura endochondral tem sido relatada 19. Em contraste, aqueles que permitem alguma micro e / ou macro-motion, como as que utilizam pinos medulares não corrigidos ou parcialmente fixos, geralmente curar com uma predominância de ossificação 20,21. Retarde ou defeitos não sindicalizados de ossos longos são particularmente difíceis de alcançar em camundongos devido ao nível extra de estabilização necessária. No entanto, há relatos de um número de abordagens, incluindo pinos medulares com hastes bloqueadas, placas de bloqueio e fixadores externos 22. Esses sistemas geralmente funcionam bem, mas dado o seu projeto complicado que pode ser tecnicamente desafiadora para instalar. Por exemplo, Garcia et al. 23, concebeu um sistema de pino de bloqueio elegante para utilização em ratinhos, mas o procedimento envolve incisões em dois locais separadoss e extensa modificação do fémur para acomodar os pinos. Estes procedimentos foram realizados sob um microscópio de dissecação.
Descrevemos uma cavilha medular femoral simples, com uma gola central, concebido para impedir o fechamento de um défice de osso, 3 mm e também delinear as extremidades originais do defeito. Enquanto o pino não foi fixado ao próprio osso, dimensionamento preciso do diâmetro de pino e a fresagem dos resultados de cavidades medulares em interferência suficiente para minimizar o movimento de torção (Figura 1). Com cuidadosa seleção de idade inato, gênero e camundongos correspondida-deformação, o resultado é uma alta reprodutibilidade hipertrófica não-uniondefect 22, que pode ser facilmente avaliada radiologicamente. Além disso regiões de interesse podem ser reprodutível definido após computadorizada de micro tomografia (μCT) para a medição de de formação de osso novo e parâmetros histomorfológicos. Os pinos foram protótipo em nosso laboratório usando ferramentas facilmente disponíveis.
Figura 1: princípio Experimental resumo esquemática do modelo de defeito segmentar.. O centro de segmento de 3 mm 9-10 mm de um fémur murino é excisado cirurgicamente (esquerda). Um, de calibre 19 de tubo de aço cirúrgico 3 milímetros de comprimento é passado sobre um 9, 22 mm de comprimento L do tubo de aço inoxidável e fixado com adesivo no centro exacto (à direita). O pino resultante é encaixada os canais medulares das restantes porções proximais e distais do fémur com a gola 19 G substituindo o segmento de 3 mm de osso (em baixo, ao centro).
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Protocol
NOTA: Este protocolo é projetado para nu (Nu / J) camundongos fêmeas (18-25 g, 6 semanas) adquirido de Jackson Laboratories. Desde linhagens de camundongos variar um pouco em termos de anatomia e taxa de crescimento, aconselhamos que a fabricação de pinos é otimizado para a tensão, sexo e idade dos beneficiários antes da implantação em seres vivos. Se as estirpes são cuidadosamente combinados, o ajuste de interferência entre a cavilha e a cavidade da medula é altamente reprodutível. Procedimentos para a habitação, alimentação e criação de animais em geral estão fora do âmbito deste protocolo, mas todos os ratos foram alojados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição) e as políticas institucionais criados pelo Animal Care e Institucional Use Committee (IACUC) e Departamento de Medicina Comparativa (DCM) com Scott e Hospital White.
1. Fabricação de Pinos
- Cortar um comprimento de 9 mm hipodérmica 22 G tubagem inoxidável, e um comprimento de 3 mm de 19 L utilizando tubagem de um serviço pesado roda de corte de diâmetro de fibra de vidro reforçada 23,8 milímetros equipado com uma ferramenta rotativa. Use um pequeno alicate de ponta fina para imobilizar a tubulação (Figura 2A, acima). Use óculos de proteção adequado e lidar com ferramenta rotativa com cuidado.
- Colocar uma pequena quantidade (aproximadamente 10 ul) de adesivo de cianoacrilato para o meio do eixo 9 mm. Passe o colar 3 milímetros ao longo do eixo 9 milímetros até no centro e torcer para distribuir uniformemente a cola entre o colar e o veio. Medir as dimensões com um par de pinças digitais e comparar com a Figura 1. Deixa-se para definir, pelo menos, 15 h (Figura 2A, centro).
- Utilize um disco impregnado de esmeril 220 grit para remover as rebarbas e cola em excesso.
- Usando a ferramenta rotativa, polir o pino usando um disco de polimento sentia.
- Enxágüe com água deionizada e seco, com comprear sseD.
- Teste de integridade, colocando uma agulha hipodérmica 19 G romba sobre o eixo do pino de impulso e feitos recentemente contra o colar. Certifique-se de que o colar pode resistir a cerca de 25 g de peso.
- Lavar o pino em filtrada estéril salina tamponada com fosfato (Figura 2B, em cima). Certifique-se de que o eixo do pino se encaixa perfeitamente na cavidade medular femoral com o colar contra as bordas do osso corte (Figura 2C). Protótipo várias configurações para os fins específicos do estudo e do destinatário (Figura 2D). Certifique-se de que as extremidades do pino de penetrar dentro do osso trabecular da diáfise de forma a maximizar a fixação e melhorar o ajuste de interferência (Figura 2E).
NOTA: Recomenda-se que o ajuste é testado em peças ósseas antes da implantação em camundongos vivos (por exemplo Figura 2C). - Use a 4 mm de diâmetro de punção-biópsia cortador para cortar um cilindroa partir de uma folha de cinco milímetros de espessura de esponja cirúrgica gelatina. Usar um bisturi para cortar o cilindro de 3 mm de comprimento e passar uma agulha hipodérmica 20 G longo do comprimento do cilindro para gerar um furo (Figura 2A, abaixo).
NOTA: Verificou-se que o posicionamento de uma gelatina ou colagénio andaime no local do defeito melhora a retenção de células e induz o crescimento ao longo do eixo longitudinal do osso. - Passe o cilindro de espuma de gelatina sobre o pino e alinhar com o colar (Figura 2B, centro) e um ciclo de autoclave em seco a 120 ° C a 15 psi. A espuma de gelatina irá secar e escurecer em cor (Figura 2B, abaixo).
2. Técnica Cirúrgica
NOTA: O procedimento a seguir é escrito observando todas as orientações definidas pelo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição). Por favor, observe todas as políticas adicionaisdefinido pelo IACUC local e garantir um protocolo uso de animais IACUC-aprovado (ou equivalente) está no local antes de prosseguir com as seguintes seções.
Figura 3: Instrumentos cirúrgicos. (A) kit cirúrgico. Micro-broca (1), o corte de roda (2), fio absorvível (3), sutura exterior (4), lâminas de bisturi (5), cabo de bisturi (6), os pinos medulares estéreis embrulhados em papel (7), medidor de profundidade medular feito formulário tubulação hipodérmica (8), uma pinça de nariz fino (9), uma pinça de ratos dentes (10), agulhas de fresagem sem corte (11), motoristas de agulha (12), pequenas hemostats (13), uma tesoura fina (14), elevador periosteal (15), fórceps modificados Kern (16) (b):. modificações necessárias para produzir Kern estilo ósseas-apertos para os ratos.
- Escolha uma sala de procedimento cirúrgico ou de laboratório, limpo, com uma porta que pode ser fechado e nenhum tráfego de trânsito. Higienizar a surfac trabalho adequadoe com um desinfectante líquido de limpeza à base de quaternário de grau clínico.
- Enquanto o uso de luvas estéreis descartáveis e robe, criou um campo estéril de aproximadamente 60 x 90 cm 2, na superfície de trabalho higienizado com cortinas de pano autoclavada.
NOTA: É aconselhável ter um assistente remover a embalagem exterior e apresentar os materiais estéreis à colocação do campo investigador. - Coloque uma almofada de aquecimento higienizado equipado com um re-circulador de água quente sobre o pano e cubra com cortinas descartáveis estéreis. Aqueça um esterilizador talão a temperatura de funcionamento (250-265 ° C, isto leva até 30 min).
- No campo estéril, providenciar o kit cirúrgico (Figura 3A) para fornecer acesso conveniente a todos os componentes. Além disso, proporcionar algodão gaze estéril (2 x 2 polegadas, 2), estéreis cotonetes, uma bacia de aço estéril (500 ml) contendo solução salina estéril (0,9% w / v) aplicadores, clorexidina e desinfectantes / álcool isopropílico cirúrgico.
- Montar uma pequenaunidade de anestesia de animais ao lado do campo estéril com uma câmara de indução e conjunto de ponta de cone, de acordo com orientação veterinária e manual do usuário. Use oxigênio clínica grau que o fornecimento de gás e isoflurano, USP.
Figura 4: O procedimento cirúrgico. (AC) Abordagem e exposição do fêmur. (DE) Elevation e cortes. (FK) Reaming e dimensionamento de canais medulares.
Figura 5: O procedimento cirúrgico. (AB) Instalação de pin. (CD) Encerramento. (E) imagem típica de devidamente posicionado pin 24 horas após a cirurgia.
- Coloque um mouse na câmara de indução do sistema de anestesia e set a saída de 2 L min -1 de O 2 e a concentração de isoflurano a 3% (v / v).
- Verifique se o mouse está inconsciente dentro de 1 min; elevar a concentração de 4% (v / v), se necessário. Remover o mouse, coloque no campo estéril com a almofada de aquecimento posicionado abaixo e aplicar o cone do nariz. Transferência de fluir para o cone, e reduzir o isoflurano a 2,5%, aguarde mais 20 seg, e teste para plano cirúrgico adequado, de acordo com a política institucional. Normalmente, a falta de um reflexo dos membros posteriores quando pressiona suavemente é adequado para a determinação anestesia adequada.
- Durante todo o processo, tem um monitor assistente de uma forte respiração regular e coloração rosa das extremidades e região boca para assegurar um nível adequado de oxigenação enquanto inconsciente. Ajuste anestesia, de acordo com a orientação da política veterinária e institucional, se necessário. Aplicar estéril lágrimas artificiais unguento lubrificante (15% (v) v óleo / mineral, 83% v / v) wh (petrolato ite) para os olhos.
- Vire o mouse em um lado com a traseira de membros virada para cima em uma nova cortina descartável. Se necessário, retire a pele com um barbeador elétrico ou creme de depilação. Esfregue o local com solução salina estéril e retire a cortina adicional com o excesso de pele. Coloque uma nova cortina fenestrated sobre o mouse de forma a cobrir todas as partes, mas a toda a região posterior do membro (Figura 4A), mas manter a vista da face e da pata para monitorar coloração e respiração.
- Localize as extremidades proximais e distais do fêmur e da incisão na pele por 5-10 mm ao longo do eixo longitudinal (Figura 4B). Separa-se a camada de pele da fáscia com um bisturi # 15, expondo uma abordagem lateral ao fémur através do bíceps femoral e vasto lateral. Localizar onde o septos de satisfazer ambos os músculos (que é uma linha de tecido branco contra a coloração rosa do músculo). Com um bisturi, com cuidado dissecar ao longo da fronteira até intermuscularo fémur é visível (Figura 4B).
- Desenvolver a incisão com um elevador periosteal romba de modo a expor a totalidade da diáfise (Figura 4C). Use o elevador para expor ainda mais os dois terços centrais do fêmur e tomando cuidado para preservar o feixe neurovascular posterior do lado medial (Figura 4D). Raspe suavemente tecidos moles fora do osso com um bisturi, e seque com um Q-tip estéril ou equivalente.
- Localize o centro do fêmur com calipers se necessário, e marca com um bisturi estéril ou marcador, em seguida, marcar 1,5 milímetros proximal e distal do centro. Gentilmente segure o fêmur usando um par de fórceps nariz-finas previamente formado no estilo Kern para evitar a pressão excessiva sobre o osso.
NOTA: As dimensões exatas para as modificações são fornecidos na Figura 3B. É aconselhável para testar a pinça sobre um espécime sacrificados antes da utilização para assegurar o osso não irão quebrar sob pressão requeremd para imobilização durante o corte. - Usando uma broca bem equipado com uma roda de corte fino revestido de diamante-grit (diâmetro x 0,1 mm de largura 8 mm), fazer o primeiro corte com o elevador no local para proteger o tecido abaixo (Figura 4E). Aumentar o fêmur corte para 45 °, enquanto segurando firmemente a extremidade da diáfise, fazer o segundo corte, remoção de um segmento de 3 mm.
NOTA: A proteção Rosto é recomendada nesta fase. - Com o osso imobilizada por meio de fórceps, resma cuidadosamente as cavidades medulares de cada extremidade com uma agulha hipodérmica 23 G romba. Utilizando um pré-fabricados profundidade de calibre feita a partir de um comprimento de 22 L tubagem colocado em tubos de 19 G (Figura 3A, i MET 8), avaliar a profundidade da cavidade medular fresado e garantir que ele é de 3 mm (Figura 4F-K) . Se a cavidade medular resiste a profundidade de calibre 22 G, resma de novo com uma agulha hipodérmica 22 G romba.
- Com cuidado, insira o pino medular na proximal então distal c medularavities para trazer o fêmur de volta ao seu tamanho original e estabelecer uma estável, de 3 mm de folga (Figura 5A, B). Se necessário, aplicar uma pequena quantidade de tensão manual para atingir um bom encaixe de interferência da haste com o osso cortical do fémur. Certifique-se de que o pino encaixa-se perfeitamente nas cavidades medulares de ambos os lados e as extremidades do osso corte estão alinhadas com o colar. Se existe uma diferença, resma, mais uma vez com uma agulha romba 22 G.
- Mude a posição do músculo e tecido periférico sobre o pino e fechar com uma contínua absorvível 5-0 (Figura 5C). Fechar pele incisão com 5-7 praça nó nylon 5-0 e vedação com adesivo cirúrgico (Figura 5D).
3. Os procedimentos pós-operatórios
- Depois de fechar a incisão na pele, retirar a anestesia, mas permitir O 2 a permanecer fluindo até que o mouse começa a se mover; esta deve levar menos de 1 min. Se o mouse permanece imóvel após 5 min deO 2 a administração, referem-se a políticas institucionais sobre a intervenção veterinária.
- Quando o rato começa a se mover, gentilmente transferi-lo para uma gaiola contendo preferencialmente, roupas de cama autoclavado seco.
- Coloque um ninho tipo iglu em cada gaiola e o mouse vai recuar para ele, reduzindo o movimento. Verifique se o mouse recupera mobilidade hind-limb 5-10 min após a recuperação da consciência.
- Realizar o monitoramento pós-operatório diariamente, de acordo com as políticas institucionais. Fornecer hidratação gelatinizado e comida no chão da gaiola para os primeiros 5-7 dias e administrar analgesia e acompanhamento pós-operatório, de acordo com as políticas institucionalmente aprovados.
NOTA: Nós administrar 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 com 0,25 ml de solução salina por via subcutânea, duas vezes por dia durante os primeiros três dias e, posteriormente, se o mouse não recuperar utilitário normal.
- Após as primeiras 24 horas de recuperação, tocar ao vivo com animais de raios-X de imagem undeanestesia r para visualizar colocação da cavilha (Figura 4E). Se o pino é deslocado, considerar a cirurgia imediata revisão.
- No dia 7 pós-cirurgia, remover suturas sob anestesia e casa em grupos de acordo com as políticas de criação de animais institucional.
- Depois de 2-5 semanas, humanamente eutanásia de animais de acordo com a American Veterinary Medical Association aprovado métodos de eutanásia 25.
NOTA: Uma injeção intraperitoneal de produtos comercialmente disponíveis cocktail barbitúrico combinação eutanásia é eficaz e humana, mas as políticas institucionais locais sobre a eutanásia deve ser seguido. - Dissecar cuidadosamente afastado o hind-limb expondo o fêmur proximal e da pelve do lado medial. Pressione suavemente a articulação para dentro do lado lateral do membro enquanto retirar a cabeça do fêmur do acetábulo (encaixe do quadril) com um bisturi. Corte restante músculo e pele com um bisturi afiado ou micro-tesoura, liberandotoda a pata formar a pélvis. Com um par de fórceps afiada ou tesoura pesados, corte o menor traseira de membros (tíbia / fíbula) aproximadamente 5 mm abaixo da articulação do joelho.
NOTA: Recomenda-se que todas as amostras são armazenadas de forma idêntica antes da análise. - Retire a pele, mas deixe músculo no lugar. Fixar o tecido em 10% de formalina tamponada suplementado com 10 mM de CaCl2 fixador durante 1 semana, seguidas por armazenamento em solução salina tamponada com fosfato suplementada com 10 mM de CaCl2 até 1 mês antes da imagiologia. Realizam a fixação e armazenamento a 4 ° C. Alternativamente, digitalizar espécimes imediatamente, sem fixação.
4. Análise de amostras
NOTA: a cicatrização do osso pode ser avaliada por uma grande variedade de metodologias que estão fora do âmbito deste protocolo. O seguinte é um método que nós empregamos com sucesso usando um gerador de imagens espécime microCT (μCT). Recomenda-se que os seguintes parâmetros de are testado inicialmente, em seguida, otimizado para as necessidades específicas do projeto.
- Enrole espécime em uma fina camada de filme plástico de vedação e posicioná-lo verticalmente na câmara de instrumento. Certifique-se de que o fêmur é perpendicular ao palco amostra durante todo o exame. Defina a varredura com os seguintes parâmetros; Tensão = 29 kV, corrente = 661 mA, energia = 19 W, tamanho do pixel da imagem (mm) = 21,00; Rotação de 360 graus = yes; quadro de média = on (5); etapa de rotação (deg) = 1,00, movimento aleatório = on. Salve as imagens como arquivos JPEG em uma pasta de destino único por scan (eg Figura 6A).
NOTA: A verificação deve ser concluída em 57 min. - Utilizar o software de reconstrução para gerar imagens axiais com base nos seguintes parâmetros; suavização = on (4), a compensação de desalinhamento = on, redução anel artefato = on (5), a correção de endurecimento do feixe (40%), a rotação CS (deg) = 0,00. Definir a saída 2,000-15,000 unidades Hounsfield. Salve as imagens como arquivos JPEGem uma pasta de destino único por digitalização.
- Usando as imagens axiais e software analítico, definir a região de interesse (ROI) definindo primeiro bordas proximal e distal do defeito original. Conseguir isso selecionando as seções que abrangem apenas o colarinho. Como o colar é mais espessa do que a cavilha medular, estas secções são facilmente definidos (Figura 6B, esquerda). Excluir o colar a partir de cálculos por desenhar uma zona de exclusão em torno dela (com uma margem de 100 mm) e transferência de zona a cada uma das seções do ROI (Figura 6B, à direita).
NOTA: momentos de inércia polar, reconstruções 3D e cálculos, tais como o volume de osso novo (Figura 6C, D) pode ser facilmente alcançado utilizando o software.
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Representative Results
Ratos normalmente recuperar a consciência e traseiras-limb mobilidade 5-10 minutos após a retirada da anestesia. Durante os primeiros 5 dias, é aconselhável para abrigar os ratinhos individualmente e introduzir enriquecimento ambiental para evitar a utilização excessiva do membro. Para o efeito, do tipo iglu ninhos reduzir a necessidade de construção de ninhos e incentivar repouso. Observamos, também, que o fornecimento de alimentos e hidrogel no chão da gaiola reduz a probabilidade de pin deslocamento. Durante o período de 5 dias, a analgesia deve ser administrado conforme necessário, de acordo com as políticas institucionalmente aprovados. A perda de peso até aproximadamente 15% do peso pré-operatória inicial é possível, durante o período pós-operatório de 5 dias. Vinte e quatro horas após a cirurgia, raios-X do membro afetado são recomendados para avaliar pin-colocação. Os pinos devem ser completamente inseridas nas proximais e distais canais medulares com as bordas do defeito nivelada contra a gola (Figura 2C,2E, a figura 5E, e Figura 6A). Em casos raros (<5% dos casos), os pinos podem tornar-se deslocado em estágios iniciais de protocolos de uso de cura e animais devem prever a cirurgia de revisão, se isso ocorrer. Embora seja tecnicamente desafiador para quantificar o movimento de torção em fêmures murino, palpação manual dos espécimes confirmou que o movimento de torção e longitudinal é marginal após 7 dias como o tecido conjuntivo se acumula ao redor do pino. Após 5 dias de acompanhamento pós-operatório, os ratos podem ser devolvidos à habitação comunal padrão como por políticas institucionalmente aprovados.
Sem intervenção terapêutica, as bordas do defeito tipicamente estender 0,5 milímetros durante 21 dias, mas em casos raros, o crescimento de osso novo pode ser de até 1 mm (Figura 6A). Detenções crescimento ósseo após este período como os estágios inflamatórios e anabolizantes de cessar regeneração resultando em um defeito de não-união. Após 14-21 dias de cura, o volume of de novo osso pode ser prontamente determinada a partir de imagens geradas por varrimento axiais μCT. Usando o varrimento, os procedimentos de selecção e de reconstrução ROI axiais descritos no protocolo, o volume de osso novo aumenta com o tempo gerada, mas geralmente não excede um total de 1 mm3, na ausência de intervenção terapêutica (Figura 6C) em comparação com 6- 7 milímetros 3 em uma região anatomicamente equivalente de fêmur ileso. Embora o teste biomecânico convencional é tecnicamente difícil, devido ao tamanho da amostra e da natureza do método de fixação, o momento de inércia polar (PMI), uma estimativa da capacidade de um material para resistir à torção com base na área da secção transversal e a densidade, tem sido mostrado para representar uma estimativa apropriado de resistência em ossos longos 26,27. Usando este método, axiais secções transversais em diferentes distâncias das bordas da lesão pode ser seleccionado para análise. Após 21 dias, o PMI de osso de novo 0,25 milímetros from a lesão arestas varia de entre 0,05-0,35 mm em comparação com 4 0,02-0,08 mm 4 no centro da lesão confirmando ainda mais a presença de não união, em casos não tratados (Figura 6D). O PMI de fémur não lesionado num local anatomicamente equivalente varia tipicamente entre 0,5-0,7 mm 4 utilizando as condições descritas aqui.
Figura 6: Os resultados típicos. Scans (A) de raios-X de fêmures no dia 7, 14 e 21 de pós-cirurgia demonstrando ingrowth limitado de osso Painel B:. Representação esquemática dos parâmetros de ROI para a medição volumétrica óssea. Secção transversal axial representativas com uma zona de exclusão (EX) sobre o pino de colarinho incluindo uma margem de 100 um para excluir a medição de artefactos na interface metal-tecido (esquerda). Cintilografia óssea completa (right, parte superior), demonstrando a ROI longitudinal definida pelas secções de osso entre as extremidades do colar com o tecido ósseo original é excluído (EX). As bordas da lesão originais estão localizados nas secções axiais, utilizando a diferença entre o diâmetro da cavilha e da gola (direita, em baixo). (C) medições volumétricas típicas ao dia 7, 14 e 21 após a cirurgia sem intervenção terapêutica (com meios desvios-padrão, n = 3). (D) medições do PMI em cortes axiais 0,25 milímetros a partir das bordas proximais e de lesão distal e do ponto médio (médias, desvios padrão, n = 3). (manchadas de trichrome E) de Masson parafina-embedded seção (à esquerda) corte no sentido longitudinal demonstrando excrescência óssea constituído por cartilagem (ca) e osso esponjoso (b) (barra de escala = 0,5 mm). A posição do campo está indicada na verificação de raios-X (para a direita). (F) não-decalcified, metacrilato de metila secção coronal incorporado de defeito de um dia de idade coradas com HE (escala bar = 1,0 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A descalcificação dos tecidos normalmente leva 10-14 dias, utilizando condições convencionais, e é facilmente monitorado por varrimento de raios-X. É aconselhável manter alguma musculatura nos espécimes durante a descalcificação para melhorar a estabilidade durante o manuseio. Após descalcificação, pinos podem ser cuidadosamente removida com um bisturi afiado permitindo inclusão em parafina e histologia. Trichrome coloração de cortes longitudinais de Masson permite a visualização de excrescência óssea endocondral com um bordo de ataque da cartilagem (ca), seguido de osso esponjoso (cb) (Figura 6E). Enquanto alguns danos ocorrerão inevitavelmente durante a dissecção, a estrutura histológica de ossoe do tecido conjuntivo permanece claro se o pino é removido com cuidado. Alternativamente, metil metacrilato e corte de secções não desmineralizados pode ser realizada com o pino no lugar (Figura 6F).
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Discussion
Relata-se um método simples para gerar um defeito crítico porte estabilizado pinos do fêmur murino usando padrão de laboratório e equipamentos veterinários. Enquanto a montagem dos pinos e do próprio procedimento cirúrgico requer prática, é bem dentro das capacidades de um cientista de pesquisa biomédica bem treinado ou veterinário.
O pino é posicionado no canal medular, sem fixação adicional, tornando o procedimento tecnicamente mais viável do que as abordagens mais complicados que empregam fixadores externos ou parafusos de bloqueio. Enquanto algum movimento de torção pode ocorrer durante as fases iniciais da cicatrização, este é minimizado pela atenção cuidadosa para o diâmetro do pino e a fresagem adequada do canal medular, de modo a atingir um encaixe firme de interferência entre o implante e endósteo. Com cuidadosa seleção de tensão pura e harmonização da idade e sexo, o ajuste torna-se reprodutível robusto dentro de alguns dias. No entanto, with o advento das técnicas de impressão 3D, espera-se que o movimento de torção pode ser ainda mais reduzido por versões mais sofisticadas do pino que incorporar superfícies rugosas e / ou locais de fixação farpado. A facilidade de fabricação pino e a disponibilidade de uma grande variedade de tamanhos de tubos hipodérmicas também permitir a optimização da técnica para virtualmente qualquer ratinhos consanguíneos adulto, independentemente de fenótipo natural, ou experimental osso.
O desenho do colarinho pino original serve duas finalidades: (i) para prevenir o estreitamento aberrante do defeito e danos das extremidades do osso por meio de deslizamento longitudinal, e (ii) para proporcionar pontos de referência que definem as extremidades originais do defeito. Como tal, volumétricas e PMI medições podem ser feitas facilmente utilizando um scanner μCT espécime tal como uma Skyscan 1174. De facto, esta abordagem permite um nível de quantificação, que não é facilmente obtidos com técnicas de fracturas de tamanho não críticas padrão que exibem frequentemente variável ou poolesões rly definido. Enquanto uma unidade μCT é preferível para a quantificação de cura, a avaliação por uma avaliação objectiva de imagens de raios-X ortogonais ou técnicas de análise de imagem em 2D podem representar alternativas viáveis. Devido ao seu conteúdo mineral tamanho pequeno e relativamente baixa, membros murino podem ser facilmente preparados para histologia e montado como peças inteiras para histomorfometria convencional. Isso descarta questões de amostragem frequentemente enfrentados pelos pesquisadores que realizam histomorfométrica de grandes fraturas animais.
Nas experiências aqui descritas, o tempo de cura foi relativamente curto em 3 semanas, o que corresponde à fase rápida, anabólico da cicatrização óssea. A partir daí, a remodelação óssea é um processo muito lento 28. Geralmente, se ponte não é observada após 4 semanas, é improvável que ocorra e de acordo cura, observa-se muito pouco o crescimento ósseo adicional após 4 semanas neste sistema. Além disso, uma lacuna três milímetros de satisfazer os critérios de Key et uml. 16 para um defeito de tamanho crítico e Garcia et al. demonstraram que uma lacuna tão estreito como 1,8 milímetros não é suficiente para curar após 10 semanas e esta poderia ser adiada para 15 semanas com pericôndrio despojado 23.
Enquanto o tamanho e fragilidade dos ossos apresentam sérias dificuldades técnicas para a investigação ortopédica, a utilização de ratinhos é vantajoso em muitas maneiras. Por exemplo, há uma variedade de estirpes comprometida-imunes que permitem o teste de células humanas e as proteínas, sem receio de rejeição imunológica, e seu pequeno tamanho reduz a necessidade de quantidades excessivas de materiais valiosos experimentais, células ou compostos. Isto é exemplificado pelo nosso estudo recente que demonstra a eficácia de células estaminais humanas adultas e as suas proteínas extracelulares para osteoregeneration 29. A vida útil relativamente curta de camundongos também apresentam a oportunidade para a investigação sobre o envelhecimento 30 e da grande variedade de linhagens puras peRMIT o estudo do genótipo global sobre a cura 31. Há também um certo número de modelos de doenças que são facilmente estabelecido em ratinhos, tais como diabetes e osteoporose 32,33. De nota importante é a disponibilidade de muitas ratinhos transgénicos que podem ser utilizados com esta técnica para promover nossa compreensão da fisiologia do osso de regeneração sob condições de trauma extremo.
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Acknowledgments
Agradecemos a equipe e veterinários no Scott & White Hospital Department of Comparative Medicine, Temple, Texas, para os seus conselhos e ajuda inestimável durante o desenvolvimento desta técnica. Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto para a medicina regenerativa fundos do programa, Scott & White RGP concessão # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Agradecemos ao Dr. Suzanne Zeitouni para provas do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
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