A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup> -</sup> Canais e Transportadores
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
Nas últimas duas décadas, a capacidade para sobre-expressar e purificar proteínas transportadoras de membrana aumentou dramaticamente: canais de iões, os transportadores principal e secundário são rotineiramente purificado a partir de sistemas de expressão heterólogos, bem como as fontes naturais. Novas abordagens para monitorar expressão, melhorar e facilitar a extração e melhoram a estabilidade dessas proteínas estão sendo constantemente desenvolvidos 1-5. Estes avanços tecnológicos têm sido fundamentais para desencadear a explosão de informações estruturais em nível atômico em proteínas de membrana, que, por sua vez, reforçada a nossa compreensão das bases estruturais da sua função. Em contraste, a nossa capacidade para sondar as propriedades funcionais das proteínas purificadas não aumentaram com a mesma velocidade, de modo que, em alguns casos, a informação estrutural de alta resolução é acompanhada pelos dados funcionais qualitativos, limitando assim a capacidade de testar quantitativamente previsões baseadas em estrutura. Assim, o desenvot de ensaios funcionais quantitativos e generalizáveis é um passo fundamental para a elucidação das bases mecanicistas da função da proteína de membrana.
Descrevemos aqui um ensaio de efluxo que pode ser utilizado para determinar quantitativamente as propriedades funcionais da purificados e reconstituídos Cl – canais e transportadores. Os princípios subjacentes a ensaio pode ser generalizada para uma variedade de sistemas de transporte, bem como para o transporte de proteínas não-iônicos. Os lipossomas são reconstituídos com purificados Cl – / canal transportadores, na presença de um grande gradiente de Cl – (Figura 1A, B). Cl – efluxo é iniciada pela adição de um ionóforo para permitir fluxo de contra-ião, no nosso caso, o K + ionóforo valinomicina, que desviam a tensão estabelecida pela Cl – gradiente e definir o potencial de membrana inicial do potencial de equilíbrio de K + 6,7. Sem tele não ionóforo Cl líquido significativo – efluxo ocorre, uma vez que é impedida pela geração de um potencial transmembranar. Os dados são descritos quantitativamente por dois parâmetros mensuráveis (Figura 1C): τ, a constante de tempo de efluxo de Cl -, e f 0, a fracção de lipossomas que não contêm uma proteína activa. De τ 0 e f o Cl unitário – a taxa de transporte, a fracção de proteínas activas e a massa molecular do complexo activo pode ser derivado 8. A técnica é ilustrada aqui, usando proteoliposomes reconstituídos com CLC-EC1, um bem caracterizado CLC-tipo H + / Cl – trocador de estrutura e função conhecida. Este ensaio é prontamente generalizado para canais ou transportadores com diferentes selectividade iónica ou cuja actividade depende da presença de tensão e / ou ligantes. Além disso, este ensaio pode ser usado para determinar se as moléculas pequenas afectar directamente a proteína reconstituída,para quantificar os efeitos destes compostos e composição como membrana ou reagentes modificadores de lípidos afectar a função dos canais reconstituídos e transportadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um protocolo detalhado para medir Cl – transporte mediado pelos canais de ânion seletivo purificadas ou transportadores reconstituídos em lipossomas. O exemplo utilizado foi o procariotas H + / Cl – Trocador CLC-EC1. No entanto, a metodologia pode ser facilmente adaptada para estudar canais fechados por ligandos 12,13,15, 11,12 tensão, ou que ostentam diferente selectividade aniónico 15,16 substituindo o Ag: AgCl com um adequado para o ião sob …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
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