Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-></sup> ערוצים ומסועים
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
בשני עשורים האחרונים את יכולת ביטוי יתר ולטהר חלבוני קרום תחבורה גדלה באופן דרמטי: תעלות יונים, מובילים ראשיים ומשניים כעת מטוהרים באופן שיגרתי ממערכות ביטוי Heterologous כמו גם מקורות טבעיים. גישות חדשות כדי לפקח על ביטוי, לשפר ולהקל על החילוץ ולשפר את היציבות של חלבונים אלו נמצאות בעיצומה פיתחו 1-5. פריצות דרך טכנולוגיות אלה כבר סייעו במפעילים הפיצוץ של מידע מבני ברמה האטומית על חלבוני קרום ש, בתורו, העמיקו את ההבנה של הבסיסים המבניים של תפקידם שלנו. בניגוד לכך, היכולת שלנו לחקור את התכונות פונקציונליות של החלבונים המטוהרים לא גדלה באותו קצב, כך שבמקרים מסוימים מידע מבני ברזולוציה גבוהה מלווה בנתונים פונקציונליים איכותיים, הגבלת היכולת שלנו לבדוק כמותית תחזיות המבוסס על מבנה וכך. לפיכך, development של מבחני פונקציונליים כמותי ולהכליל הוא צעד מפתח כלפי הבהרת היסודות מכניסטית של תפקוד חלבון קרום.
כאן אנו מתארים assay זרימה שיכול לשמש כדי לקבוע כמותית תכונות פעילות מרכזית של Cl מטוהר ומחדש – ערוצים ומובילים. העקרונות שבבסיס assay ניתן להכליל את מגוון רחב של מערכות תחבורה, כמו גם לחלבוני הובלת יון שאינו. ליפוזומים מחדש עם Cl מטוהרים – ערוץ / מובילים בנוכחות Cl גדול – שיפוע (איור 1 א ', ב'). Cl – זרימה היא ביוזמת התוספת של ionophore כדי לאפשר לשטף דלפק-יון, במקרה שלנו K + ionophore valinomycin, אשר לדחוק את המתח שהוקם על ידי Cl – השיפוע ולהגדיר את פוטנציאל הקרום הראשוני לפוטנציאל שיווי המשקל של K + 6,7. ללא tהוא ionophore לא Cl נטו משמעותי – בזרימת מתרחשת, כפי שהוא מונע על ידי הדור של פוטנציאל הטרנסממברני. הנתונים מתואר כמותית על ידי שני פרמטרים הניתנים למדידה (איור 1 ג): τ, מתמיד של Cl זמן – בזרימת, וf 0, את החלק היחסי של יפוזומים לא מכילים חלבון פעיל. מτ וf 0 Cl יחידתי – שיעור תחבורה, את החלק היחסי של חלבונים פעילים והמסה המולקולרית של המתחם הפעיל ניתן לגזור 8. הטכניקה מודגמת כאן על ידי שימוש proteoliposomes מחדש עם CLC-ec1, H CLC-סוג מאופיין היטב + / Cl – מחליף של מבנה ותפקוד ידועים. assay זה להכליל בקלות לערוצים או מובילים עם הסלקטיביות יונית שונה או שפעילותם תלויה בנוכחות של מתח ו / או ligands. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי לקבוע אם מולקולות קטנות משפיעות ישירות על החלבון מחדש,כדי לכמת את ההשפעות של תרכובות וכיצד הרכב קרום או חומרים כימיים המשנה את שומנים בדם משפיעים על התפקוד של הערוצים ומובילים מחדש אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו תיארנו פרוטוקול מפורט למדידת Cl – תחבורה בתיווכו של ערוצי אניון סלקטיבי מטוהרים או מובילים מחדש ביפוזומים. הדוגמא בה השתמשה הייתה H + / Cl פרוקריוטים – מחליף CLC-ec1. עם זאת, מתודולוגיה ניתן להתאים בקלות ללמוד ערוצים מגודר על ידי ligands 12,13,15, מתח <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol, ., J, R., MacKinnon, Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
