Proteoliposome-Based Efflux Анализ для определения одиночных молекул Свойства Cl<sup> -</sup> Каналы и перевозчиков
Summary
Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.
Abstract
The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl– channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl– from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl– exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl– conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.
Introduction
В последние два десятилетия способность сверхэкспрессировать и очистить мембранные транспортные белки, резко возросло: ионных каналов, первичные и вторичные транспортеры настоящее время регулярно очищается от гетерологичных системах экспрессии, а также природных источников. Новые подходы к мониторингу выражение, улучшить и облегчить добычу и повышают устойчивость этих белков постоянно разрабатываются 1-5. Эти технологические прорывы сыграли важную роль в инициировании взрыва структурной информации атомного уровня на мембранных белков, которые, в свою очередь, усилили нашу понимания структурных основ их функции. В отличие от этого, наша способность исследовать функциональные свойства очищенных белков не увеличится с той же скоростью, так что в некоторых случаях структурная информация высокого разрешения сопровождается качественными функциональных данных, тем самым ограничивая нашу способность количественно тестовой структуры на основе прогнозов. Таким образом, РАЗРАБОТКАт количественных и обобщению функциональных анализов является важным шагом на пути к выяснению механистических основ функции мембранных белков.
Здесь мы описываем оттока анализа, который может использоваться для количественного определения ключевых функциональные свойства очищенной и восстановленных Cl – каналов и транспортеров. Принципы, лежащие в основе анализа могут быть обобщены на различных транспортных систем, а также лицам, не являющимся ионно-транспортировки белков. Липосомы восстанавливали с очищенными Cl – канал / Транспортировка в присутствии большого Cl – градиента (рис 1а, б). Cl – истечение инициируется добавлением ионофора, чтобы обеспечить поток контр-ионов, в нашем случае К + ионофор валиномицина, которые шунта напряжение, установленную Cl – градиент и установить начальный мембранный потенциал к равновесному потенциалу К + 6,7. Без тон не ионофором никакого существенного чистый Cl – истечение происходит, как это предотвратить генерации трансмембранного потенциала. Данные количественно описывается двумя измеряемых параметров (Рисунок 1С): τ, постоянная времени Cl – истечение, и F 0, фракции липосом, не содержащих активный белок. С τ и F 0 унитарное Cl – транспорт скоростью, доля активных белков и молекулярная масса активного комплекса может быть получена 8. Способ показан здесь с помощью Протеолипосомы восстановленные с CLC-EC1, хорошо охарактеризованной CLC-типа Н + / Cl – теплообменник известной структуры и функции. Этот анализ легко обобщается на каналы или транспортеры с разной ионной избирательности и чья деятельность зависит от наличия напряжения и / или лигандов. Кроме того, этот анализ может быть использован, чтобы определить, является ли малые молекулы, непосредственно влияет на восстановленный белок,Для количественной оценки влияния этих соединений и, как состав мембраны или липидные модификации реагенты влияют на функцию восстановленных каналов и транспортеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали подробный протокол для измерения Cl – транспорт, опосредованный очищенных анион-селективным каналов или перевозчиков восстановленных в липосомы. Пример был использован прокариотической H + / Cl – теплообменник CLC-EC1. Тем не менее, методика может быть легко адап?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM085232 and an Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (to A.A.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol, ., J, R., MacKinnon, Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
